CN112961905B - 一种基于MOFs仿生酶的便携式传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于MOFs仿生酶的便携式传感器及其制备方法和应用，属于食品品质安全检测技术领域；在本发明中，首先合成了一种耐酸碱能力强的MOFs仿生酶，然后构建了基于MOFs仿生酶的便携式传感器，所述便携式传感器克服了传统检测有机磷农药残留的设备体积大、操作繁琐的不足，以及使用便携式血糖仪检测技术中蔗糖转换酶耐酸碱能力差、易失活的缺点，实现对果蔬汁中有机磷农药残留的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于食品品质安全检测技术领域，具体涉及一种基于MOFs仿生酶的便携式传感器及其制备方法和应用。
背景技术
传统检测农药残留技术主要有高效液相色谱法、气相色谱法、液质联用等，这些方法结果可靠，但操作繁琐、设备体积大。随着生物传感技术的发展，电化学、荧光、紫外等技术结合传感器的农药残留快速检测方法开始出现，但是上述方法通常需要使用专门的电信号/光信号转换装置，家庭式应用难以实现。
近年来，便携式家用血糖仪因其体积小、便于操作、方便日常使用等优点，逐步成为居家常备的血糖测定仪器；同时，相关学者利用血糖仪实现了重金属、三聚氰胺等食品中有毒有害物质的检测。但是血糖仪中所用蔗糖转换酶是一种生物酶，存在耐酸碱能力差、提取难度大、易失活等不足，难以用于果蔬汁中有机磷农药残留的灵敏、快速检测。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种基于MOFs仿生酶的便携式传感器及其制备方法和应用。在本发明中，首先合成了一种耐酸碱能力强的MOFs仿生酶，然后构建了基于MOFs仿生酶的便携式传感器，所述便携式传感器克服了传统检测有机磷农药残留的设备体积大、操作繁琐的不足，以及使用便携式血糖仪检测技术中蔗糖转换酶耐酸碱能力差、易失活的缺点，实现对果蔬汁中有机磷农药残留的快速检测。
本发明中首先提供了一种便携式传感器，所述便携式传感器基于MOFs仿生酶构建而成；所述MOFs仿生酶呈现规则的正六面体、大小均一，且其中心呈孔状结构，为介孔材料。
本发明中还提供了上述便携式传感器的制备方法，具体包括如下步骤：
S1. MOFs仿生酶的制备及其功能化：
将硝酸钴六水合物、二甲基咪唑依次分散于甲醇和乙醇混合溶液中，室温下孵育后进行离心、洗涤、干燥，得到MOFs仿生酶；采用柠檬酸还原法制备金纳米粒子，然后将MOFs缓慢加入到AuNPs胶体中；在搅拌条件下反应后，用甲醇清洗除去未反应的杂质；将功能化的MOFs溶于甲醇中形成均匀的分散液；
S2. DNA1-MOFs信号探针的制备：
将DNA1序列加入到功能化MOFs中反应制备DNA1-MOFs信号探针；用氢氧化钠溶液清洗后，将信号探针分散在氢氧化钠溶液中；
S3. 便携式传感器的构建：
在加有DNA2的孔板表面滴加AuNPs胶体培养一定时间，接着将特异识别对硫磷的DNA3序列滴加到孔板上，并加入对硫磷培养一段时间；然后在孔板表面滴加DNA1-MOFs信号探针，培养反应并清洗后，即可获得所述便携式传感器。
进一步的，步骤S1中，所述甲醇和乙醇溶液体积比为1~2.5：0.5~3；所述硝酸钴六水合物用量为0.5~2 mM，二甲基咪唑用量为1~4 mM。
进一步的，步骤S1中，所述孵育的时间为12~48 h。
进一步的，步骤S1中，所述的MOFs用量为2~8 mL，AuNPs用量为6~12 mL。
进一步的，步骤S2中，所述DNA1的序列为5’-SH-(CH2)6ACACCATATTATGAAGAAGCGTCTTGCTCCTACG-3’，其浓度为10~30 μM；所述氢氧化钠溶液pH为11.5~13.5。
进一步的，步骤S3中，所述DNA2的序列为5’-SH-(CH2)6CGTAGGAGCAAGACGCTTCTTCATAATATGGTGT-3’，其浓度为5~20 μM；在孔板表面培养的时间为12~36 h；所述DNA3的序列为5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3’，其浓度为10~25 μM。
进一步的，所述DNA2、AuNPs胶体、DNA3、对硫磷和DNA1-MOFs信号探针的用量相同。
进一步的，步骤S3中，对硫磷在修饰孔板上的培养时间为30~120 min，信号探针在修饰孔板上的培养时间为50~180 min。
