CN108169311A - 一种检测miRNA-122的电化学生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测miRNA‑122的电化学生物传感器，包括HAP1（发卡探针1）、ExoIII酶（核酸外切酶III）、金电极和修饰于金电极表面的HAP2（发卡探针2）‑辅助探针。本电化学生物传感器特异性好、灵敏度高；反应条件温和，反应速度快，使用金电极简便、小型化、易携带、可多次使用；制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于人体组织中miRNA‑122的检测和生物传感器产业化的实际应用。

Description

一种检测miRNA-122的电化学生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸外切酶Ⅲ检测miRNA-122的电化学生物传感器。
背景技术
MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20-25个核苷酸。miRNA-122，其核酸链碱基顺序是5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。研究表明，miRNA-122 是由定位于人类第18号染色体上的HCR基因转录而来的，其不仅能够影响肝细胞生长发育的过程，而且在肝细胞的表型、分化代谢以及细胞应答等诸多生命活动中也发挥着极其重要的作用。许多传统的方法如Northern杂交，微阵列和聚合酶链式反应（PCR）已用以确定和量化miRNA。这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵、检测灵敏度低等问题，已经难以满足对miRNA进行方便、快捷、高灵敏检测的要求。因此，快速，特异，等温miRNA检测新方法的研究是紧迫和严峻的。
发明内容
针对现有检测方法中仪器操作复杂、耗时长和需要专业操作人员的缺点，提供了一种特异性强、灵敏度高、成本低和检测速度快的基于核酸外切酶Ⅲ辅助的层叠信号放大的电化学生物传感器用于miRNA-122的检测。
本发明还提供了一种利用上述电化学生物传感器检测miRNA-122的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测miRNA-122的电化学生物传感器，包括HAP1（发卡探针1）、ExoIII酶（核酸外切酶III）、金电极和修饰于金电极表面的HAP2（发卡探针2）-辅助探针；
所述HAP1的序列如SEQ No. 1所示；
HAP2的序列如SEQ No. 2所示，其5’端修饰二茂铁（Fc），3’端修饰巯基（-SH）；所述发卡探针2通过Au-S键修饰于金电极表面；
辅助探针的序列如SEQ No. 3所示，其5’端修饰亚甲基蓝（MB）；所述辅助探针通过与发卡探针2杂交修饰于金电极表面。
一种利用上述电化学生物传感器检测miRNA-122的方法，包括以下步骤：
（1）金电极抛光处理；
（2）将HAP2溶液滴加于金电极表面，37 ℃恒温孵育；然后再滴加辅助探针溶液，37 ℃恒温孵育；
（3）将HAP1、ExoIII与miRNA-122的标准溶液或待测液混合，37 ℃恒温孵育；
（4）将步骤（3）的反应液滴加到步骤（2）所得的电极上，37 ℃恒温孵育；然后漂洗；
（5）以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，以步骤（4）所得金电极为工作电极，采用差分脉冲伏安法检测读取电信号的变化；
（6）根据标准溶液的电流变化作标准曲线，计算回归方程，由待测液的电流变化，计算待测液中miRNA的浓度。
所述抛光处理为将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面。
所述步骤（2）的HAP2和辅助探针的摩尔比为1:1。
步骤（5）中，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。
所述HAP1的浓度为0.1-2 µM，优选为0.1-1 µM；
所述HAP2的浓度为1-20 µM，优选为1-10 µM；
所述ExoIII的浓度为5-30 U/µL，优选为5-20 U/µL。
本电化学生物传感器的工作原理如下：
其中HAP1与辅助探针部分碱基互补序列，HAP2与辅助探针部分的互补。HAP2的3’端修饰-SH，通过Au-S共价键将HAP2固定在金电极表面，HAP2的5’端修饰上电活性物二茂铁（Fc），辅助探针的5’端修饰上电活性物（MB），可以在一定的电位下各自发生氧化还原反应。通过测量Fc和MB信号的变化通过比率来定量检测miRNA-122。
当miRNA-122存在时，由于目标物与HAP1游离态的3’端之间的特异性识别与结合形成平末端，Exo Ⅲ能够水解双链DNA的3’端，对双链DNA突出的3’端和单链没有水解作用。在ExoⅢ的作用下，开始从HAP1的3’端水解，直至双链水解完，释放出miRNA-122和二级目标物（5’-GCG TAC TGG CCA TTC TTC TTA-3’）。然后miRNA-122与其他的HAP1再次进行杂交，然后重复上述过程。引发第一步循环放大（目标物诱导的循环放大）和大量的二级目标物。
