CN111398393B - 一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器的制备方法，包括以下步骤：以水热合成法制备三金属纳米花作为基底材料，以共价结合将基底材料和核酸适配体修饰在金电极表面，采用酶循环切割法制备核酸单链探针，制得核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极，本发明采用的电极系统，以核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银作参比电极，通过电活性物质的信号比值变化测得棒曲霉素的浓度，得到了用于棒曲霉素含量检测的电化学适体传感器。本发明与普通单信号电化学传感器相比，具有响应速度快，背景噪音低，灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器制备方法，尤其涉及一种基于三金属纳米材料修饰的金电极的制备方法。
背景技术
食品是人类社会赖以生存和发展的最基本的物质条件，食品安全状况如何，直接关系着广大人民群众的身体健康和生命安全，关系着我国国民经济与社会的协调发展。目前，食品中的棒曲霉素污染是一个世界性的问题，尤其是在水果及水果制品中，在发霉的苹果中，棒曲霉素污染尤为严重。棒曲霉素主要来源于青霉菌，这些真菌可利用鲜果肉质及其他食品和饲料中的营养繁殖并产毒。在水果制品加工中，原材料的长时间贮藏往往会造成水果制品中的棒曲霉素含量超标。人们长期食用棒曲霉素残留量超标的水果制品，将导致急性或慢性中毒，甚至引起细胞产生致畸和致突变作用，严重危害到人们的身体健康。
我国相关质量标准规定，山楂半成品及苹果的棒曲霉素最大残留量不得高于100µg/kg，果酒、罐头、果汁、果酱和果脯的棒曲霉素最大残留量不得高于50 µg/kg（GB 2761-2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量）。因此，加强棒曲霉素残留监测技术，对保护生态环境、保证食品安全、保障人类健康有着重要而深远的意义。目前测定各种生物基质中棒曲霉素的分析方法主要有薄层色谱法(TLC)（Welke J. E., Hoeltz M., Dottori H.A., et al. Quantitative analysis of patulin in apple juice by thin-layerchromatography using charge coupled device detector[J]. Food Additives andContaminants: Part A, 2009, 26(5):754-758.）、高效液相色谱法(HPLC)（Prieta J.,Moreno M. A., Bayo J., et al. Determination of patulin by reversed-phasehigh-performance liquid chromatography with extraction by diphasic dialysis[J]. The Analyst, 1993, 118(2):171-173）、气相色谱-质谱法(GC-MS)（Kharandi N.,Babri M., Azad J. A novel method for determination of patulin in apple juicesby GC-MS[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3):1619-1623） 等，这些方法虽然具有很高的灵敏度和准确度、且可以一次测定多种成分等优点，但需要大型昂贵的仪器设备及复杂的样品纯化制备程序，分析程序复杂，检测周期长，检测成本高，而且对检测技术水平要求较高，需要专业的技术人员来完成，在基层单位推广普及难度大，难以对水果的种植、加工、流通环节进行全面监控。因此，发展简便、快速、经济、适用于现场检测的方法将是解决当前棒曲霉素残留超标问题的有效途径之一。电化学生物传感器由于其选择性好、灵敏度高的优异特性逐渐成为当前研究的热点。但是，大多数二维纳米结构都会有容易无序堆积和聚集的问题，这导致纳米材料的界面面积大大减小，活性位点难以暴露，使部分纳米片的表面难以暴露，从而阻碍了电催化氧化过程和电子传输效率，为了缓解这个问题并获得更好的催化性能和导电性能，三金属纳米材料具有独特的三维结构、超薄尺寸和超大的比表面积，能够暴露出更多活性位点并负载大量信号标签，成为构建高效电化学生物传感器的关键。另外，多数检测棒曲霉素的电化学生物传感器仅仅涉及单个信号的变化，基于单个信号变化的生物传感器在检测过程中由于仪器效率、非目标诱导试剂的降解或解离、反应物浓度、pH等环境变化，会出现假正负误差，这限制了它们在实际样品分析中的应用。为了缓解这些干扰因素，设计基于比率型的生物传感器，其量化依赖于两种信号大小的比值变化，通过自我校准使大多数模糊度标准化，从而提供了更精确的结果。目前，合成功能化三金属纳米材料作为电极修饰材料，并设计构建比率型的电化学适体传感器用于棒曲霉素的检测尚未见报道。
发明内容
发明本发明涉及一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器制备方法。
一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器制备方法，其步骤如下：