本发明中还提供了所述便携式传感器在对硫磷残留的快速检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中所用金属-有机框架材料是金属离子和有机配体通过配位键实现自组并形成多维状结构的复合物，本发明中制备的MOFs仿生酶是中空介孔材料，具有比表面积大、催化活性好、稳定性高等优点，能够高效催化葡萄糖反应生成葡萄糖酸。
本发明中利用对硫磷适配体的高度选择性，并采用DNA1和DNA2的碱基互补配对，在很大程度上提高了对硫磷检测的特异性。便携式血糖仪体积小、易操作、家用性强，且MOFs仿生酶耐酸碱能力强、催化活性高；同时该方法抗干扰能力强、无需样品预处理，且灵敏度高，检出限可达到0.42 nM，能够满足果蔬汁中对硫磷的便携、快速检测。
与现有的血糖仪便携式检测方法相比，本发明使用的MOFs仿生酶具有易于制备、耐酸碱能力强、催化活性高等优点，能够克服常用蔗糖转换酶易失活、提纯难度大等不足。
与电化学、光学等快速方法相比，本发明使用便携式血糖仪获取信号，无需专门的信号转换装置，具有成本低、普适性强、信号获取简单等优势。
附图说明
图1为MOFs仿生酶的扫描电镜图。
图2为MOFs仿生酶的透视电镜图。
图3为MOFs仿生酶的BET图。
图4为MOFs仿生酶在有无葡萄糖存在时CV图。
图5为MOFs仿生酶对不同浓度葡萄糖的催化CV图。
图6为MOFs仿生酶加入葡萄糖前后的颜色变化。
图7为MOFs仿生酶催化葡萄糖反应前后的血糖仪读数。
图8为建立的对硫磷检测标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：
本发明中设计了DNA1、DNA2和DNA3，通过能够特异识别待测物对硫磷的原则设计了DNA3，然后DNA2根据能够固定在孔板上，且应能够与DNA3杂交互补设计而成，DNA1根据能够与DNA2杂交互补，且能结合纳米金设计而成。
S1.MOFs仿生酶的制备及其功能化：
称取1.5 mM的硝酸钴六水合物、2.5 mM的二甲基咪唑分别分散在80 mL甲醇和乙醇的混合溶液中，其中甲醇和乙醇体积比为1：1；在磁力搅拌条件下，室温下孵育24 h，然后通过离心清洗、真空干燥得到MOFs紫色固体；在加热回流条件下，采用柠檬酸还原氯金酸制备AuNPs，然后取5 mL MOFs的甲醇溶液缓慢加入到8 mL AuNPs胶体中，持续搅拌3 h，然后用甲醇清洗3次，并在80℃下真空干燥，得到功能化的MOFs仿生酶MOFs/AuNPs，将其分散在1mL Tris-HCl溶液中，形成均匀MOFs/AuNPs分散液，储存在4℃下备用。
S2. 信号探针的制备：
将20 μM DNA1序列5’-SH-(CH2)6ACACCATATTATGAAGAAGCGTCTTGCTCCTACG-3’（南京金斯瑞生物工程有限公司）加入到1 mL步骤S1的MOFs/AuNPs分散中，反应制备的信号探针；用pH 12氢氧化钠溶液清洗后，将信号探针分散在1 mL氢氧化钠溶液中并于4℃保存。
S3. 便携式传感器的构建：
在加有100 μL 浓度为10 μM DNA2序列的孔板表面滴加100 μL AuNPs胶体培养24h ，所述DNA2序列为5’-SH-(CH2)6CGTAGGAGCAAGACGCTTCTTCATAATATGGTGT-3’（ 南京金斯瑞生物工程有限公司），接着将100 μL15 μM特异识别对硫磷的DNA3序列5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3’（ 南京金斯瑞生物工程有限公司）滴加到孔板上，并加入100 μL对硫磷培养培养60 min后；然后在孔板表面滴加100 μL DNA1-MOFs信号探针，培养反应80 min并清洗，获得所述便携式传感器。
图1和图2为MOFs仿生酶的扫描电镜图和透射电镜图，从图中可以看出是MOFs仿生酶呈现规则的正六面体、大小均一，且其中心呈孔状结构，为介孔材料。图3为MOFs仿生酶的BET图，通过软件计算得到该仿生酶的比表面积为1239 m2·g-1，大的比表面积有利于结合大量的金属活性位点，从而提高材料的催化活性；上述结果证实了MOFs仿生酶已成功合成。
实施例2：
S1.MOFs仿生酶的制备及其功能化：
