CN111004836B - 双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用 - Google Patents

双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用，包括捕获电极、编码探针和RecJf外切酶；所述捕获电极包括金电极、DNA1和捕获探针，DNA1的5’端与金电极连接，捕获探针为单链DNA形成的3’端突出的发夹结构，捕获探针的3’连接二茂铁，捕获探针3’端突出部分与DNA1杂交互补，捕获探针的DNA序列从3’端至5’端由序列Ⅰ和序列Ⅱ组成，序列Ⅰ为甲胎蛋白的适配体；编码探针包括金纳米颗粒、DNA2和亚甲基蓝，DNA2为从5’端至3’端由序列Ⅲ和序列Ⅳ组成，所述序列Ⅳ设置为与DNA1杂交互补，DNA2的5’端与金纳米颗粒连接，亚甲基蓝通过序列Ⅳ形成的G‑四链体结构连接在DNA2上。

Description

双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用
技术领域
本发明涉及双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在疾病的早期，可靠的痕量生物标志物检测对于降低疾病的发病率和死亡率以及规避长期无效的治疗方法和减少副作用等具有重要的意义。因此，开发快速、灵敏地检测生物标志物的方法在临床诊断、生物学研究和医学治疗等领域引起了极大的关注。迄今为止，各种类型的生物传感器已经用于生物标志物的检测。其中，电化学生物传感器凭借其小型化、快速响应、高灵敏度、低成本和方便操作等优势，在即时诊断设备的开发中具有巨大潜力。然而，在实际临床诊断中，真实生物样品的复杂性通常会干扰生物标志物检测的准确性。
甲胎蛋白(α-fetoprotein,αFP或AFP)主要在胎儿肝中合成，分子量6.9万，在胎儿13周AFP占血浆蛋白总量的1/3。在妊娠30周达最高峰，以后逐渐下降，出生时血浆中浓度为高峰期的1％左右，约40mg/L，在周岁时接近成人水平(低于30μg/L)。在成人，AFP可以在大约80％的肝癌患者血清中升高，在生殖细胞肿瘤出现AFP阳性率为50％。在其它肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。目前对于甲胎蛋白的检测方法有化学发光法、酶标法、酶标电泳法、放射免疫法检测。然而，这些方法对甲胎蛋白检测的抗干扰性较弱及灵敏度较低。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用，该适体传感器不仅具有良好的重现性和抗干扰能力，而且能够极大的提高检测的灵敏度。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种双向放大的比率型电化学适体传感器，包括捕获电极、编码探针和RecJf外切酶；
所述捕获电极包括金电极、DNA1和捕获探针，所述DNA1为单链DNA，DNA1的5’端与金电极连接，捕获探针为单链DNA形成的3’端突出的发夹结构，捕获探针的3’连接二茂铁，捕获探针3’端突出部分与DNA1杂交互补，捕获探针的DNA序列从3’端至5’端由序列Ⅰ和序列Ⅱ组成，所述序列Ⅰ为甲胎蛋白的适配体；
所述编码探针包括金纳米颗粒、DNA2和亚甲基蓝，所述DNA2为单链DNA，所述DNA2为从5’端至3’端由序列Ⅲ和序列Ⅳ组成，所述序列Ⅳ设置为与DNA1杂交互补，DNA2的5’端与金纳米颗粒连接，亚甲基蓝通过序列Ⅳ形成的G-四链体结构连接在DNA2上。
比率型电化学生物传感器能够使用两种信号的比率作为最终输出信号的模式。与传统的单信号生物传感器相比，这种具有双信号模式的比率型电化学生物传感器可通过其自参比功能提供内置校正和规避复杂实验条件引起的信号波动的功能，因此具有良好的重现性和抗干扰能力。当两种电化学响应过程以相反的方向响应，即一个过程信号增加而另一个过程信号减少。这种类型的比率型传感器不仅提供了内置校正功能，而且还通过双重响应信号的比值，以产生比单个传感器信号更大的响应幅度，从而实现灵敏度的提高。根据比率型电化学生物传感器的机理，任何过程的信号变化的放大都可以有效地改变输出比值信号的大小，即提高增大信号与减小信号的比值，从而提高传感器的灵敏度。
