CN109055609B - 基于t4 dna聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器及其组装方法 - Google Patents

基于t4 dna聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器及其组装方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器及其组装方法，所述传感器包括探针P1、探针P2、探针P3、发卡探针HP1、Nb.BbvC Ⅰ、T4 DNA聚合酶、dGTP、dNTP、发夹探针HP2、金电极；利用目标DNA和P1共同打开HP1，再利用Nb.BbvC Ⅰ识别位点，37℃酶切获得两个片段；加入P2与其中一个片段杂交，在T4 DNA聚合酶/dGTP作用下进行外切反应，加入dNTP进行聚合反应，再加入P3，使之与P2完全互补，即获得游离Mg2+‑依赖DNAzyme混合溶液；将其滴加到HP2修饰的金电极上反应，依次加入Hemin、K+、H2O2进行电流信号检测。本发明的测体系线性范围为50fM‑1nM，最低检测限为50fM，能够实现WMV的大田高灵敏快速检测。

Description

基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器及其组装方法
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器及其组装方法。
背景技术
西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus-2，WMV-2)为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)重要成员，在葫芦科和豆科作物中，它是重要的病毒之一，能够使受侵染的植物产量严重下降。
目前，植物病毒的检测方法主要采用分子生物学和血清学检测。分子生物学检测技术灵敏度高，但存在RNA抽提繁琐且易降解的问题。血清学检测由于其操作简单且能同时处理大量样品而被广泛采用，但需要购买价格昂贵的血清学检测试剂盒，并且检测结果的准确性取决于抗体的质量。
由于生物样品中与疾病相关的基因组数量较少，因此建立超灵敏的DNA或RNA检测方法是十分必要的。电化学技术具有操作成本低、携带方便、灵敏度高、稳定性好等优点，广泛应用于多种病毒检测。
在过去几年中，开发了许多基于核酸外切酶，内切核酸酶和聚合酶的无PCR方法的DNA扩增技术。值得注意的是，切口核酸内切酶信号扩增，单链切口和聚合酶链延伸的结合，由于其在实际样品中的高灵敏度，低成本和自主循环扩增，因此在低丰度DNA的检测中引起了极大的关注。聚合和断裂循环过程通常由多种酶操作，包括内切核酸酶，核酸外切酶和聚合酶等，以通过靶再循环操作促进信号放大。然而，通常使用没有二级结构的DNA模板，这对靶DNA的选择性没有优势，并且切口酶和聚合酶的识别位点重叠，这将延长反应时间。此外，产生的DNA复制子可以与游离DNA模板杂交，在一定程度上阻碍了对靶标的检测性能。因此，优化这种指数扩增系统以提高检测灵敏度和选择性，以及对电化学测量的适应性是非常重要的。
T4 DNA聚合酶具有多种功能，包括5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，其聚合速率大于脱氢水解。T4 DNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性，以ssDNA或dsDNA为模板，比DNA聚合酶I中的活性更高。
发明内容
本发明提供一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器及其组装方法。用于解决传统的内切/聚合反应获得产物能够与模板杂交，阻碍反应的进一步进行，进而在一定程度上阻碍了对靶标的检测性能的问题。
本发明的技术方案为：一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器，包括：探针P1、探针P2、探针P3、发卡探针HP1、Nb.BbvCⅠ、T4 DNA聚合酶、dGTP、dNTP、发夹探针HP2、金电极；
所述探针P1的基因序列如SEQ ID No.1所示：
SEQ ID No.1：5′-ACACACAGCGATCACCCATGCCTCAGCTTTT-3′；
所述探针P2的基因序列如SEQ ID No.2所示：
SEQ ID No.2：5′-GGGTTTAACATGGGTGATCGAAATAGTGGGTG-3′；
所述探针P3的基因序列如SEQ ID No.3所示：
SEQ ID No.3：5′-CACCCACTATTTCGATCACCCATGTTAAACCC-3′；
所述发卡探针HP1的基因序列如SEQ ID No.4所示：
SEQ ID No.4：
5′-ATGCCTCAGATAAGCCACAAAAAAAAGCTGAGGCAT-3′；