称取0.5 mM的硝酸钴六水合物、1 mM的二甲基咪唑分别分散在80 mL甲醇和乙醇的混合溶液中（甲醇和乙醇体积比为1.5：2）；在磁力搅拌条件下，室温下孵育12 h，然后通过离心清洗、真空干燥即可得到MOFs紫色固体；在加热回流条件下，采用柠檬酸还原氯金酸制备AuNPs，然后取3 mL MOFs的甲醇溶液缓慢加入到6 mL AuNPs胶体中，持续搅拌3 h，然后用甲醇清洗3次，并在80℃下真空干燥，将功能化MOFs（MOFs/AuNPs）分散在1 mL Tris-HCl溶液中，形成均匀分散液，储存在4℃下备用。
S2.信号探针的制备：
将10 μM DNA1序列5’-SH-(CH2)6ACACCATATTATGAAGAAGCGTCTTGCTCCTACG-3’（南京金斯瑞生物工程有限公司）加入到1 mL步骤S1的MOFs/AuNPs溶液中，反应制备的信号探针；用pH 11.5氢氧化钠溶液清洗后，将信号探针分散在1 mL氢氧化钠溶液中并于4℃保存。
S3. 便携式传感器的构建：
在加有100 μL 浓度为10 μM DNA2的孔板表面滴加100 μL AuNPs胶体培养12 h，所述DNA2序列为5’-SH-(CH2)6CGTAGGAGCAAGACGCTTCTTCATAATATGGTGT-3’（ 南京金斯瑞生物工程有限公司），接着将100 μL 10 μM特异识别对硫磷的DNA3序列5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3’（ 南京金斯瑞生物工程有限公司）滴加到孔板上，并加入100 μL对硫磷培养培养30 min后；然后在孔板表面滴加100 μL DNA1-MOFs信号探针，培养反应50 min并清洗，获得所述便携式传感器。
图4是MOFs仿生酶在有无葡萄糖存在时CV图，从图中可以看出，裸电极在有无葡萄糖时均没有明显的氧化还原峰，且两条CV曲线趋于重合状态；该表明裸电极对葡萄糖不具有催化效果； 而MOFs仿生酶修饰的电极在葡萄糖溶液中进行电化学检测时，在0.10 ~0.30 V有一对较为明显的氧化还原峰，这是由于Co在OH-存在时先从二价变为三价；在0.40~ 0.50 V有一对较为明显的氧化还原峰，这是由于Co在OH-和葡萄糖存在时从三价变为四价，并能催化氧化葡萄糖转化为葡萄糖酸。
图5是MOFs仿生酶对不同浓度葡萄糖的催化CV图，从图中可以看出，MOFs修饰电极在不同浓度葡萄糖溶液中的CV图，从图中可以看出0.40 ~ 0.50 V左右有一对明显的氧化还原峰，且氧化峰随着葡萄糖浓度增加而增加，还原峰随着葡萄糖浓度增加而减小，进一步证实了MOFs仿生酶对葡萄糖的催化活性。
实施例3：
S1.MOFs仿生酶的制备及其功能化：
称取2 mM的硝酸钴六水合物、4 mM的二甲基咪唑分别分散在80 mL甲醇和乙醇的混合溶液中（甲醇和乙醇体积比为2.5：3）；在磁力搅拌条件下，室温下孵育48 h，然后通过离心清洗、真空干燥即可得到MOFs紫色固体；在加热回流条件下，采用柠檬酸还原氯金酸制备AuNPs，然后取8 mL MOFs的甲醇溶液缓慢加入到12 mL AuNPs胶体中，持续搅拌3 h，然后用甲醇清洗3次，并在80℃下真空干燥，将功能化MOFs（MOFs/AuNPs）分散在1 mL Tris-HCl溶液中，形成均匀分散液，储存在4℃下备用。
S2.信号探针的制备：
将30 μM DNA1序列5’-SH-(CH2)6ACACCATATTATGAAGAAGCGTCTTGCTCCTACG-3’（南京金斯瑞生物工程有限公司）加入到1 mL步骤S1的MOFs/AuNPs溶液中，反应制备的信号探针；用pH 13氢氧化钠溶液清洗后，将信号探针分散在1 mL氢氧化钠溶液中并于4℃保存。
S3. 便携式传感器的构建：
在加有100 μL 浓度为20 μM DNA2的孔板表面滴加100 μL AuNPs胶体培养36h，所述DNA2序列为5’-SH-(CH2)6CGTAGGAGCAAGACGCTTCTTCATAATATGGTGT-3’（ 南京金斯瑞生物工程有限公司），接着将100 μL 浓度为15 μM特异识别对硫磷的DNA3序列5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3’（ 南京金斯瑞生物工程有限公司）滴加到孔板上，并加入100 μL对硫磷培养培养2h后；然后在孔板表面滴加100 μL DNA1-MOFs信号探针，培养反应50 min并清洗，获得所述便携式传感器。