RecJf外切酶可以特异性地从5’端到3’端水解单链DNA，从而可以使单个目标物分子重复地触发识别反应，进而显著地放大了生物传感器的检测信号。金纳米颗粒是一种具有良好的生物相容性，易于表面改性和优异的电导率的经典纳米材料。
本发明中提供了基于RecJf外切酶诱导的目标物循环和亚甲基蓝标记的生物条形码金纳米颗粒探针(MB-DNA2编码探针)开发了双向放大的比率型电化学传感器，该传感器中RecJf外切酶的使用实现了对甲胎蛋白的循环识别，从而提高了下降的二茂铁信号与甲胎蛋白浓度的比值，并同时为MB-DNA2编码探针提供了更多的结合位点。此外，负载有大量亚甲基蓝分子的MB-DNA2编码探针可以产生很强的亚甲基蓝信号。最终，二茂铁和亚甲基蓝的电化学峰值电流分别随着甲胎蛋白浓度的增加而显著地降低和增加，最终实现了双向放大的策略，用于高灵敏度和宽检测范围的甲胎蛋白比率检测。
另一方面，一种上述双向放大的比率型电化学适体传感器在检测甲胎蛋白中的应用。
第三方面，一种上述双向放大的比率型电化学适体传感器在制备检测甲胎蛋白试剂中的应用。
第四方面，一种检测甲胎蛋白的方法，提供上述双向放大的比率型电化学适体传感器，包括捕获探针的循环水解、编码探针的互补杂交；
捕获探针的循环水解由若干水解过程循环组合形成，一个水解过程为：甲胎蛋白与捕获探针的适配体结合后使得捕获探针从捕获电极中解离出来，同时使捕获探针的5’端暴露，RecJf外切酶对捕获探针进行逐步水解，使得甲胎蛋白释放；甲胎蛋白继续与捕获探针的适配体复合进行循环水解；
所述编码探针的互补杂交为：捕获探针的循环水解的金电极的DNA1与编码探针的互补杂交；
电化学检测编码探针的互补杂交后的金电极的二茂铁信号及亚甲基蓝信号。
第五方面，一种检测甲胎蛋白的试剂盒，包括上述双向放大的比率型电化学适体传感器、NEBuffer溶液。
本发明的有益效果为：
经过实验证明，本发明提供的双向放大的比率型电化学适体传感器能够用于对AFP的超灵敏检测。该传感器具有很宽检测范围和低至269.4ag/mL的显著检测限。在对临床样品的分析表明，该适体传感器具有良好的抗干扰性能和实际应用的可行性。而且，通过选择更改合适的适体序列，该适体传感器可轻松用于检测各种类型的靶分子，因此在开发可靠的即时诊断设备领域具有的巨大潜力。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中的原理图。
图2为本发明实施例中的TEM图；A为金纳米颗粒，B为DNA2编码金纳米颗粒，C为MB-DNA2编码探针；插图为粒径分布图。
图3为本发明实施例的UV-vis吸收光谱图；a为金纳米颗粒，b为DNA2，c为MB分子，d为DNA2编码金纳米颗粒，e为MB-DNA2编码探针。
图4为本发明实施例中适体传感器的表征图；A为EIS图，a为裸金电极，b为金电极/DNA1，c为金电极/DNA1/Fc-CP，d为金电极/DNA1/Fc-CP/AFP，e为金电极/DNA1/Fc-CP/AFP/RecJf，f为金电极/DNA1/Fc-CP/AFP/RecJf/MB-DNA2编码探针；B为适体传感器的ACV响应曲线，a为0.03U/μL RecJf外切酶检测0ng/mL AFP，b为无RecJf外切酶检测0ng/mL AFP，c为无RecJf外切酶检测100ng/mL AFP，d为0.03U/μL RecJf外切酶检测100ng/mL AFP；C为电极表面SEM图，a为检测0ng/mL AFP，b为检测100ng/mL AFP。
图5为本发明AFP的比例检测表征图；A为适体传感器在检测不用浓度的AFP的ACV测试响应：0fg/mL,1fg/mL,10fg/mL,50fg/mL,100fg/mL,500fg/mL,1pg/mL,5pg/mL,10
pg/mL,50pg/mL,100pg/mL,500pg/m,1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL和1μg/mL(从a到r)；B为IMB/IFc的对数和AFP浓度的对数的线性关系；C为适体传感器在检测不同靶标时的ACV测试响应：AFP(1ng/mL),TB(10ng/mL),CEA(10ng/mL),IgG(10ng/mL)和PSA(10ng/mL)。
图6为本发明三个金电极在分别检测100ng/mL,100pg/mL,和100fg/mL的AFP的ACV响应柱状图；
