CN109239037B - 基于MOFs作为能量受体的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于MOFs作为能量受体的生物传感器及其制备方法和应用，所述生物传感器包括：第一适配体结合的上转换发光材料和第一适配体互补链结合的MOFs，所述MOFs为荧光共振能量转移的能量受体，所述上转换发光材料为荧光共振能量转移的能量供体，所述MOFs通过所述第一适配体与所述第一适配体互补链杂交互补配对与所述上转换发光材料连接以构建成生物传感器。上述生物传感器能够特异性识别目标物，检测目标物时，具有快速检测、高灵敏度的优点。

Description

基于MOFs作为能量受体的生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物传感器领域，更具体地，涉及一种基于MOFs作为能量受体的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
荧光共振能量转移(FRET)：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生FRET；随着距离延长，FRET呈显著减弱。现有的能量受体主要有金/银纳米粒子和机染料。当有机染料如苯乙烯基喹啉(styrylquinoline)作为能量受体时，有机染料的等离子共振吸收峰在紫外区，难以与能量供体发射谱重合；金/银纳米粒子等贵金属纳米材料，价格昂贵，且等离子共振吸收峰主要依靠形貌和粒径调节，但是调控范围小。
发明内容
针对背景技术中的能量供体和能量受体能量吸收区域难以一致，无法实现准确快速检测，提供了一种采用MOFs为能量受体构建的荧光工作能量转移生物传感器检测目标物方法。MOFs材料可以改变中心金属种类和材料的结构，从而调节MOFs材料的紫外吸收峰的出峰波长，使MOFs材料的紫外吸收峰波长和上转换发光纳米材料(UCNPs)的发射光出峰波长一致，从而构建荧光共振能量转移生物传感器，实现定量检测目标物的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于MOFs作为能量受体的生物传感器，所述生物传感器包括：第一适配体结合的上转换发光材料和第一适配体互补链结合的MOFs，所述MOFs为荧光共振能量转移的能量受体，所述上转换发光材料为荧光共振能量转移的能量供体，所述MOFs通过所述第一适配体与所述第一适配体互补链杂交互补配对与所述上转换发光材料连接以构建成生物传感器。
在其中一个实施例中，所述第一适配体的序列如SEQ ID NO:1所示，第一适配体互补链的序列如SEQ ID NO:2所示。
在其中一个实施例中，所述第一适配体用于特异性结合镉离子。
所述第一适配体的序列如SEQ ID NO:3所示，第一适配体互补链的序列如SEQ IDNO:4所示。
在其中一个实施例中，所述第一适配体用于特异性识别双酚A。
在其中一个实施例中，所述上转换发光材料为NaYF4:Yb0.2，Er0.02。
本发明还提供了一种基于MOFs作为能量受体的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
通过配体交换法将丙烯酸树脂与上转换发光材料结合，再通过偶联剂将第一适配体与丙烯酸树脂反应，得到第一适配体修饰的上转换发光材料；
通过偶联剂将第一适配体互补链与MOFs结合，得到第一适配体互补链修饰的MOFs；
将第一适配体修饰的上转换发光材料与第一适配体互补链修饰的MOFs加入到SDS溶液中，反应1h-4h，得到基于MOFs作为能量受体的生物传感器。
在其中一个实施例中，所述第一适配体的序列如SEQ ID NO:1所示，第一适配体互补链的序列如SEQ ID NO:2所示。
在其中一个实施例中，所述第一适配体用于特异性结合镉离子。
所述第一适配体的序列如SEQ ID NO:3所示，第一适配体互补链的序列如SEQ IDNO:4所示。
在其中一个实施例中，所述第一适配体用于特异性识别双酚A。
在其中一个实施例中，所述配体交换法的步骤包括：量取10mL的丙烯酸树脂分散于乙醇溶液形成混合液A，5mL油酸修饰的上转换发光材料分散于有机溶剂中形成混合液B，将所述混合液A与所述混合液B混合，搅拌8-12h；在用乙醇清洗3次，获得丙烯酸树脂修饰的上转换发光材料。
在其中一个实施例中，所述偶联剂为sulfo-NHS和EDC。
