CN102099488A

CN102099488A - 利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小rna的方法

Info

Publication number: CN102099488A
Application number: CN2009801280219A
Authority: CN
Inventors: 汪小龙; 吕翠仙; 苟德明; 刘晨光
Original assignee: 汪小龙
Current assignee: SHANDONG LIFEI BIOLOGICAL INDUSTRY Co.,Ltd.
Priority date: 2009-01-05
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2029-04-03
Also published as: CN102099488B; US20120028253A1; WO2010075659A1

Abstract

一种寡核苷酸体外扩增方法，该方法利用了聚合酶-内切酶链式反应(polymerase-endonuclease chain reaction，简称PECR)。该方法包括利用含有重复序列的单链DNA探针，通过耐热DNA聚合酶延伸目标寡核苷酸，耐热限制性内切酶或单链切口酶切割延伸产物，通过热循环反应扩增特定的目标寡核苷酸。PECR只需要一个探针而不是一对引物，就能够实现以指数扩增特定的寡核苷酸。PECR反应过程由热循环精密控制，循环参数可根据目标寡核苷酸的长度、序列、解链温度和初始分子数灵活调节，扩增速率完全取决于反应体系中目标核酸的初始分子数。可对生物样品中微量的特定小分子核酸如寡核苷酸和microRNA进行扩增和定量分析。PECR操作简便、高效且稳定，不需使用通用引物，扩增特异性更高，可广泛应用于分子生物学研究。

Description

利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法技术领域

本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种寡核苷酸和小分子 RNA扩增方法。

背景技术

核酸扩增技术是当代分子生物学和基因工程领域的核心技术。近年来新的核酸扩增模式不断涌现，基于核酸扩增技术的检测和诊断方法已大量建立并获得广泛应用，给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。虽然这些方法在临床实践中也遇到一些问题，如假阳性与假阴性问题，但基于核酸扩增技术的检测和诊断方法具有特殊优点，如需样量少、快速、灵敏和准确、应用范围广泛。因此，国内外众多学者不断致力于改进现有技术和探索新型核酸扩增技术。

按照扩增过程中温度是否变化来划分，核酸扩增方法可分为变温扩增和恒温扩增两大类。变温扩增主要包括经典的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称 PCR) 和连接酶链式反应（Ligase Chain Reaction,简称 LCR ) ，而恒温扩增包括链置换扩增（Strand displacement amplification，简称 SDA) 、滚环扩增（Rolling Circle amplification，简称 RCA) 、环介导扩增（Loop Mediated Amplification,简称 LAMP ) 、依赖解旋酶恒温扩增 (Helicase- dependent Isothermal DNA Amplification, 简称 HDA)、依赖核酸序列的扩增 ( Nucleic acid sequence based amplification , 简称 NASBA) 、转录依赖白勺扩增系统 (Transcription-based Amplification System, 简称 TAS) ，等等。

纵观当今分子生物学及基因工程技术领域，虽然新型核酸扩增方法层出不穷，但 PCROJ. S. Pat. Nos.4, 683， 195和 4, 683， 202)依然是最常用的体外核酸扩增方法。 PCR和逆转录 PCR技术在扩增有足够长度的 DNA和 RNA时简单而有效。但无法用 PCR技术直接扩增小分子核酸，如寡核苷酸、 microRNA (简称 miRNA) 和小干涉 RNA (简称 siRNA) 等。 miRNA经过逆转录之后，与其互补的 cDNA其实就是寡核苷酸，往往只有 18- 25个核苷酸的长度，无法设计一对特异性引物。

寡核苷酸在现代分子生物技术中应用十分广泛。虽然合成的大量、纯净、单一序列的寡核苷酸可以通过分光光度法根据 0D值定量，但在含有大量各种不同核酸序列的实际生物样品中，对超微量的、具有特定序列的目标寡核苷酸进行扩增和定量分析，不仅在技术上是一个需要克服的难题，而且在科学上也有重要的应用价值。例如可用于 miRNA和 siRNA等小 RNA的定量分析。