所述三金属复合纳米花的制备：采用水热合成法制备三金属复合纳米花，分别称取2~4 mg金前体化合物、10~15 mg铂前体化合物、10~15 mg钯前体化合物和20~40 mg羰基金属配合物加入8~14 mL的混合有机溶剂中，超声处理10~20 min，在120~150℃保持1~2 h，通过离心收集所得产物，用有机溶剂洗涤后冷却至20~25℃，得到三金属复合纳米花；
所述核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极的制备：用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和超纯水中分别超声处理5~10 min，然后将金电极浸入强氧化溶液中15~30 min，用蒸馏水冲洗干燥，将金电极在氨基官能化溶液中进行CV扫描，在5~10 mM还原性溶液中进行负扫描，得到氨基化金电极；取2~6 μL上述三金属复合纳米花滴加至金电极表面，于红外灯下干燥5~10 min，移取3~6 μL 10~15 μM 5'端修饰二茂铁3'端修饰巯基的发夹探针DNA-1滴加至电极表面，于20~25℃下孵育8~12 h，移取3~6 μL封闭剂滴加至金电极表面，在35~40℃下孵育20~40 min，干燥即得到核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极；
所述核酸单链探针DNA-4的制备：采用酶循环切割法制备核酸单链探针DNA-4，移取3~6 μL一定浓度的棒曲霉素加入3~6 μL 10~15 μM的发夹适体DNA-2溶液中，在35~40℃下孵育40~60 min，之后分别将5~10 μL 10~15 μM 5'端修饰电活性物质的发夹探针DNA-3和2~6 μL 10~15 U/μL的核酸外切酶Ⅲ添加至上述溶液中，在35~40℃下孵育40~60 min，将上述溶液在60~80℃的水浴中保持10~15 min，即得到核酸单链探针DNA-4；
所述电化学传感器是以核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银作参比电极，将核酸单链探针DNA-4滴加至核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极表面，通过电活性物质和二茂铁的信号比值变化测得棒曲霉素的浓度，得到了用于棒曲霉素含量检测的电化学适体传感器。
所述的金前体化合物为四氯金酸、氰化金钾、氰化金钠中的一种或多种。
所述的铂前体化合物为二乙酰丙酮铂、氯铂酸、氯铂酸钠中的一种或多种。
所述的钯前体化合物为氯化钯、氯钯酸钠、氯钯酸钾中的一种或多种。
所述的羰基金属配合物为四羰基镍、六羰基钨、六羰基铬中的一种或多种。
所述的混合有机溶剂为乙酸、二甲基甲酰胺的两种混合物，体积比为1:4~1:6。
所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺中的一种或多种。
所述的强氧化溶液为浓H2SO4、30% H2O2的两种溶液混合物，体积比为7:3~7:5。
所述的氨基官能化溶液为80~110 mM四丁基四氟硼酸铵、对硝基苯四氟硼酸重氮盐的两种溶液混合物，体积比为80:1~120:1。
所述的还原性溶液为水合肼、盐酸、过氯化亚锡、四氢锂铝中的一种或多种。
所述的封闭剂为牛血清白蛋白、六巯基己醇、酪蛋白中的一种或多种。
所述的电活性物质为六氨合钌、吡啶钌、亚甲基蓝、硫堇中的一种或多种。
本发明涉及的传感器中，以核酸酶辅助循环作为信号放大策略，以三金属复合纳米花为传感器的基底材料进一步扩大信号，利用双信号比率分析法检测目标，同其它基于单信号及未使用信号放大策略用于棒曲霉素残留检测的电化学传感器相比，所制备的新型电化学传感器具有响应速度快，背景噪声低，灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行描述：
实施例1
具体步骤如下：
（1）采用水热合成法制备三金属复合纳米花，分别称取2 mg四氯金酸、10 mg二乙酰丙酮铂、10 mg氯化钯和20 mg四羰基镍加入8 mL体积比为1:4的乙酸与二甲基甲酰胺混合有机溶剂中，超声处理10 min，在120℃保持1 h，通过离心收集所得产物，用甲醇洗涤后冷却至20℃，得到三金属复合纳米花；
（2）用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和超纯水中分别超声处理5 min，然后将金电极浸入体积比为7:3的浓H2SO4与30% H2O2的强氧化溶液中15min，用蒸馏水冲洗干燥，将金电极在体积比为80:1的80 mM四丁基四氟硼酸铵与对硝基苯四氟硼酸重氮盐的氨基官能化溶液中进行CV扫描，在5 mM水合肼中进行负扫描，得到氨基化金电极；取2 μL上述三金属复合纳米花滴加至金电极表面，于红外灯下干燥5 min，移取3μL 10 μM 5'端修饰二茂铁3'端修饰巯基的发夹探针DNA-1滴加至电极表面，于20℃下孵育8 h，移取3 μL牛血清蛋白滴加至金电极表面，在35℃下孵育20 min，干燥即得到核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极；