在其中一个实施例中，所述在通过偶联剂将第一适配体与丙烯酸树脂反应的步骤包括：取丙烯酸树脂修饰的上转换发光材料超声分散于缓冲液中，在加入100μL 200Mm EDC和100μL 100mM sulfo-NHS溶液，37℃摇床中活化2h；然后在加入第一适配体，37℃摇床中孵育12h，离心，缓冲液清洗3次，获得第一适配体修饰的上转换发光材料。
在其中一个实施例中，所述通过偶联剂将第一适配体互补链与MOFs结合步骤包括：取MOFs超声分散于超纯水中，在加入100μL200Mm EDC和100μL 100mM sulfo-NHS溶液，37℃摇床中活化2h；然后在加入第一适配体互补链，37℃摇床中孵育12h，离心，超纯水清洗3次，获得第一适配体互补链修饰的MOFs。
本发明提供了一种基于MOFs作为能量受体的生物传感器在重金属或有机物检测分析中的应用。
在其中一个实施例中，所述生物传感器用于检测镉离子或双酚A。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1)能量供体和能量受体能量吸收区域一致：MOFs材料可以改变中心金属种类和材料的结构，从而可以调节MOFs材料的紫外吸收峰的出峰波长，使MOFs材料的紫外吸收峰波长和UCNPs材料的发射光出峰波长一致。具体检测原理见附图1。
2)特异性识别：以核酸适配体作为识别分子，核酸适配体能够对目标物进行高特异性结合。上转换荧光纳米探针为荧光共振能量转移的能量供体，结合作为能量受体的纳米金属有机框架材料，建立基于荧光共振能量转移的纳米探针对食品危害目标物的检测平台。
3)快速检测、灵敏度高：MOFs利用其高孔隙率和大比表面积吸附DNA互补链，核酸适配体对目标物的高特异性结合，基于荧光检测时，信号显著增强。实现了该生物传感器对食品危害因子的高灵敏性检测，同时建立了不同浓度的目标检测物与荧光信号值之间的线性关系，从而建立新型的快速检测方法。
附图说明
图1为能量供体UCNPs的发射光谱图和能量受体MOFs紫外吸收峰谱图的能量吸收区域图；
图2为基于UCNPs和MOFs的荧光共振能量转移模式检测重金属镉离子的原理图。
图3为MOFs-UCNPs检测镉离子的标准曲线；
图4为MOFs-UCNPs检测双酚A的标准曲线；
图5中(a)、(b)、(c)、(d)和(e)分别为UCNPs、UCNPs-DNA1、MOFs、MOFs-DNA2和UCNPs-MOFs电镜图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
上转换发光，即:反-斯托克斯发光(Anti-Stokes)，由斯托克斯定律而来。斯托克斯定律中的材料只能受到高能量的光激发，发出低能量的光，即波长短、频率高的光激发出波长长、频率低的光。比如紫外光激发发出可见光，或者蓝光激发出黄色光，或者可见光激发出红外线。但是科学人员发现，有些材料可以实现与上述定律正好相反的发光效果，即为反斯托克斯发光，又称上转换发光。本发明利用上转换发光纳米材料作为能量供体，与作为能量受体的MOFs材料构建成荧光共振能量转移的生物传感器。
金属-有机框架(Metal-Organic Frameworks)，简称MOFs，是由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料。
实施例1
1)上转换荧光纳米材料的制备：
a)称取YCl3·6H2O 0.236g、YbCl3·6H2O 0.077g、ErCl3·6H2O 0.007g(Ln：78％Y3 +、20％Yb3+、2％Er3+共计1mmol)加入到100mL三颈烧瓶中，加4mL油酸(OA)和15mL十八烯(ODE)，1500r/min磁力搅拌，同时逐渐升温至130℃，氮气保护以除去其中的水蒸气，进一步升温至160℃，至混合物形成均一溶液后，自然冷却至室温；称取0.13g NaOH和0.13g NH4F溶于10mL甲醇中，将上述溶液逐滴加入到三颈烧瓶中，磁力搅拌30min，使氯化物充分混合，随后缓慢加热以蒸发甲醇，再逐渐升温至300℃，氮气保护加热1h后，溶液自然冷却，产品用乙醇从溶液中沉淀出来，乙醇/环己烷(v/v＝5:1)清洗三次。
b)上转换荧光纳米材料的表面修饰：
油酸包覆的上转换荧光纳米材料由于油酸分子的烃链起疏水作用，材料在水中的分散性极差，需对该材料表面进行PAA修饰。采用配体交换法制备PAA包裹的上转换荧光纳米材料：10mL PAA分散在乙醇溶液(～1wt％)中，5mL OA-UCNPs分散在氯仿(～1wt％)，然后将上述分散于乙醇溶液的PAA溶液加入到该氯仿中，隔夜搅拌。反应结束后用乙醇清洗三次，最后将上转换荧光纳米材料分散在水中，备用。
2)Fe-MIL-88B-NH2(MOFs)材料的制备：