所述发夹探针HP2的基因序列如SEQ ID No.5所示：
SEQ ID No.5：
5′-SH5’-SH-(CH2)6-TTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTATrAGGTGTGTATCCCGCCC-3′。
进一步地，一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器，所述T4 DNA聚合酶具有3′→5′外切酶活性和5′→3′聚合酶活性。
本发明还提供了一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，包括以下步骤：
(1)将目标DNA溶液、探针P1溶液、发卡探针HP1溶液混合，室温孵育20-60min，利用目标DNA与P1共同打开发夹探针HP1；
(2)加入Nb.BbvCⅠ溶液，室温孵育10-50min，利用Nb.BbvCⅠ识别CCTCAGC位点，37℃酶切产生切口，获得P1-25和P1-6两个片段；
(3)再加入探针P2溶液，使之与P1-25杂交，得到杂交产物；
(4)降温至12℃，向所述杂交产物中加入T4 DNA聚合酶与dGTP混合溶液，进行3′→5′外切反应，外切反应结束后，加入dNTP溶液进行5′→3′聚合反应；
(5)聚合反应结束后，再加入探针P3溶液，使之与P2完全互补，即获得游离Mg2+-依赖DNAzyme的反应混合液；
(6)将金电极表面进行抛光处理；
(7)将发夹探针HP2溶液滴加于抛光处理后的金电极表面，37℃恒温孵育1h，将HP2通过Au-S键连接到金电极上，加入MCH封闭金电极；
(8)将游离Mg2+-依赖DNAzyme的反应混合液滴加到HP2修饰的金电极表面上，37℃恒温孵育40min，使之与HP2的环杂交；
(9)加入一定浓度的Mg2+缓冲液，在Mg2+存在下，Mg2+-依赖DNAzyme剪切其识别位点，将HP2的茎环结构剪切为两部分；
(10)加入一定浓度的Hemin和含K+缓冲液，反应40min，连接电极的部分在Hemin和K+存在下变化为hemin/G-quadruplex-based DNAzyme；
(11)再加入一定浓度的H2O2溶液，在H2O2存在下四聚体DNAzyme模拟酶能够发生氧化还原反应，产生电流变化，从而指示信号；
(12)以步骤(11)所得的金电极为工作电极，Pt电极为对电极，SCE电极作为参比电极，采用差分脉冲伏安法对电流进行检测，并记录i-t曲线；
(13)根据不同浓度目标DNA溶液的电流值为纵坐标，以对应的目标DNA溶液浓度为横坐标，建立浓度标准曲线；
(14)将电流值与目标DNA溶液浓度进行线性拟合，确定线性范围和目标DNA的检测限。
进一步地，步骤(1)中所述探针P1溶液的浓度为0.25-1μmol/L。
进一步地，步骤(4)中所述T4 DNA聚合酶的浓度为2-6U。
进一步地，步骤(4)中T4 DNA聚合酶外切反应时间为10-20min。
进一步地，步骤(4)中T4 DNA聚合酶聚合反应时间为10-20min。
进一步地，步骤(1)中所述目标DNA的基因序列如SEQ ID No.6所示：
SEQ ID No.6：5′-TTTTGTGGCTTATC-3′。
进一步地，步骤(7)中探针HP2溶液的浓度为0.2-0.5μM。
进一步地，步骤(14)中所述线性范围为50fM-1nM，最低检测限为50fM。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明利用T4 DNA聚合酶的外切和聚合功能对传统内切/聚合反应方法进行升级，得到的产物不会与模板进行杂交结合，进而影响进一步反应。
(2)本发明的测体系线性范围为50fM-1nM，最低检测限为50fM，能够实现WMV的大田高灵敏快速检测。
总之，本发明的电化学传感器具有特异性好、灵敏度高、反应速度快、干扰性小等优点。
附图说明
图1是本发明的电化学传感器组装反应流程图；
图2是本发明实施例2的不同浓度目标DNA的差分脉冲曲线图；其中，A：目标DNA的浓度从上至下分别为0，50fM，100fM，500fM，1pM，10pM，100pM，1nM；
图3是本发明实施例3的不同浓度目标DNA的标准曲线图；
图4是本发明实施例4中不同P1浓度值与电流值的关系图；
图5是本发明实施例5中T4 DNA聚合酶外切反应时间与电流值关系图；
图6是本发明实施例6中T4 DNA聚合酶聚合反应时间与电流值关系图；
图7是本发明实施例7中不同HP2浓度值与电流值的关系图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明做进一步说明，本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器，包括：探针P1、探针P2、探针P3、发卡探针HP1、Nb.BbvCⅠ、T4 DNA聚合酶、dGTP、dNTP、发夹探针HP2、金电极；
各DNA序列如下：
所述探针P1的基因序列如SEQ ID No.1所示：