但有关寡核苷酸扩增方法的研究报道极少。专利 "Isothermal reactions for the

1

确认本 Amplification of oligonucleotides" (PCT/US04/02718)描述了恒温指数扩增反应 (Exponential Amplification Reaction, 简称 EXPAR) 能够扩增出寡核苷酸。该方法依赖于聚合酶、单链切口酶和链置换作用，利用带有重复序列的单链 DNA作为模板，能够在 5分钟内将目标寡核苷酸扩增 10⁶倍。该反应在恒温条件下进行，无需昂贵的 PCR仪，十分简便和快速。但令人遗憾的是， Tan等人在最近进行的进一步研究中，指出该反应存在非常严重的非特异性背景扩增和假阳性的问题：即便反应体系中没有任何目标 DNA，也会出现阳性反应（Tan E， et al, Specific versus nonspecific isothermal DNA amplification through thermophilic polymerase and nicking enzyme activities. Biochemistry. 2008, 47 (38)： 9987-9999 ) 。因此，尽管该方法具有恒温和快速的优势，但用于寡核苷酸定量分析是非常不可靠的。

有关 miRNA的研究是当今分子生物学研究的热点，连续多年被 Nature和 Science等世界顶级杂志评选为十大科技新闻。 miRNA是一类内源的、长度约为 20- 24个核苷酸的调控小 RNA。自 1999年在秀丽线虫中发现第一个 miRNA lin- 4以来，研究人员在线虫、果蝇、小鼠、斑马鱼等模式生物和人类中发现了许多具有重要基因调控作用的 miRNA。 miRNA识别并与其标目标，即编码特定蛋白的信使 RNA (mRNA) 的 3' -非翻译区（3' -UTR) 部分配对，从而抑制目标 mRNA 在细胞内的翻译活性，即转录后基因沉默（post- transcriptional gene silencing, 简称 PTGS)；或与其同源的 mRNA结合，诱导目标 mRNA降解。 miRNA参与生物体中很多基本生命过程的调控，在生命活动中起着非常重要的作用。例如 lin-4参与控制秀丽线虫的幼虫发育时序， mir-14控制果蝇细胞死亡和脂肪代谢。在斑马鱼中 miR-214决定肌肉细胞发育命运，而 miR-430 对胚胎中不再需要的母源 mRNA进行清除。 miR-375是一个在进化上高度保守的胰岛细胞特异性调控分子， miR-375在斑马鱼中决定胰岛发育，降低 miR- 375水平能抑制胰岛细胞的聚集，在人类中调整胰岛素分泌。 miR-375在其他模式生物和人类中的作用一致，提示 miR-375的功能从斑马鱼到人类是保守的。正是这种功能的重要性， miRNA吸引了很多科研人员通过多种途径、从多种角度、利用多种模式生物来探讨 miRNA的起源、作用机制和功能。

截至 2009年 3月 6日，由 Sanger研究中心建立的 miRNA数据库 (miRbase Release 12.0) 中已经收录了 8619条 miRNA序列。然而，与新 miRNA的频频发现相比， miRNA的功能研究相对缓慢，已知确切功能的 miRNA还是少数。 miRNA的功能研究，一是要确定 miRNA发挥调控作用的目标基因，二是要对 miRNA进行定量分析，研究其自身的时空表达调控。因为 miRNA表达的时序性和组织特异性能够揭示其在组织和细胞中的特异性功能。导致 miRNA功能研究进展缓慢的主要原因，一是因为 miRNA的作用目标难以确定；二是由于 miRNA太短，其扩增和定量分析远比长链信使 RNA困难。