将0.16g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物充分溶解在13.34mL超纯水中，然后与1.66mL0.4mol/L的FeCl3·6H2O溶液混合。置于搅拌器平面上，以恒定速度匀速搅拌1.0h后，向混合液中加入0.3mL CH3COOH。再次用磁力搅拌器匀速搅拌1.0h至混合均匀，向其中添加60mg 2-氨基对苯二甲酸(H2N-BDC)。最后混合液在磁力搅拌器上匀速搅拌2.0h后，将混合液转移至25mL高压反应釜内胆中，旋紧反应釜外壳，将其置于烘箱内，加热至120℃反应18.0h。
使用乙醇对合成的Fe-MIL-88B-NH2材料离心洗涤3次，再使用超纯水离心洗涤3次，最后复溶于1mL超纯水中保存，备用。Fe3+是Fe-MIL-88B-NH2材料的中心金属离子，配体为H2N-BDC，Pluronic F127以及CH3COOH主要用来控制Fe-MIL-88B-NH2材料的尺寸。
试验例1：检测重金属镉
1)DNA修饰上转换荧光纳米颗粒和纳米金属有机框架材料的制备
称取10mg PAA修饰的NaYF4：Yb0.2，Er0.02UCNPs(PAA-UCNPs)分散在5mL 10mmol/LPBS(pH 7.4)缓冲液中，超声充分分散，加入100μL 200mM EDC和100μL 100mM sulfo-NHS溶液，37℃摇床中活化2h。之后加入一定量的镉离子适配体(DNA1：5′-NH2-ATAGCGTCTCAGGACGACGGGTTCACAGTCCGTTGTC-3′)，在37℃摇床中孵育过夜，离心收集材料，用PBS缓冲液清洗三次，将最后得到的核酸适配体修饰的上转换荧光纳米探针(UCNPs-DNA1)分散在0.01％SDS溶液中，UCNPs-DNA1的浓度为2mg/mL。
称取10mg MOFs分散在5mL超纯水中，超声充分分散，加入100μL 200mM EDC和100μL 100mM sulfo-NHS溶液，37℃摇床中活化2h。之后加入一定量的镉离子适配体互补链(DNA2：5′-COOH-ATAGCGTGACAACGGACTGTGAACCCG-3′)，在37℃摇床中孵育过夜，离心收集材料，用超纯水清洗三次，将最后得到的核酸适配体互补链修饰的金属有机框架纳米探针(MOFs-DNA2)分散在超纯水中，MOFs-DNA2的浓度为1mg/mL。
2)检测体系的构建
取490μL UCNPs-DNA1与500μL MOFs-DNA2，在0.01％SDS溶液中反应1.0h，得到纳米复合物UCNPs-MOFs。反应结束后，在检测体系中加入10μL不同浓度的镉离子标准液，室温下摇床反应3h。将该反应溶液转移至10mm×10mm的检测尺中，在980nm激光发射器照射下利用荧光分光光度计收集荧光信号。
图5中的(a)、(b)所示，PAA@UCNPs和UCNPs-DNA1大部分呈六方晶相，其中少量纳米颗粒为立方晶相，UCNPs的粒径分布范围为80～160nm；有关MOFs的电镜如图5中的(c)、(d)所示，以Fe为中心金属离子、H2N-BDC为配体合成的Fe-MIL-88B-NH2材料呈梭形，宽约为100nm，长约为400nm；DNA链长不足10nm，在电镜下难以观察到。在完整的检测体系中，功能化修饰的UCNPs探针和MOFs基于适配体和互补链的碱基互补配对原则进行杂交反应结合在一起，使两种纳米材料之间的空间距离缩短，从而满足形成荧光共振能量转移的空间距离要求。
如图2所示，PAA@UCNPs和MOFs分别与Cd2+适配体及Cd2+适配体互补链进行功能化修饰；由于PAA@UCNPs表面具有羧基，因此，能够通过共价键作用与修饰有-NH2的适配体(DNA1)结合形成荧光共振能量转移中的能量供体，而Fe-MIL-88B-NH2MOFs表面具有-NH2基团，同样利用化学键作用与修饰有-COOH结合形成一个嵌合体，作为荧光共振能量转移的能量受体。通过DNA的碱基互补配对原则，上转换荧光纳米探针可以和功能化修饰的Fe-MOFs通过DNA1和DNA2的杂交反应组装在一起，缩短两个材料之间的空间位移，形成荧光共振能量转移体系，从而UCNPs的荧光因为发射光子的转移发生淬灭，导致荧光信号减弱。
在检测体系中加入Cd2+后，DNA1与体系中的Cd2+发生特异性结合，同时DNA1的空间结构发生改变，导致DNA1不会与DNA2结合，从而Fe-MOFs不能同UCNPs连接形成荧光共振能量转移，荧光信号发生恢复，并且随着镉离子的浓度的增高，检测体系中荧光信号随之增强，因此通过对荧光检测的荧光强度的分析确定镉离子的浓度，从而实现对Cd2+的定量分析。