SEQ ID No.1：5′-ACACACAGCGATCACCCATGCCTCAGCTTTT-3′；
所述探针P2的基因序列如SEQ ID No.2所示：
SEQ ID No.2：5′-GGGTTTAACATGGGTGATCGAAATAGTGGGTG-3′；
所述探针P3的基因序列如SEQ ID No.3所示：
SEQ ID No.3：5′-CACCCACTATTTCGATCACCCATGTTAAACCC-3′；
所述发卡探针HP1的基因序列如SEQ ID No.4所示：
SEQ ID No.4：
5′-ATGCCTCAGATAAGCCACAAAAAAAAGCTGAGGCAT-3′；
所述发夹探针HP2的基因序列如SEQ ID No.5所示：
SEQ ID No.5：
5′-SH5’-SH-(CH2)6-TTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTATrAGGTGTGTATCCCGCCC-3′。
一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，原理步骤如图1所示，包括以下步骤：
1、将2μL目标DNA(WMV cDNA)溶液(0，50fM，100fM，500fM，1pM，10pM，100pM，1nM)、2μL探针P1溶液(0.8μM)、2μL发卡探针HP1溶液(0.4μM)混合，室温孵育50min，利用目标DNA与P1共同打开发夹探针HP1；WMV cDNA的基因序列如SEQ ID No.6所示：
SEQ ID No.6：5′-TTTTGTGGCTTATC-3′。
(1)加入2μLNb.BbvCⅠ溶液(0.5μM)，室温孵育40min，利用Nb.BbvCⅠ识别CCTCAGC位点，37℃酶切产生切口，获得P1-25和P1-6两个片段；
(2)再加入2μL探针P2溶液(0.8μM)，使之与P1-25杂交，得到杂交产物；
(3)降温至12℃，向所述杂交产物中加入4μLT4 DNA聚合酶(6U)与2μLdGTP混合溶液(0.5μM)，进行3′→5′外切反应，T4 DNA聚合酶外切反应时间为15min，外切反应结束后，加入2μLdNTP(0.5μM)溶液进行5′→3′聚合反应，T4 DNA聚合酶聚合反应时间为20min；
(4)聚合反应结束后，再加入2μL探针P3溶液(0.8μM)，使之与P2完全互补，即获得游离Mg2+-依赖DNAzyme的反应混合液；
(5)将金电极利用水刀磨料射流抛光技术抛光至镜面，并用PBS和灭菌水冲洗；
(6)将10μL发夹探针HP2溶液(0.5μM)滴加于抛光处理后的金电极表面，37℃恒温孵育1h，将HP2通过Au-S键连接到金电极上，加入MCH封闭金电极；
(7)吸取20μL游离Mg2+-依赖DNAzyme的反应混合液滴加到HP2修饰的金电极表面上，37℃恒温孵育1.5h，使之与HP2的环杂交；
(8)加入1μLMg2+缓冲液(50μM)，在Mg2+存在下，Mg2+-依赖DNAzyme剪切其识别位点，将HP2的茎环结构剪切为两部分；
(9)加入1μL的Hemin(0.3μM)和5μL含K+缓冲液(11mM)，反应40min，连接电极的部分在Hemin和K+存在下变化为hemin/G-quadruplex-based DNAzyme；
(10)再加入2μL的H2O2溶液，在H2O2存在下四聚体DNAzyme模拟酶能够发生氧化还原反应，产生电流变化，从而指示信号。
实施例2
以实施例1中最后所得的金电极为工作电极，Pt电极为对电极，SCE电极作为参比电极，采用差分脉冲伏安法对电流进行检测，并记录i-t曲线；结果如图2所示，电流值的大小与目标DNA(WMV cDNA)浓度呈正相关关系。
实施例3
根据实施1中不同浓度目标DNA(WMV cDNA)溶液的电流值为纵坐标，以对应的目标DNA溶液浓度为横坐标，建立浓度标准曲线；结果如图3所示，将电流值与目标DNA溶液浓度进行线性拟合得到一条直线，线性相关度在0.99以上，采用3σ法对检测限进行计算，得到线性范围为50fM-1nM，最低检测限为50fM。
实施例4
研究不同P1浓度对电流信号的影响，其中目标DNA的浓度为10pM；
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，实施例1与6个对照组的P1浓度与电流值如表1所示：
表1：各组的P1浓度值与电流值
组别 P1浓度 电流值
实施例1 0.8μM 1.29μA
对比例1 0.2μM 0.42μA
对比例2 0.4μM 0.66μA
对比例3 0.6μM 1.05μA
对比例4 1.0μM 1.47μA
对比例5 1.2μM 1.50μA
对比例6 1.4μM 1.53μA
以P1浓度值为横坐标，以电流值为纵坐标，做折线图，如图4所示。从图4中可以看出，检测到的电流值随着P1浓度值在0.2-1.0μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0μM后，电流趋于稳定。由此可知，P1浓度值最佳为1.0μM。
实施例5