图6是MOFs仿生酶加入葡萄糖前后的颜色变化，通过比色法研究MOFs仿生酶对葡萄糖的催化性能。从图中可以看出，MOFs在加入葡萄糖后，离心管由紫色变为暗红色，这是因为Co在OH-存在时先从二价变为三价，后又从三价变为四价，并催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸。结合图7中MOFs仿生酶催化葡萄糖反应前后的血糖仪读数来看，未加入MOFs仿生酶时使用血糖仪的测量结果为H1，其表示溶液中葡萄糖含量大于27.2 mM，当加入MOFs后，使用血糖仪测溶液中的葡萄糖含量减少为17.2 mM，验证了MOFs对葡萄糖具有优良的催化效果。
实施例4：
S1. 标准曲线的建立：
配制一系列浓度分别为0~195 nM的对硫磷标准品溶液，并将其取代制备便携式传感器中添加的对硫磷与便携传感器中的DNA3反应，进而在传感界面结合信号探针；将100 μL 40 mM葡萄糖滴涂于修饰孔板表面，并培养60 min；基于传感界面固定MOFs仿生酶对葡萄糖的催化氧化作用，不同浓度对硫磷会引起不同量葡萄糖转化为葡萄糖酸；取5 μL反应后的葡萄糖溶液滴加在血糖仪贴片上，记录不同浓度对硫磷标准品下的血糖仪读数，并根据对硫磷标准品浓度和血糖仪读数之间关系建立检测对硫磷的标准曲线。
图8为利用便携式血糖仪实现样品中对硫磷含量分析的标准曲线图，从图中可以看出，标准曲线的方程为：y=-0.0395x+18.53 (R2=0.9959)，可见血糖仪读数与对硫磷含量相关关系好，能够准确地检测对硫磷的含量。
S2. 苹果汁中对硫磷的检测：
将100 μL苹果汁加入到便携式传感器中，根据S1中方法检测苹果汁中对硫磷的血糖仪读数，并将其代入获得的标准曲线中，从而计算出苹果汁中对硫磷含量为43.8 nM，由此实现了苹果汁中对硫磷的定量检测。
表1 本发明检测结果与标准方法检测结果的对比
| 样品 | 本检测法（μg/g） | RSD（%） | HPLC（μg/g） | RSD（%） |
| 样品1 | 12.75 | 6.3 | 11.92 | 7.1 |
如表2所示，与标准检测方法对比，本发明所述便携式传感器对苹果汁中对硫磷的检测结果和传统HPLC检测方法检测结果相近，且本发明的检测方法结果相对偏差（RSD（%））较小，说明本检测方法结果波动小，结果稳定且重复性好。
实施例5：
S1. 标准曲线的建立：
配制一系列浓度分别为0~200 nM的对硫磷标准品溶液，并将其取代制备便携式传感器中添加的对硫磷与便携传感器中的DNA3反应，进而在传感界面结合信号探针；将100 μL 40 mM葡萄糖滴涂于修饰孔板表面，并培养60 min；基于传感界面固定MOFs仿生酶对葡萄糖的催化氧化作用，不同浓度对硫磷会引起不同量葡萄糖转化为葡萄糖酸；取5 μL反应后的葡萄糖溶液滴加在血糖仪贴片上，记录不同浓度对硫磷标准品下的血糖仪读数，并根据对硫磷标准品浓度和血糖仪读数之间关系建立检测对硫磷的标准曲线，标准曲线的方程为：y=-0.042x+17.69 (R2=0.9928)。
S2.橙汁中对硫磷的检测：
将100 μL橙汁加入到便携式传感器中，根据S1中方法获得橙汁中对硫磷的血糖仪读数，并将其代入获得的标准曲线中，从而计算出橙汁中对硫磷含量为51.9 nM，由此实现了橙汁中对硫磷的定量检测。
表2 本发明检测结果与标准方法检测结果的对比
| 样品 | 本检测法（μg/g） | RSD（%） | HPLC（μg/g） | RSD（%） |
| 样品1 | 15.11 | 5.89 | 14.85 | 6.27 |
如表2所示，与标准检测方法对比，本发明所述便携式传感器对橙汁中对硫磷的检测结果和传统HPLC检测方法检测结果相近，且本发明的检测方法结果相对偏差较小，可见本检测方法结果波动小，结果稳定且重复性好。
实施例6：
S1. 标准曲线的建立：
配制一系列浓度分别为0~350 nM的对硫磷标准品溶液，并将其取代制备便携式传感器中添加的对硫磷与便携传感器中的DNA3反应，进而在传感界面结合信号探针；将100 μL 40 mM葡萄糖滴涂于修饰孔板表面，并培养60 min；基于传感界面固定MOFs仿生酶对葡萄糖的催化氧化作用，不同浓度对硫磷会引起不同量葡萄糖转化为葡萄糖酸；取5 μL反应后的葡萄糖溶液滴加在血糖仪贴片上，记录不同浓度对硫磷标准品下的血糖仪读数，并根据对硫磷标准品浓度和血糖仪读数之间关系建立检测对硫磷的标准曲线，标准曲线的方程为：y=-0.032x+18.24 (R2=0.9959)。