如图3所示，以Cd2+浓度的对数为横坐标，543nm波长处对应的荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，结果表明两者间呈完美的线性关系，其线性方程式为：y＝31.998ln(x)+917.32(R2＝0.9959)，该方法的检测范围为10-10g/mL～10-4g/mL，最低检测限为：10pg/mL。
从超市购买的自来水，采用加标法进行原位快速检测。检测过程如上述。作为对比，把待测样品换成加标后的自来水进行检测。检测结果见表1。
表1实际样品的测定
Figure BDA0001814729540000091
本发明利用分散性良好的上转换荧光纳米材料和金属有机框架材料，结合荧光共振能量转移原理，将两种纳米材料功能化修饰后形成能量供受体，共同构建了检测Cd2+的生物传感器。检测结果表明该方法具有良好的线性相关性，且其检测灵敏度得到了有效提高，该生物传感器法的检测限为10-11g/mL(10pg/mL)低于国家标准检测限，可实现现场原位、定量的快速检测。
试验例2：检测双酚A
DNA修饰上转换荧光纳米颗粒和纳米金属有机框架材料的制备：
称取10mg PAA修饰的NaYF4：Yb0.2，Er0.02UCNPs(PAA-UCNPs)分散在5mL 10mmol/LPBS(pH 7.4)缓冲液中，超声充分分散，加入100μL 200mM EDC和100μL 100mM sulfo-NHS溶液，37℃摇床中活化2h。之后加入一定量的双酚A适配体(DNA1：5′-SH-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCC AGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3′)，在37℃摇床中孵育过夜，离心收集材料，用PBS缓冲液清洗三次，将最后得到的核酸适配体修饰的上转换荧光纳米探针(UCNPs-DNA1)分散在0.01％SDS溶液中，UCNPs-DNA1的浓度为2mg/mL。
称取10mg MOFs分散在5mL超纯水中，超声充分分散，加入100μL 200mM EDC和100μL 100mM sulfo-NHS溶液，37℃摇床中活化2h。之后加入一定量的双酚A适配体互补链(DNA2：5′-COOH-CCCACCTGACCACCCACCGG-3′)，在37℃摇床中孵育过夜，离心收集材料，用超纯水清洗三次，将最后得到的核酸适配体互补链修饰的金属有机框架纳米探针(MOFs-DNA2)分散在超纯水中，MOFs-DNA2的浓度为1mg/mL。
检测体系的构建：
取490μL UCNPs-DNA1与500μL MOFs-DNA2，在0.01％SDS溶液中反应1.0h，得到纳米复合物UCNPs-MOFs。反应结束后，在检测体系中加入10μL不同浓度的双酚A标准液，室温下摇床反应3h。将该反应溶液转移至10mm×10mm的检测尺中，在980nm激光发射器照射下利用荧光分光光度计收集荧光信号。
PAA@UCNPs和UCNPs-DNA1大部分呈六方晶相，其中少量纳米颗粒为立方晶相，UCNPs的粒径分布范围为80～160nm；以Fe为中心金属离子、H2N-BDC为配体合成的Fe-MIL-88B-NH2材料呈梭形，宽约为100nm，长约为400nm；DNA链长不足10nm，在电镜下难以观察到。在完整的检测体系中，功能化修饰的UCNPs探针和MOFs基于适配体和互补链的碱基互补配对原则进行杂交反应结合在一起，参见图5中(e)，使两种纳米材料之间的空间距离缩短，从而满足形成荧光共振能量转移的空间距离要求。
首先PAA@UCNPs和MOFs分别与双酚A适配体和双酚A适配体互补链进行功能化修饰；由于PAA@UCNPs表面具有羧基，因此它能够通过共价键作用与修饰有-NH2的适配体(DNA1)结合形成荧光共振能量转移中的能量供体，而Fe-MIL-88B-NH2MOFs表面具有-NH2基团，同样利用化学键作用与修饰有-COOH结合形成一个嵌合体，作为荧光共振能量转移的能量受体。通过DNA的碱基互补配对原则，上转换荧光纳米探针可以和功能化修饰的Fe-MOFs通过DNA1和DNA2的杂交反应组装在一起，缩短两个材料之间的空间位移，形成荧光共振能量转移体系，从而UCNPs的荧光因为发射光子的转移发生淬灭，导致荧光信号减弱。在检测体系中加入双酚A后，DNA1与体系中的双酚A发生特异性结合，同时DNA1的空间结构发生改变，导致DNA1不会与DNA2结合，从而Fe-MOFs不能同UCNPs连接形成荧光共振能量转移，荧光信号发生恢复，并且随着双酚A的浓度的增高，检测体系中荧光信号随之增强，因此通过对荧光检测的荧光强度的分析确定双酚A的浓度，从而实现对双酚A的定量分析。