研究T4 DNA聚合酶外切反应时间对电流信号的影响，其中目标DNA的浓度为10pM；
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，实施例1与6个对照组的T4 DNA聚合酶外切反应时间与电流值如表2所示：
表2：各组的T4 DNA聚合酶外切反应时间与电流值
Figure BDA0001757654260000081
Figure BDA0001757654260000091
以T4 DNA聚合酶外切反应时间为横坐标，以电流值为纵坐标，做折线图，如图5所示。从图5中可以看出，检测到的电流值随着T4 DNA聚合酶外切反应时间在5-20min区间内增大而增大，当外切反应时间超过20min后，电流趋于稳定。由此可知，外切反应时间最佳为20min。
实施例6
研究T4 DNA聚合酶聚合反应时间对电流信号的影响，其中目标DNA的浓度为10pM；
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，实施例1与6个对照组的T4 DNA聚合酶聚合反应时间与电流值如表3所示：
表3：各组的T4 DNA聚合酶聚合反应时间与电流值
组别 聚合反应时间 电流值
实施例1 20min 1.49μA
对比例1 5min 0.40μA
对比例2 10min 0.9μA
对比例3 15min 1.28μA
对比例4 25min 1.52μA
对比例5 30min 1.58μA
对比例6 35min 1.62μA
以T4 DNA聚合酶聚合反应时间为横坐标，以电流值为纵坐标，做折线图，如图6所示。从图6中可以看出，检测到的电流值随着T4 DNA聚合酶聚合反应时间在5-25min区间内增大而增大，当外切反应时间超过25min后，电流趋于稳定。由此可知，外切反应时间最佳为25min。
实施例7
研究不同HP2浓度对电流信号的影响，其中目标DNA的浓度为10pM；
以实施例1为参照，设置6个对照组，每组设置三个平行，其余条件均相同，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，实施例1与6个对照组的HP2浓度与电流值如表4所示：
表4：各组的HP2浓度与电流值
组别 HP2浓度 电流值
实施例1 0.5μM 1.53μA
对比例1 0.1μM 0.29μA
对比例2 0.2μM 0.72μA
对比例3 0.3μM 1.02μA
对比例4 0.4μM 1.20μA
对比例5 0.6μM 1.54μA
对比例6 0.7μM 1.56μA
以HP2浓度值为横坐标，以电流值为纵坐标，做折线图，如图7所示。从图7中可以看出，检测到的电流值随着P1浓度值在0.2-0.5μM区间内增大而增大，当浓度超过0.5μM后，电流趋于稳定。由此可知，HP2浓度值最佳为0.5μM。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器
<141> 2018-08-08
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 探针P1的基因序列
<400> 1
acacacagcg atcacccatg cctcagcttt t 31
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> 探针P2的基因序列
<400> 2
gggtttaaca tgggtgatcg aaatagtggg tg 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> 探针P3的基因序列
<400> 3
cacccactat ttcgatcacc catgttaaac cc 32
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223> 发卡探针HP1的基因序列
<400> 4
atgcctcaga taagccacaa aaaaaagctg aggcat 36
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(44)
<223> 发夹探针HP2的基因序列
<400> 5
ttttgggttg ggcgggatgg gtttatragg tgtgtatccc gccc 44
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> A
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> 目标DNA的基因序列
<400> 6
ttttgtggct tatc 14

Claims (8)

1.一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器，其特征在于，包括：探针P1、探针P2、探针P3、发夹探针HP1、Nb.BbvCⅠ、T4 DNA聚合酶、dGTP、dNTP、发夹探针HP2、金电极；