目前 miRNA的扩增和定量分析均以逆转录 PCR为基础。因为 miRNA没有 poly-A尾， miRNA的逆转录方法与 mRNA有所不同，主要有两种策略：一种是用多聚腺苷酸激酶给 miRNA的 3' -末端加上 Poly- A尾，用 Ol igo-dT及逆转录酶来合成与 miRNA互补的 cDNA。另一种方法是用特异性引物进行逆转录，这种引物包含一段和特定 miRNA的 3'端互补的序列和一个颈环（Loop ) 结构。因为 miRNA太短，无法设计一对引物。因此无论用哪种方法逆转录，都必须在逆转录引物中设计一段通用序列（universal tag ) ，通过逆转录将通用序列引入 cDNA。然后用 miRNA特异引物作为上游引物，通用引物作为下游引物，进行 PCR扩增。

由于 miRNA的 Poly-A加尾和逆转录反应的效率都不是百分之百，这些额外的通用序列使逆转录引物过长，可能导致逆转录效率进一步下降，对定量分析结果的准确性产生不利影响。而且更为严重的是会带来非特异性扩增、假阳性和假阴性等问题。因为相同的通用引物序列难以适应所有的 miRNA序列：某些 miRNA的特异引物会与通用引物发生错配，产生引物二聚体，出现非特异性扩增和假阳性结果。另外， PCR反应中上下游引物的解链温度（Melting temperature, 简称 Tm值）相差最好不能超过 2°C，而使用通用引物扩增，必然造成某些 miRNA 的特异引物与通用引物的 Τπι值差异过大，无法扩增而出现假阴性结果。

发明内容

针对 PCR等现有核酸扩增技术在应用于扩增寡核苷酸和 miRNA时均存在一定困难的问题，本发明提出一种新型核酸扩增方法，称为聚合酶-内切酶链式反应（Polymerase- endonuclease Chain Reaction, 简称 PECR ) ，或者聚合酶-内切酶扩增反应（ Polymerase-endonuclease ampl ification reaction, 简称 PEAR )。利用耐热 DNA聚合酶和耐热限制性内切酶的协同作用，仅用一条特异性探针，就能够实现以指数模式扩增特定的目标寡核苷酸。 PECR反应进稈在热循环的控制下进行，扩增速率完全取决于反应体系中目标核酸的初始浓度。这种方法能够快速，准确，灵敏地扩增和定量短链核酸分子，包括寡核苷酸、短链 DNA、 miRNA和 siRNA等，可广泛应用于分子生物学研究。

本发明是采用以下的技术方案实现的：一种利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，该方法包括：

( 1 ) 反应混合物的构成：

①包含目标序列 X的目标核酸，目标核酸为单链或双链核酸，目标序列 X长度为 8〜50碱基或碱基对，其 Tm值的范围为 36〜79°C _;

②探针 X ' R ' X ' ，其中 X ' 为与目标序列 X互补的序列，探针 X ' R ' X ' 是单链 DNA, 含有两个串联重复的 Γ ，在这两个重复序列之间有一个限制性内切酶的识别位点的互补序列 R ' ；

③耐热 DNA聚合酶；

④耐热限制性内切酶； ⑤四种三磷酸脱氧核糖核苷酸： dATP, dGTP, dCTP和 dTTP;

⑥适当的缓冲液：

(2)热循环反应：将所述反应混合物在 60Ό至 99°C预变性 0〜600秒后，再进行 1〜100个热循环处理，热循环包括如下四个步骤：

①变性（Denaturing): 保温于高于目标核酸分子的 Tm值 5°C以上的温度，温度范围为 60〜 99 °C, 持续时间 1〜60秒；

②退火（Annealing): 保温于目标核酸分子的 Tm值上下 5°C以内的温度，温度范围为 35〜 68 °C, 持续时间 1〜60秒；

③延伸（Elongation): 保温于高于目标核酸分子的 Tm值 5Γ以上的温度，且为所述 DNA聚合酶的最适工作温度，温度范围为 45〜89°C，持续时间 1〜60秒；

④切割（Cleaving): 保温于高于目标核酸分子的 Tm值 5°C以上的温度，且为所述限制性内切酶的最适工作温度，温度范围为 45〜89Γ，持续时间 1〜300秒；