如图4所示，以BPA浓度的对数为横坐标，543nm波长处对应的荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，结果表明两者间呈完美的线性关系，其线性方程式为：y＝35.064ln(x)+1060.8(R2＝0.9922)，该方法的检测范围为10-10g/mL～10-3g/mL，最低检测限为：0.05ng/mL。
本发明利用分散性良好的上转换荧光纳米材料和金属有机框架材料，结合荧光共振能量转移原理，将两种纳米材料功能化修饰后形成能量供、受体，共同构建了检测双酚A的生物传感器。检测结果表明该方法具有良好的线性相关性，且其检测灵敏度得到了有效提高，该生物传感器法的检测限低于国家标准检测限，可实现现场原位、定量的快速检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种基于MOFs作为能量受体的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括：第一适配体结合的上转换发光材料和第一适配体互补链结合的MOFs，所述MOFs为荧光共振能量转移的能量受体，所述上转换发光材料为荧光共振能量转移的能量供体，所述MOFs通过所述第一适配体与所述第一适配体互补链杂交互补配对与所述上转换发光材料连接以构建成生物传感器。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述第一适配体的序列如SEQ IDNO:1所示，第一适配体互补链的序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述第一适配体的序列如SEQ IDNO:3所示，第一适配体互补链的序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述上转换发光材料为NaYF4:Yb0.2，Er0.02。
5.如权利要求1至4任一项所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
通过配体交换法将丙烯酸树脂与上转换发光材料结合，再通过偶联剂将第一适配体与丙烯酸树脂反应，得到第一适配体修饰的上转换发光材料；
通过偶联剂将第一适配体互补链与MOFs结合，得到第一适配体互补链修饰的MOFs；
将第一适配体修饰的上转换发光材料与第一适配体互补链修饰的MOFs加入到SDS溶液中，反应1h-4h，得到基于MOFs作为能量受体的生物传感器。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述配体交换法的步骤包括：量取10mL的丙烯酸树脂分散于乙醇溶液形成混合液A，5mL油酸修饰的上转换发光材料分散于有机溶剂中形成混合液B，将所述混合液A与所述混合液B混合，搅拌8-12h；在用乙醇清洗3次，获得丙烯酸树脂修饰的上转换发光材料。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述偶联剂为sulfo-NHS和EDC。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述再通过偶联剂将第一适配体与丙烯酸树脂反应的步骤包括：取丙烯酸树脂修饰的上转换发光材料超声分散于缓冲液中，在加入100μL 200Mm EDC和100μL 100mM sulfo-NHS溶液，37℃摇床中活化2h；然后在加入第一适配体，37℃摇床中孵育12h，离心，缓冲液清洗3次，获得第一适配体修饰的上转换发光材料。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述通过偶联剂将第一适配体互补链与MOFs结合步骤包括：取MOFs超声分散于超纯水中，再 加入100μL 200Mm EDC和100μL100mM sulfo-NHS溶液，37℃摇床中活化2h；然后再 加入第一适配体互补链，37℃摇床中孵育12h，离心，超纯水清洗3次，获得第一适配体互补链修饰的MOFs。
10.一种权利要求1所述的基于MOFs作为能量受体的生物传感器在重金属或有机小分子检测分析中的应用。
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