所述探针P1的基因序列如SEQ ID No.1所示：
SEQ ID No.1：5′-ACACACAGCGATCACCCATGCCTCAGCTTTT-3′；
所述探针P2的基因序列如SEQ ID No.2所示：
SEQ ID No.2：5′-GGGTTTAACATGGGTGATCGAAATAGTGGGTG-3′；
所述探针P3的基因序列如SEQ ID No.3所示：
SEQ ID No.3：5′-CACCCACTATTTCGATCACCCATGTTAAACCC-3′；
所述发夹探针HP1的基因序列如SEQ ID No.4所示：
SEQ ID No.4：
5′-ATGCCTCAGATAAGCCACAAAAAAAAGCTGAGGCAT-3′；
所述发夹探针HP2的基因序列如SEQ ID No.5所示：
SEQ ID No.5：
5′-SH-(CH2)6-TTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTATrAGGTGTGTATCCCGCCC-3′。
2.根据权利要求1所述的基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将目标DNA溶液、探针P1溶液、发夹探针HP1溶液混合，室温孵育20-60min，利用目标DNA与P1共同打开发夹探针HP1；
(2)加入Nb.BbvCⅠ溶液，室温孵育10-50min，利用Nb.BbvCⅠ识别CCTCAGC位点，37℃酶切产生切口，获得P1-25和P1-6两个片段；
(3)再加入探针P2溶液，使之与P1-25杂交，得到杂交产物；
(4)降温至12℃，向所述杂交产物中加入T4 DNA聚合酶与dGTP混合溶液，进行3′→5′外切反应，外切反应结束后，加入dNTP溶液进行5′→3′聚合反应；
(5)聚合反应结束后，再加入探针P3溶液，使之与P2完全互补，即获得游离的Mg2+-依赖DNAzyme的反应混合液；
(6)将金电极表面进行抛光处理；
(7)将发夹探针HP2溶液滴加于抛光处理后的金电极表面，37℃恒温孵育1h，将HP2通过Au-S键连接到金电极上，加入MCH封闭金电极；
(8)将游离Mg2+-依赖DNAzyme的反应混合液滴加到HP2修饰的金电极表面上，37℃恒温孵育40min，使之与HP2的环杂交；
(9)加入一定浓度的Mg2+缓冲液，在Mg2+存在下，Mg2+-依赖DNAzyme剪切其识别位点，将HP2的茎环结构剪切为两部分；
(10)加入一定浓度的Hemin和含K+缓冲液，反应40min，连接电极的部分在Hemin和K+存在下变化为hemin/G-quadruplex-based DNAzyme；
(11)再加入一定浓度的H2O2溶液，在H2O2存在下hemin/G-quadruplex-based DNAzyme能够发生氧化还原反应，产生电流变化，从而指示信号；
(12)以步骤(11)所得的金电极为工作电极，Pt电极为对电极，SCE电极作为参比电极，采用差分脉冲伏安法对电流进行检测，并记录i-t曲线；
(13)根据不同浓度目标DNA溶液的电流值为纵坐标，以对应的目标DNA溶液浓度为横坐标，建立浓度标准曲线；
(14)将电流值与目标DNA溶液浓度进行线性拟合，确定线性范围和目标DNA的检测限；
步骤(1)中所述目标DNA的基因序列如SEQ ID No.6所示：
SEQ ID No.6：5′-TTTTGTGGCTTATC-3′。
3.根据权利要求2所述的一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，其特征在于，步骤(1)中所述探针P1溶液的浓度为0.25-1μmol/L。
4.根据权利要求2所述的一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，其特征在于，步骤(4)中所述T4 DNA聚合酶的浓度为2-6U。
5.根据权利要求2所述的一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，其特征在于，步骤(4)中T4 DNA聚合酶外切反应时间为10-20min。
6.根据权利要求2所述的一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，其特征在于，步骤(4)中T4 DNA聚合酶聚合反应时间为10-20min。
7.根据权利要求2所述的一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，其特征在于，步骤(14)中所述线性范围为50fM-1nM，最低检测限为50fM。
8.根据权利要求2所述的一种基于T4 DNA聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器的组装方法，其特征在于，步骤(14)中最低检测限为50fM。
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