所述步骤①、 ③、 ④的温度均显著高于步骤②的退火温度，至少相差 10°C。按照①至④进行变性、退火、延伸和切割，使目标分子成倍扩增，扩增产物是双链分子 XRX/X' R' X' ，双链目标分子 X/X' 或单链目标分子 X。

本发明中，所述的耐热 DNA聚合酶没有链置换活性，最好采用热启动型 DN'A聚合酶，所述的耐热限制性内切酶是双链内切酶。

所述的目标核酸可以为任何 DNA分子，包括寡核苷酸、基因组 DNA、线粒体 DNA、由 mRNA、 microRNA或 siRNA逆转录而来的 cDNA、以及其它任何人工合成的或者天然的 DNA分子。

所述目标核酸也可以为 RNA分子，包括 mRNA、 microRNA和 siRNA, 以及其它任何 RNA分子，同时在所述反应混合物中包含一种能够直接延伸 RNA分子的 DNA聚合酶。即 PECR反应也可以用于直接扩增 RNA，特别是 miRNA或者 siRNA等小分子 RNA。

所述的探针可以含有两个或两个以上串联重复的目标序列的互补序列，如 A'，在这些重复序列之间均有一个耐热内切酶的识别位点，如 R'，其通式可表示为 A'- (R'A')„，其中 n为大于等于 1的正整数。使用这种含有多个重复序列的探针，能够使每个循环的扩增速率更快。

所述的探针可以含有两种或两种以上不同的目标序列的互补序列，例如 A'、 B'、 C'等，在这些序列之间至少有一个耐热内切酶的识别位点，如 R'，其通式可表示为 A'- (R'B')„， B'R'A'- (R'B ，或 A'R'B'- (R'C')„，等等，其中 n为大于或等于 1的正整数。使用这种含有多种目标序列的探针，能够扩增产生多种目标序列，并实现输入特定目标序列的寡核苷酸扩增产生其他目标序列。

所述的探针末端或中间可以含有同位素标记的核苷酸，则该标记的核苷酸可被定点引入到扩增产物中，用放射性检测方法进行检测。

所述的反应混合物中可以加入一种或一种以上能与双链 DNA特异性地结合的荧光染料，包括但不仅限于 Sybr Green I和 Sybr Green I I，使反应混合物的荧光密度随着所述 PECR反应的发生而增强，荧光信号可被荧光检测仪器或实时荧光定量 PCR仪检测，并可对目标寡核苷酸的初始分子数以及扩增产物进行定量分析。

所述的探针末端或中间可以连接一种或多种化学基团，包括但不限于荧光基团、淬灭基团、生物素、地高辛、氨基酸、氨基、氨基 C3、氨基 C6、氨基 C12、氨基 C18、荃基、羧基、糖环、肽链、肽核酸等。

所述的探针末端或中间可以含有荧光基团和淬灭基团标记，荧光基团和淬灭基团分别位于酶切位点的两侧，则扩增产物中酶切位点被切割而使得荧光基团和淬灭基团分开，使反应混合物的荧光密度增强，荧光信号可被荧光检测仪器或实时荧光定量 PCR仪检测，并可对目标寡核苷酸的初始分子数以及扩增产物进行定量分析。

所述的目标寡核苷酸末端或中间含有荧光基团和淬灭基团标记，则扩增产物被切割而使得荧光基团和淬灭基团分开，使反应混合物的荧光密度增强，荧光信号可被荧光检测仪器或实时荧光定量 PCR仪检测，并可对目标寡核苷酸的初始分子数以及扩增产物进行定量分析。

所述的探针中的酶切位点可以被甲基化：若被甲基化，则该位点不能被所述内切酶切割，但在被去甲基化后又能够被切割，或者通过 PECR反应产生的扩增产物中的酶切位点未被甲基化，因此能够被切割。