第二步的循环放大是在电极表面发生的，首先在金电极表面修饰一层HAP2，孵育一定时间以后，再修饰等量的辅助探针。在辅助探针存在的条件下，HAP2与辅助探针以部分杂交双链的形式固定在电极表面，HAP2的5’端修饰的电活性物质Fc远离电极表面，产生很弱的电化学信号；辅助探针的5’端修饰的电活性物质MB靠近电极表面，产生很强的电化学信号。然后将均相反应后的产物滴加到修饰好的金电极表面。二级目标物与辅助探针游离态的3’端之间的特异性识别与结合形成平末端，在Exo Ⅲ的作用下，开始从辅助探针的3’端水解，直至双链水解完，释放出二级目标物，再次与其他的辅助探针游离态的3’端杂交。水解之后，固定在电极上的HAP2两端的碱基互补配对，形成发夹构型，使修饰的电活性物质Fc靠近电极表面，产生很强的电化学信号，而电活性物质MB被释放，产生很弱的电化学信号。此为第三步循环放大（电极表面的循环放大）。
本发明具有以下优点：
本电化学生物传感器特异性好、灵敏度高；反应条件温和，反应速度快，使用金电极简便、小型化、易携带、可多次使用；制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于人体组织中miRNA-122的检测和生物传感器产业化的实际应用；成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为本电化学生物传感器的工作原理示意图；
图2为电流信号随HAP1浓度的变化曲线图；
图3为电流信号随HAP1浓度的变化曲线图；
图4为电流信号随ExoIII浓度的变化曲线图；
图5为检测miRNA的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例中，PBS缓冲液含Na2HPO4 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM)，NaCl (140 mM)，KCl(1 mM)，MgCl2 (1 mM)，CaCl2 (1 mM)，pH值为7.4。
10× NEBuffer含10 mM Bis Tris Propane-HCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT，pH为7.0。
取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L NaOH溶液15.2mL，用水稀释至250mL，配制为20mM的PB缓冲液，pH为6.5。
配制的各缓冲液与超纯水均在120 ℃的温度下灭菌20 min。
各DNA序列如下：
HAP1：5’-GCG TAC TGG CCA TTC TTC TTA GGC CAG ACG CGT CAC ACT CCA-3’
HAP2：5’-Fc-GTG CAC CTC CAG CAC -SH-3’
辅助探针：5’-MB-GTG CTG GAG GTG CAC CCA GTA CGC-3’
实施例1 电流信号随HAP1浓度的变化。
（1）将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，用PBS和灭菌水冲洗；
（2）将10 μL的HAP2 (10 μM)滴加到经过预处理的电极表面，在37 ℃下孵育2 h；然后再将10 μL的辅助探针滴加到电极表面，继续在37 ℃下孵育1 h；
（3）将12 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer、2 μL HAP1 (终浓度0.1 μM，0.3 μM，0.6 μM，1 μM，1.5 μM，2 μM)、2 μL Exo Ⅲ (20 U/μL)和2 μL miRNA-122溶液（1 pM）加入离心管中，震荡30 s，放入37 ℃的恒温箱中孵育2 h；
（4）将（3）中的混合溶液滴加到修饰好HAP2-辅助探针的金电极上， 37 ℃的恒温孵育2h，清洗；
（5）以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，以步骤（4）所得金电极为工作电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安法检测读取电信号的变化。
以HAP1的浓度为横坐标，以Fc电流变化为纵坐标，作图2。从图中可以看出，检测到的Fc电流信号随着HAP1的浓度在0-1 μM区间内增大而增大，当浓度超过1 μM后，电流趋于稳定。
实施例2 电流信号随HAP2浓度的变化。
（1）将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，用PBS和灭菌水冲洗；
（2）将10 μL的HAP2 (1 μM，3 μM，6 μM，10 μM，15 μM，20 μM)滴加到经过预处理的电极表面，在37 ℃下孵育2 h；然后再将10 μL的辅助探针滴加到电极表面，继续在37 ℃下孵育1 h；
（3）将12 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer、2 μL HAP1 (1 μM)、2 μL Exo Ⅲ (20 U/μL)和2 μL miRNA-122溶液（1 pM）加入离心管中，震荡30 s，放入37 ℃的恒温箱中孵育2 h；
（4）将（3）中的混合溶液滴加到修饰好HAP2-辅助探针的金电极上， 37 ℃的恒温孵育2h，清洗；
（5）以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，以步骤（4）所得金电极为工作电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安法检测读取电信号的变化。
以HAP2的浓度为横坐标，以Fc电流变化为纵坐标，作图3。从图中可以看出，检测到的Fc电流信号随着HAP2的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。
实施例3 电流信号随ExoIII浓度的变化。
（1）将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，用PBS和灭菌水冲洗；