图7为本发明适体传感器在保存了1、4、7、10和14天之后检测100ng/mL AFP的表征图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有检测甲胎蛋白的方法存在抗干扰性较弱及灵敏度较低，本发明提出了双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种双向放大的比率型电化学适体传感器，包括捕获电极、编码探针和RecJf外切酶；
所述捕获电极包括金电极、DNA1和捕获探针，所述DNA1为单链DNA，DNA1的5’端与金电极连接，捕获探针为单链DNA形成的3’端突出的发夹结构，捕获探针的3’连接二茂铁，捕获探针3’端突出部分与DNA1杂交互补，捕获探针的DNA序列从3’端至5’端由序列Ⅰ和序列Ⅱ组成，所述序列Ⅰ为甲胎蛋白的适配体；
所述编码探针包括金纳米颗粒、DNA2和亚甲基蓝，所述DNA2为单链DNA，所述DNA2为从5’端至3’端由序列Ⅲ和序列Ⅳ组成，所述序列Ⅳ设置为与DNA1杂交互补，DNA2的5’端与金纳米颗粒连接，亚甲基蓝通过序列Ⅳ形成的G-四链体结构连接在DNA2上。
本发明中提供了基于RecJf外切酶诱导的目标物循环和亚甲基蓝标记的生物条形码金纳米颗粒探针(MB-DNA2编码探针)开发了双向放大的比率型电化学传感器，该传感器中RecJf外切酶的使用实现了对甲胎蛋白的循环识别，从而提高了下降的二茂铁信号与甲胎蛋白浓度的比值，并同时为MB-DNA2编码探针提供了更多的结合位点。此外，负载有大量亚甲基蓝分子的MB-DNA2编码探针可以产生很强的亚甲基蓝信号。最终，二茂铁和亚甲基蓝的电化学峰值电流分别随着甲胎蛋白浓度的增加而显著地降低和增加，最终实现了双向放大的策略，用于高灵敏度和宽检测范围的甲胎蛋白比率检测。
该实施方式的一种或多种实施例中，DNA1的5’端通过金-硫键与金电极连接。
该实施方式的一种或多种实施例中，DNA2的5’端通过金-硫键与金纳米颗粒连接。
该实施方式的一种或多种实施例中，编码探针的制备过程为：将5’端巯基化的DNA2与金纳米颗粒进行孵育获得复合物，将复合物分散至含有氯化钠的Tris缓冲液中，使DNA2形成G-四链体结构，然后加入亚甲基蓝，静置后获得编码探针。
该实施方式的一种或多种实施例中，捕获电极的制备过程为：将5’端巯基化的DNA1与金电极进行孵育，再加入6-巯基-1-己醇，封闭活性位点，然后加入捕获探针孵育获得捕获电极。
该实施方式的一种或多种实施例中，DNA1由5’端至3’端的序列为：ACAGCACCACAGACCACGCA；
DNA2由5’端至3’端的序列为：CTGGGTTGGGTTGGGTTGGGATGGTGCTGTG；
捕获探针由5’端至3’端的序列为：GACCCGGGAAGGCAGGAAGACAAACAAGCTTGGCGGCGGGAAGGTGTTTAAATTCCCGGGTCTGCGTGGTCTGTGG TGCTGT。
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述双向放大的比率型电化学适体传感器在检测甲胎蛋白中的应用。优选以非疾病的诊断与治疗为目的的应用。
第三方面，一种上述双向放大的比率型电化学适体传感器在制备检测甲胎蛋白试剂中的应用。
第四方面，一种检测甲胎蛋白的方法，提供上述双向放大的比率型电化学适体传感器，包括捕获探针的循环水解、编码探针的互补杂交；
捕获探针的循环水解由若干水解过程循环组合形成，一个水解过程为：甲胎蛋白与捕获探针的适配体结合后使得捕获探针从捕获电极中解离出来，同时使捕获探针的5’端暴露，RecJf外切酶对捕获探针进行逐步水解，使得甲胎蛋白释放；甲胎蛋白继续与捕获探针的适配体复合进行循环水解；
所述编码探针的互补杂交为：捕获探针的循环水解的金电极的DNA1与编码探针的互补杂交；
电化学检测编码探针的互补杂交后的金电极的二茂铁信号及亚甲基蓝信号。
优选以非疾病的诊断与治疗为目的的检测方法。
本发明的第五种实施方式，提供了一种检测甲胎蛋白的试剂盒，包括上述双向放大的比率型电化学适体传感器、NEBuffer溶液。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
实验试剂和材料：