S2：蔬菜汁中对硫磷的检测
将100 μL蔬菜汁加入加入到便携式传感器中，根据步骤S1获得检测蔬菜汁中对硫磷的血糖仪读数，并将其代入步骤S4获得的标准曲线中，从而计算出蔬菜汁中对硫磷含量Q（Q=（10.7-18.24）/-0.032）为236 nM，由此实现了蔬菜汁中对硫磷的定量检测。
表3本发明检测结果与标准方法检测结果的对比
| 样品 | 本检测法（μg/g） | RSD（%） | HPLC（μg/g） | RSD（%） |
| 样品3 | 68.73 | 8.13 | 67.86 | 9.51 |
如表3所示，与标准检测方法对比，本发明所述便携式传感器对蔬菜汁中对硫磷的检测结果和传统HPLC检测方法检测结果相近，且本发明的检测方法结果相对偏差较小，可见本检测方法结果波动小，结果稳定且重复性好。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.便携式传感器在对硫磷残留的快速检测中的应用，所述便携式传感器基于MOFs仿生酶构建而成；所述MOFs仿生酶呈现规则的正六面体、大小均一，且其中心呈孔状结构，为介孔材料。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述便携式传感器的制备方法包括：
S1. MOFs仿生酶的制备及其功能化：
将硝酸钴六水合物、二甲基咪唑分散于甲醇和乙醇混合溶液中，室温下孵育后进行离心、洗涤、干燥，得到MOFs仿生酶；制备金纳米粒子，然后将MOFs仿生酶缓慢加入到AuNPs胶体中反应后，用甲醇清洗除去未反应的杂质；将功能化的MOFs溶于甲醇中形成均匀的分散液；
S2. DNA1-MOFs信号探针的制备：
将DNA1序列加入到功能化的MOFs中反应制备DNA1-MOFs信号探针；用氢氧化钠溶液清洗后，将DNA1-MOFs信号探针分散在氢氧化钠溶液中；
所述DNA1的序列为5’-SH-(CH2)6ACACCATATTATGAAGAAGCGTCTTGCTCCTACG-3’；
S3. 便携式传感器的构建：
在加有DNA2序列5’-SH-(CH2)6CGTAGGAGCAAGACGCTTCTTCATAATATGGTGT-3’的孔板表面滴加AuNPs胶体培养一定时间，接着将DNA3序列5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3’滴加到孔板上，并加入对硫磷培养一段时间；然后在孔板表面滴加DNA1-MOFs信号探针培养，培养结束后清洗，获得所述便携式传感器。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述甲醇和乙醇溶液体积比为1~2.5：0.5~3；所述硝酸钴六水合物用量为0.5~2 mM，二甲基咪唑用量为1~4 mM。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述孵育的时间为12~48 h。
5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述的MOFs用量为2~8 mL，AuNPs用量为6~12 mL。
6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S2中，所述DNA1的浓度为10~30 μM；所述氢氧化钠溶液pH为11.5~13.5。
7. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S3中，所述DNA2的浓度为5~20 μM；在孔板表面培养的时间为12~36 h；所述DNA3的浓度为10~25 μM。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA2、AuNPs胶体、DNA3、对硫磷和DNA1-MOFs信号探针的用量相同。
9. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S3中，对硫磷在修饰孔板上的培养时间为30~120 min，信号探针在修饰孔板上的培养时间为50~180 min。
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