（3）采用酶循环切割法制备核酸单链探针DNA-4，移取3 μL一定浓度的棒曲霉素加入3 μL 10 μM的发夹适体DNA-2溶液中，在35℃下孵育40 min，之后分别将5 μL 10 μM 5'端修饰中性红的发夹探针DNA-3和2 μL 10 U/μL的核酸外切酶Ⅲ添加至上述溶液中，在35℃下孵育40 min，将上述溶液在60℃的水浴中保持10 min，即得到核酸单链探针DNA-4；
（4）以核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银作参比电极，将核酸单链探针DNA-4滴加至核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极表面，通过中性红和二茂铁的信号比值变化测得棒曲霉素的浓度，得到了用于棒曲霉素含量检测的电化学适体传感器。
所制备的电化学传感器对棒曲霉素的检测具有准确度高，线性范围宽（5×10-9~5×10-1 μg/mL），检测下限低（1×10-9 μg/mL）的特点。同时，对实际样品(如苹果汁、草莓汁中的棒曲霉素)的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。
以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它试剂材料、调整分散时间等方法均在本发明专利要求范围之内。
Claims (4)
1.一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）三金属复合纳米花的制备：采用水热合成法制备三金属复合纳米花，分别称取2~4mg金前体化合物、10~15 mg铂前体化合物、10~15 mg钯前体化合物和20~40 mg羰基金属配合物加入8~14 mL的混合有机溶剂中，超声处理10~20 min，在120~150℃保持1~2 h，通过离心收集所得产物，用有机溶剂洗涤后冷却至20~25℃，得到三金属复合纳米花；
（2）核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极的制备：用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和超纯水中分别超声处理5~10 min，然后将金电极浸入强氧化溶液中15~30 min，用蒸馏水冲洗干燥，将金电极在氨基官能化溶液中进行CV扫描，在5~10 mM还原性溶液中进行负扫描，得到氨基化金电极；取2~6 μL上述三金属复合纳米花滴加至金电极表面，于红外灯下干燥5~10 min，移取3~6 μL 10~15 μM 5'端修饰二茂铁3'端修饰巯基的发夹探针DNA-1滴加至电极表面，于20~25℃下孵育8~12 h，移取3~6 μL封闭剂滴加至金电极表面，在35~40℃下孵育20~40 min，干燥即得到核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极；
（3）核酸单链探针DNA-4的制备：采用酶循环切割法制备核酸单链探针DNA-4，移取3~6μL一定浓度的棒曲霉素加入3~6 μL 10~15 μM的发夹适体DNA-2溶液中，在35~40℃下孵育40~60 min，之后分别将5~10 μL 10~15 μM 5'端修饰电活性物质的发夹探针DNA-3和2~6 μL 10~15 U/μL的核酸外切酶Ⅲ添加至上述溶液中，在35~40℃下孵育40~60 min，将上述溶液在60~80℃的水浴中保持10~15 min，即得到核酸单链探针DNA-4；
（4）电化学传感器是以核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银作参比电极，将核酸单链探针DNA-4滴加至核酸适配体/三金属复合纳米花/氨基化金电极表面，通过电活性物质和二茂铁的信号比值变化测得棒曲霉素的浓度，得到了用于棒曲霉素含量检测的电化学适体传感器。
2.根据权利要求1所述的一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的金前体化合物为四氯金酸、氰化金钾、氰化金钠中的一种或多种，所述的铂前体化合物为二乙酰丙酮铂、氯铂酸、氯铂酸钠中的一种或多种，所述的钯前体化合物为氯化钯、氯钯酸钠、氯钯酸钾中的一种或多种；所述的羰基金属配合物为四羰基镍、六羰基钨、六羰基铬中的一种或多种；所述的混合有机溶剂为乙酸、二甲基甲酰胺的两种混合物，体积比为1:4~1:6；所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的强氧化溶液为浓H2SO4、30% H2O2的两种溶液混合物，体积比为7:3~7:5；所述的氨基官能化溶液为80~110 mM四丁基四氟硼酸铵、对硝基苯四氟硼酸重氮盐的两种溶液混合物，体积比为80:1~120:1；所述的还原性溶液为水合肼、盐酸、过氯化亚锡、四氢锂铝中的一种或多种；所述的封闭剂为牛血清白蛋白、6-巯基己醇、酪蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种用于棒曲霉素检测的电化学适体比率传感器制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的电活性物质为中性红、吡啶钌、亚甲基蓝、硫堇中的一种或多种。
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