甲胎蛋白，癌胚抗原(CEA)，人前列腺特异性抗原(PSA)，凝血酶(TB)和人免疫球蛋白(IgG)购自于上海领潮生物科技有限公司(中国上海)。RecJf外切酶和10×NEBuffer购自于美国新英格兰生物实验室(北京)有限公司(中国北京)。氯化金，铁氰化钾和亚铁氰化钾购自于国药控股化学试剂有限公司(中国上海)。三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)购自于生工生物工程(上海)股份有限公司(中国上海)。6-巯基-1-己醇(MCH)和三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(中国上海)。亚甲基蓝购自于上海阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)。所有其他化学药品均为分析试剂级，无需进一步纯化即可使用。Tris缓冲液A(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2，pH 7.9)用于稀释所有的DNA寡核苷酸。Tris缓冲液B(10mM Tris-HCl，3M NaCl，pH 7.9)用于存储MB-DNA2编码探针。使用0.1M磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)存储甲胎蛋白，并作为电化学测量溶液。优普水净化系统的超纯水用来制备整个过程中使用的水溶液(电阻率>18.25MΩ·cm)。人血清样品是从山东大学齐鲁医院采集。HPLC纯化的所有DNA寡核苷酸均由生工生物工程(上海)股份有限公司(中国上海)合成和纯化。详细的序列如下：
DNA1:5’-HS-SH-(CH2)6-ACAGCACCACAGACCACGCA-3’，见SEQ ID NO.1。
DNA2:5’-HS-SH-(CH2)6-CTGGGTTGGGTTGGGTTGGGATGGTGCTGTG-3’，见SEQ ID NO.2。
Fc labeled capture probe(Fc-CP):5’-GACCCGGGAAGGCAGGAAGACAAACAAGCTTGGCGGCGGGAAGGTGTTTAAATTCCCGGGTCTGCGTGGTCTGTGGTGCTGT-Fc-3’，见SEQ ID NO.3。
仪器：
电化学测量是在CHI760E电化学工作站(上海晨华，中国)上进行的，采用传统的三电极系统，该系统由修饰的金电极(AuE，Φ＝3mm)作为工作电极，Ag/AgCl(在饱和KCl中)作为参比电极，铂丝作为对电极。MB-DNA2编码探针的合成通过透射电子显微镜(TEM，JEM-2100，JEOL)，紫外可见光谱(UV-vis，Hitachi U-290光谱仪，日本)和Zetasizer Nano(英国Malvern仪器有限公司)表征。通过电化学阻抗谱(EIS)和场发射扫描电子显微镜(FE-SEM，Hitachi S-4800)验证了适体传感器的构建过程。实验过程中除非另有说明，所有实验均在室温下进行。
合成MB-DNA2编码探针：
配制50mL0.01 wt％氯金酸溶液和1mL，38.8mM柠檬酸三钠的混合物作为金纳米颗粒制备的前驱体。搅拌1分钟后，将0.5mL新配制的硼氢化钠溶液缓慢加入到上述混合物溶液中来还原四氯合金离子。在加入硼氢化钠的过程中，反应溶液从黄色变为红色，表明形成了胶体金纳米颗粒的制成。搅拌几分钟后，将合成的胶体金纳米颗粒溶液转移至棕色玻璃瓶中，保存在4℃下以备后用。
将巯基化的DNA2溶解在含有10mM TCEP的Tris缓冲液A中，并在黑暗中孵育1小时以还原二硫键。随后，将上述的溶液添加到1mL合成的胶体金纳米颗粒溶液中，然后在4℃孵育16h，目的是通过金硫键来制备DNA2编码探针。然后，将所得溶液与0.1M氯化钠溶液在24小时之内混合3次从而使金纳米颗粒老化。然后，将获得的DNA2编码探针分散到含有3M氯化钠的Tris缓冲液B中，并保持1小时以使DNA2形成G-四链体(G4)结构，然后添加100μL亚甲基蓝溶液来形成G4/MB复合体。半小时后，将获得的溶液离心并使用Tris缓冲液B洗涤，重复3次上述操作，以除去过量的DNA2和亚甲基蓝，所得的沉淀物便是MB-DN编码探针。最后将合成的MB-DNA2编码探针分散到Tris缓冲液B中，并保存在4℃下以备后用。
构建适体传感器(捕获电极)：