（2）将10 μL的HAP2 (10 μM)滴加到经过预处理的电极表面，在37 ℃下孵育2 h；然后再将10 μL的辅助探针滴加到电极表面，继续在37 ℃下孵育1 h；
（3）将12 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer、2 μL HAP1 (1 μM)、2 μL Exo Ⅲ (5 U/μL，10 U/μL，15 U/μL，20 U/μL，25 U/μL，30 U/μL)和2 μL miRNA-122溶液（1 pM）加入离心管中，震荡30 s，放入37 ℃的恒温箱中孵育2 h；
（4）将（3）中的混合溶液滴加到修饰好HAP2-辅助探针的金电极上， 37 ℃的恒温孵育2h，清洗；
（5）以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，以步骤（4）所得金电极为工作电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安法检测读取电信号的变化。
以ExoIII的浓度为横坐标，以Fc电流变化为纵坐标，作图4。从图中可以看出，检测到的Fc电流信号随着Exo Ⅲ的浓度在0-20 U/μL区间内增大而增大，当浓度超过20 U/μL后，电流趋于稳定。
实施例4 对miRNA-122的检测。
（1）将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，用PBS和灭菌水冲洗；
（2）将10 μL的HAP2 (10 μM)滴加到经过预处理的电极表面，在37 ℃下孵育2 h；然后再将10 μL的辅助探针滴加到电极表面，继续在37 ℃下孵育1 h；
（3）将12 μL灭菌水、2 μL 10×的NEBuffer、2 μL HAP1 (1 μM)、2 μL Exo Ⅲ (20 U/μL)和2 μL系列浓度的miRNA-122标准溶液（0 aM，10 aM，100 aM，1 fM，10 fM，100 fM，1 pM，10 pM）或待测液分别加入离心管中，震荡30 s，放入37 ℃的恒温箱中孵育2 h；
（4）将（3）中的混合溶液滴加到修饰好HAP2-辅助探针的金电极上， 37 ℃的恒温孵育2h，清洗；
（5）以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，以步骤（4）所得金电极为工作电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安法检测读取电信号的变化，如表1所示。
根据标准溶液的电流变化如图5A所示，作标准曲线，如图5B所示；计算回归方程为Y=4.03589+0.24975X。
表1 标准溶液的电流值
。
<110> 济南大学
<120> 一种检测miRNA-122的电化学生物传感器
<130> 20171212
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1
<400> 1
gcgtactggc cattcttctt aggccagtac gcgtcacact cca 43
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H2
<400> 2
gtgcacctcc agcac 15
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MB
<400> 3
gtgctggagg tgcacccagt acgc 24

Claims (6)

1.一种检测miRNA-122的电化学生物传感器，其特征在于，包括发卡探针1、ExoIII酶、金电极和修饰于金电极表面的发卡探针2-辅助探针；
所述HAP1的序列如SEQ No. 1所示；
HAP2的序列如SEQ No. 2所示，其5’端修饰二茂铁，3’端修饰巯基；所述发卡探针2通过Au-S键修饰于金电极表面；
辅助探针的序列如SEQ No. 3所示，其5’端修饰亚甲基蓝；所述辅助探针通过与发卡探针2杂交修饰于金电极表面。
2.一种利用如权利要求1所述的电化学生物传感器检测miRNA-122的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）金电极抛光处理；
（2）将HAP2溶液滴加于金电极表面，37 ℃恒温孵育；然后再滴加辅助探针溶液，37 ℃恒温孵育；
（3）将HAP1、ExoIII与miRNA-122的标准溶液或待测液混合，37 ℃恒温孵育；
（4）将步骤（3）的反应液滴加到步骤（2）所得的电极上，37 ℃恒温孵育；然后漂洗；
（5）以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，以步骤（4）所得金电极为工作电极，采用差分脉冲伏安法检测读取电信号的变化；
（6）根据标准溶液的电流变化作标准曲线，计算回归方程，由待测液的电流变化，计算待测液中miRNA的浓度。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抛光处理为将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）的HAP2和辅助探针的摩尔比为1:1。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述HAP1的浓度为0.1-2 µM；所述HAP2的浓度为1-20 µM；所述ExoIII的浓度为5-30 U/µL。
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