用氧化铝浆水仔细抛光金电极面，直到获得一个干净的镜面，然后分别用乙醇和超纯水冲洗两次。随后，将抛光的金电极在0.5M硫酸溶液中进行电化学清洗，方法是在-0.2V至1.6V之间施加循环伏法测试实验，直到获得的循环伏安图不再表现出进一步的变化为止。然后，用超纯水彻底冲洗金电极，并用氮气干燥。从而获得干净的金电极表面。
将1μM DNA1与10mM TCEP混合，并在室温下于黑暗中孵育1小时以还原二硫键。然后将5μL上述溶液滴加到预处理过的金电极上，并在4℃温育12小时以将DNA1固定在金电极表面上，然后将所得电极浸入1mM MCH中1小时以封闭活性位点。用Tris缓冲液A洗涤后，将获得的金电极与5μL Fc-CP链(2μM)在37℃温育另外2小时，目的是将固定的DNA1和Fc-CP链杂交。这个过程中，过量的Fc-CP链和足够的温育时间是为了最小化未结合的DNA1的量，因为这可以有效避免背景信号的产生。用Tris缓冲液A洗涤后，得到了制备的金电极/DNA1/Fc-CP适体传感器，并在4℃下备用。
检测甲胎蛋白：
将不同浓度的甲胎蛋白和0.03U/μL RecJf外切酶混合在NEBuffer溶液中。将5μL的混合物立即滴到制成的金电极/DNA1/Fc-CP适体传感器电极表面，并在37℃下孵育2小时使适体传感器在RecJf外切酶的作用下循环识别甲胎蛋白。为防止蒸发，传感器电极上盖有一个小的离心管。用Tirs缓冲液A冲洗后，将所得的适体传感器与5μL制备的MB-DNA2编码探针在37℃温育半小时，以使从DNA1/Fc-CP双链体释放的DNA1与MB-DNA2编码探针中的DNA2杂交。然后，将适体传感器彻底冲洗，以去除未结合的MB-DNA2编码探针。最后，使用交流伏安法(ACV)对获得的适体传感器进行电化学测量，该交流伏安法是扫描-0.6V至0.6V的电势，阶跃电势为4mV，频率为25Hz，振幅为25mV测试电解液为0.1M PBS中。
结果与讨论
检测原理，如图1所示，甲胎蛋白循环的关键在于Fc-CP的设计，它由两个片段组成：片段Ⅰ是AFP的适配体，在3'末端标记有Fc分子。区段Ⅱ可以区段Ⅰ的一部分互补，使整个Fc-CP形成DNA发夹结构。这样使得Fc-CP的5'末端隐藏在发卡的茎部中，因此其无法被RecJf外切酶特异性识别。DNA2的设计是制备MB-DNA2编码探针的关键。3'末端巯基化的DNA2包含两个片段：片段Ⅲ是一个G4序列，可以通过π系统的末端堆积与MB相互作用；Ⅳ段可以和DNA1互补杂交。MB-DNA2编码探针是按照图1中的程序进行合成的。在整个适体传感器构建过程中，首先将3'末端巯基化的DNA1自组装到金电极表面上。然后，将过量的Fc-CP与固定有DNA1的金电极孵育，以便所有的DNA1形成DNA1/Fc-CP双链体。在目标物AFP存在的情况下，甲胎蛋白-适配体复合物的形成导致了Fc-CP从双链体中解离出来，RecJf外切酶便可以识别出暴露Fc-CP中的Ⅱ段。RecJf外切酶对Fc-CP的逐步水解使得AFP从甲胎蛋白-适配体复合物中释放出来，进而触发下一个识别目标物反应。最终，大量未结合的DNA1遗留在金电极表面上。在加入MB-DNA2编码探针后，这些DNA1可以与探针中DNA2的Ⅳ段互补杂交，那么MB-DNA2编码探针便附着到金电极表面上。在电化学测试中，可以同时获得显著降低的Fc信号和显著增加的MB信号。最终，实现了双向放大策略对AFP的比率检测。
MB-DNA2编码探针的合成表征：
用TEM表征了MB-DNA2编码探针的合成过程。如图2A所示，合成的金纳米直径约4.5nm，以球形良好地分散在溶液之中。在DNA2编码之后，AuNP的直径增加到6.5nm(图2B)，并在进一步用MB修饰之后，颗粒直径增加到了11.5nm(图2C)。合成的AuNPs由于柠檬酸三钠羧酸盐的表面涂层，其的电位在-67.33mV。在DNA2编码纳米颗粒之后，由于硫醇基团可以降低的表面电荷，电位转移到了-58.7mV。进而合成的MB-DNA2编码探针电位为-21.16mV，这是因为MB分子带正电的缘故。这些结果都证明了MB-DNA2编码探针的成功合成。
通过UV-vis吸收光谱表征了用DNA2和MB对金纳米颗粒的修饰过程。如图3所示，可以清晰观察到4.5nm的金纳米颗粒(曲线a，515nm)，DNA2(曲线b，280nm)和MB分子(曲线c，292nm和670nm)的特征峰。用DNA2编码金纳米颗粒之后，DNA特征峰和金纳米颗粒的特征峰均出现在吸收光谱的相应位置中，而且金纳米颗粒的峰从515nm红移到520nm(曲线d)。在用MB进一步修饰之后，获得的曲线在280nm，292nm，530nm和670nm处显示出四个峰(曲线e)。在测试中，由于在每一次的修饰后都要进行三次的离心和洗涤步骤，因此曲线e的出现可以断定与合成的MB-DNA2编码探针相关，而不是因为金纳米颗粒，DNA2和MB简单的物理混合而产生的。并且，在曲线e中金纳米颗粒的特征峰从520nm(曲线d)进一步红移到了530nm(曲线e)，这表明MB-DNA2编码探针已被成功地合成。
适体传感器的表征：
在包含5mM[Fe(CN)6]-3/-4的0.1M KCl溶液中进行了EIS测试实验。图4A的插图显示了在ZSimpWin软件中的拟合等效电路，它是由溶液电阻(Rs)，沃伯格扩散电阻(Zw)，反映电极表面特性的电子传递电阻(Ret)和双层电容(Cdl)。如图4A所示，由于裸金电极电阻很低(Ret＝103.1Ω，曲线a)，因此观察到的EIS几乎是一条直线。在与DNA1和MCH一起孵育后，出现了一个半圆形区域(曲线b)。这是由于带负电荷的DNA1和MCH对[Fe(CN)6]-3/-4的静电排斥，相应地Ret值增加到586.9Ω。类似地，在固定的DNA1与Fc-CP杂交形成双链体之后，Ret继续增加到4536Ω(曲线c)。进而制成的金电极/DNA1/Fc-CP适体传感器在与100ng/mL的AFP孵育之后，其Ret值显著地降低到了1769Ω(曲线d)；在与100ng/mL AFP和0.03U/μLRecJf外切酶混合物孵育之后，Ret值进一步降低到了1128Ω(曲线e)。这表明Fc-CP对AFP的特异性识别导致了Fc-CP链从电极表面上的DNA1/Fc-CP双链体分离开来，RecJf外切酶可以诱导AFP的循环识别，从而使更多的Fc-CP从电极表面释放出来。在检测完AFP之后，将金电极与MB-DNA2编码探针一起孵育，而Ret值急剧上升到9011Ω(曲线f)，这表明了MB-DNA2编码探针与电极上暴露的DNA1杂交。以上这些结果证明了所有的分子事件均按照预期成功地在电极表面上发生。
在检测过程之后用SEM表征了适体传感器表面。如图4C所示，图a是在不存在目标物AFP的情况下，这展示了一个典型的起皱但干净的表面形态。不同的是，在100ng/mL AFP存在的情况下，在适体传感器表面观察到颗粒层(图b)。这些粒子实际上就是MB-DNA2编码探针，其实通过与暴露的DNA1互补杂交而连接到电极表面上。由于在拍摄SEM图像之前预先对电极进行了表面喷金，所以粒径增加到了约30nm。SEM的结果进一步验证了捕获电极的检测可行性。
在0.1M PBS中的进行了交流伏安法(ACV)电化学测试，这其中所读出的电化学信号Fc来自于Fc-CP链，信号MB来自于MB-DNA2编码探针。在没有AFP的情况下，在图4B中获得的ACV曲线a中观察到位于+0.47V和-0.2V的两个氧化峰。为了调查在不存在AFP的情况下，MB背景峰产生的原因，在不使用RecJf外切酶的情况下进行了对照实验(曲线b)，所得到的结果显示，在曲线b和a之间观察到的差异可以忽略不计，这表明了RecJf外切酶在不存在AFP的情况下是对Fc-CP不产生作用的。换句话说，MB的背景与RecJf外切酶的非特异性水解无关。这种背景可能是来自于MB-DNA2编码探针中解离的MB分子，该分子扩散到金电极表面并通过静电作用与固定的DNA1相互作用。在100ng/mL AFP而没有RecJf外切酶辅助的情况下，获得的ACV曲线c与初始曲线a相比发生了巨大变化，其中IFc明显下降，IMB急剧增加，这可能由于Fc-CP可以特异性识别目标物AFP，导致Fc-CP链离开电极表面，使暴露的DNA1与MB-DNA2编码探针相结合。此外，在同时存在100ng/mL AFP和0.03U/μL RecJf外切酶的情况下(曲线d)，这种趋势变得更加明显，这表明RecJf外切酶通过诱导AFP循环而具有显著的信号扩增作用。这些结果清楚地证明了所提出的比率检测已按预期成功地被实施。
AFP的比例检测：
将开发的适体传感器用于检测一系列浓度的AFP。如图5A所示，随着AFP浓度从0fg/mL增加到1μg/mL(从a到r)，IFC逐渐降低，而IMB相应增加。相应的校准曲线显示，IMB/IFc的对数与AFP浓度的对数之间在10fg/mL至100ng/mL的范围内具有良好的线性关系(图5B)。AFP检测所得到的线性相关性经计算之后得到一个方程，log IMB/IFc＝0.1377log cAFP(g/mL)+2.0894，相关系数为0.9958。计算得出的检出限(LOD)为269.4ag/mL AFP(基于信噪比等于3)。显然，这与以前报道的比率型电化学生物传感器相比，获得的线性范围更宽，LOD更低。所提出的适体传感器的这种出色性能可归因于RecJf外切酶和MB-DNA2编码探针的双向扩增策略的使用。RecJf外切酶实现了靶标循环识别，导致大量Fc从电极表面释放出来，并伴随着电极表面上大量暴露的DNA1与MB-DNA2编码探针杂交。包含大量MB分子的编码探针导致MB信号极大地增强。最终，IFC的显著减少和IMB的显著增加实现了该适体传感器无与伦比的性能。
特异性、重现性和稳定性：
选择了一些可能与人血清中的AFP共存的其他生物分子，包括TB、CEA、IgG和PSA，作为潜在的干扰物质对适体传感器进行了测试。如图5C所示，在ACV测试中，适体传感器对1ng/mL AFP表现出强烈的反应，而10ng/mL TB，CEA，IgG和PSA的IMB/IFc值低至空白，尽管它们的浓度为AFP浓度的10倍，这表明了适体传感器具有很高的特异性。
由于适体传感器显示了宽广的检测范围，因此选择了三种不相邻的AFP浓度100ng/mL，100pg/mL和100fg/mL对传感器进行重现性评估。对于每个AFP浓度，在相同条件下在三个金电极上测试。如图6所示，每种AFP浓度测试的相对标准偏差(RSD)为4.53％，7.74％和5.74％，这表明所适体传感器具有较好的重现性。
为了评估所提出的适体传感器的稳定性，构建了适量的适体传感器，并分别在4℃下保存1、4、7、10和14天。然后，将它们用于检测相同浓度100ng/mL的AFP。如图7所示，适体传感器响并没有表现出明显的变化。即使在保存两周后，ACV响应仍占原始值的91.2％，这表明所提出的适体传感器具有令人满意的稳定性。
人血清标本分析：
根据当地伦理委员会的规定，通过对从山东大学齐鲁医院患者身上收集的临床人血清标本进行分析，评估了该测定方法的实际应用性。在检测期间，对所有与患者标本接触的工具进行消毒处理。在检测之前对这些样品进行了适当的稀释，以便AFP浓度位于适体传感器的检测线性范围内。通过适体传感器检测对每个样品中的AFP浓度进行测试，结果列于表1。这些结果与通过Cobas 6000分析仪(罗氏，瑞士)，这种商业化的学发光免疫分析法(ECLIA)获得的结果相比，相对偏差均小于10％，这表明适体传感器具有优秀的抗干扰性能，可以为临床应用提供一种可靠的富有潜力的检测平台。
表1.通过使用该传感器和ECLIA方法对临床样本的检测结果对比。
Figure BDA0002334154600000111
结论：
本发明开发了一种基于RecJf外切酶和MB-DNA编码探针的双向放大比率型电化学适体传感器，用于对AFP的超灵敏检测。RecJf外切酶实现了目标物循环扩增，从而提高了下降的Fc信号与AFP浓度的比率，并同时为MB-DNA编码探针提供了更多的结合位点。此外，装有大量MB分子的MB-DNA编码探针可以产生极强的MB信号。最终，随着AFP浓度的升高，IFc和IMB分别急剧地减少和增加，实现了AFP的双向放大比率检测，该传感器具有很宽检测范围和低至269.4ag/mL的显著检测限。在对临床样品的分析表明，该适体传感器具有良好的抗干扰性能和实际应用的可行性。而且，通过选择更改合适的适体序列，该适体传感器可轻松用于检测各种类型的靶分子，因此在开发可靠的即时诊断设备领域具有的巨大潜力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acagcaccac agaccacgca 20
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgggttggg ttgggttggg atggtgctgt g 31
<210> 3
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacccgggaa ggcaggaaga caaacaagct tggcggcggg aaggtgttta aattcccggg 60
tctgcgtggt ctgtggtgct gt 82

Claims (10)

1.一种双向放大的比率型电化学适体传感器，其特征是，包括捕获电极、编码探针和RecJf外切酶；
所述捕获电极包括金电极、DNA1和捕获探针，所述DNA1为单链DNA，DNA1的5’端与金电极连接，捕获探针为单链DNA形成的3’端突出的发夹结构，捕获探针的3’连接二茂铁，捕获探针3’端突出部分与DNA1杂交互补，捕获探针的DNA序列从3’端至5’端由序列Ⅰ和序列Ⅱ组成，所述序列Ⅰ为甲胎蛋白的适配体；
所述编码探针包括金纳米颗粒、DNA2和亚甲基蓝，所述DNA2为单链DNA，所述DNA2为从5’端至3’端由序列Ⅲ和序列Ⅳ组成，所述序列Ⅳ设置为与DNA1杂交互补，DNA2的5’端与金纳米颗粒连接，亚甲基蓝通过序列Ⅳ形成的G-四链体结构连接在DNA2上。
2.如权利要求1所述的双向放大的比率型电化学适体传感器，其特征是，DNA1的5’端通过金-硫键与金电极连接。
3.如权利要求1所述的双向放大的比率型电化学适体传感器，其特征是，DNA2的5’端通过金-硫键与金纳米颗粒连接。
4.如权利要求1所述的双向放大的比率型电化学适体传感器，其特征是，编码探针的制备过程为：将5’端巯基化的DNA2与金纳米颗粒进行孵育获得复合物，将复合物分散至含有氯化钠的Tris缓冲液中，使DNA2形成G-四链体结构，然后加入亚甲基蓝，静置后获得编码探针。
5.如权利要求1所述的双向放大的比率型电化学适体传感器，其特征是，捕获电极的制备过程为：将5’端巯基化的DNA1与金电极进行孵育，再加入6-巯基-1-己醇，封闭活性位点，然后加入捕获探针孵育获得捕获电极。
6.如权利要求1所述的双向放大的比率型电化学适体传感器，其特征是，DNA1由5’端至3’端的序列为：ACAGCACCACAGACCACGCA；
DNA2由5’端至3’端的序列为：CTGGGTTGGGTTGGGTTGGGATGGTGCTGTG；
捕获探针由5’端至3’端的序列为：GACCCGGGAAGGCAGGAAGACAAACAAGCTTGGCGGCGGGAAGGTGTTTAAATTCCCGGGTCTGCGTGGTCTGTGG TGCTGT。
7.一种权利要求1～6任一所述的双向放大的比率型电化学适体传感器在检测甲胎蛋白中以非疾病的诊断与治疗为目的的应用。
8.一种权利要求1～6任一所述的双向放大的比率型电化学适体传感器在制备检测甲胎蛋白试剂中的应用。
9.一种以非疾病的诊断与治疗为目的检测甲胎蛋白的方法，其特征是，应用权利要求1～6任一所述的双向放大的比率型电化学适体传感器，包括捕获探针的循环水解、编码探针的互补杂交，电化学检测编码探针的互补杂交后的金电极的二茂铁信号及亚甲基蓝信号的步骤；
捕获探针的循环水解由若干水解过程循环组合形成，一个水解过程为：甲胎蛋白与捕获探针的适配体结合后使得捕获探针从捕获电极中解离出来，同时使捕获探针的5’端暴露，RecJf外切酶对捕获探针进行逐步水解，使得甲胎蛋白释放；甲胎蛋白继续与捕获探针的适配体复合进行循环水解；
所述编码探针的互补杂交为：捕获探针的循环水解的金电极的DNA1与编码探针的互补杂交。
10.一种检测甲胎蛋白的试剂盒，其特征是，包括权利要求1～6任一所述的双向放大的比率型电化学适体传感器、NEBuffer溶液。
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An amperometric aptasensor for ultrasensitive detection of sulfadimethoxine based on exonuclease-assisted target recycling and new signal tracer for amplification;Huan You 等;《Biosensors and Bioelectronics》;20180606;第117卷;第707页左栏第3段，第708页第2.3.3、2.4节，方案1 *
Bi-directionally amplified ratiometric electrochemical aptasensor for the ultrasensitive detection of alpha-fetoprotein;Xingdong Yang 等;《Sensors and Actuators: B. Chemical》;20200730;第323卷;第1-7页 *
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