所述的探针可被固定在基因芯片或其他固体材料的平面或颗粒表面，扩增产物可用基因芯片检测方法进行检测，对大量不同的目标寡核苷酸的进行高通量检测分析。基因芯片载体材料有硅系材料如硅 /二氧化硅薄膜、单晶硅基片、硅纳米线等，导电金属如金、铂等，碳材料如石墨、碳纳米管等，以及导电树脂，等等。有些材料也可被制成颗粒或磁珠，将探针连接在其表面，使 PECR反应能够在这些材料的表面进行。

所述的探针末端可以与纳米材料连接，用纳米材料特性来检测 PECR反应，或者用 PECR反应实现对纳米材料的控制。纳米材料是指由尺寸小于 lOOnm即 0. 1- lOOnm的超细颗粒构成的具有小尺寸效应的零维、一维、二维、三维材料的总称。纳米材料的形状包括纳米线、纳米棒、纳米管、纳米带、纳米颗粒、纳米薄膜、纳米晶体、纳米非晶体、纳米纤维、纳米块体等，例如但不限于纳米碳管，纳米富勒烯（如碳六十），纳米陶瓷，纳米金属颗粒，纳米氧化锌颗粒，纳米二氧化硅，纳米二氧化钛及纳米四氧化三铁等。纳米材料还包括生物纳米材料即生物大分子，如多肽链、多糖、氨基多糖和核酸等。

PECR产物可用聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称 PAGE ) 检测，配制浓度为 12%〜15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，用 250〜300V电压电泳 20〜40分钟，然后采用以下方法之一使 DNA条带显现：

( 1 ) 用溴化乙锭染料对凝胶进行染色，然后用紫外凝胶成像系统对 DNA条带进行观察和拍照；

( 2 ) 用 Sybr Green I或 Sybr Green I I染料对凝胶进行染色，然后用紫外凝胶成像系统对 DNA条带进行观察和拍照；

( 3 ) 用银染法对凝胶进行染色使 DNA条带显影；

( 4 )在 PECR反应体系中掺入放射性同位素标记的单核苷酸，电泳之后用放射自显影技术成像。

PECR产物也可以进行实时荧光定量检测。与实时荧光定量 PCR技术类似，实时荧光定量 PECR也可以采用两种方法：

( 1 ) 在反应混合物中直接加入荧光染料：

在 PECR反应体系中加入 Sybr Green荧光染料，如 Sybr Green I或 Sybr Green II。 Sybr Green 是一种，能与双链 DNA的小沟特异性地结合，与双链 DNA亲和力很高，而与单链 DNA结合力很低。在 PECR反应开始时探针是单链的， Sybr Green与探针结合力很低，因此荧光强度较弱。而随 PECR反应循环不断将单链探针 X' R' X'转换为双链产物 X/X'， Sybr Green与产物结合力很高，荧光强度大大增强，从而可用荧光定量 PCR仪实时检测。实时定量 PECR在 ABI 7500型或者其他型号定量 PCR仪上进行。

( 2 ) 采用荧光基团和淬灭基团标记 PECR探针：

由于 Sybr Green荧光染料具有与任何双链 DNA非特异性结合的特点，因此上述采用 Sybr Green荧光染料进行核酸定量分析的方法，如果发生假阳性或非特异性扩增，则无法与真正的阳性反应相互区分。为了更精确地用 PECR技术对寡核苷酸进行定量分析，本发明采用荧光基团（flourophore ) 和淬灭基团（quencher ) 标记 PECR探针。所用的荧光基团包括但不限于 6-carboxyfluorescein简称 FAM) , Tetrachl orof 1 uoresce i n (简称 TET) , hexachlorofluorescein (简称 HEX) , TexasRed, Ν, Ν, Ν;Ν' -tetramethyl-6^-carboxyrhodamine(简称 TAMRA)， 6-carboxy- X-rhodamine (简称 R0X) , 2' 7' -dimethoxy-4' 5' -dichloro-6-carboxyfluorescein(简称 JOE) , indodicarbocyanine 3( 简称 Cy3)， indodicarbocyanine5(f¾f iCy5) , 3- (-carboxy - pentyl) -3' -ethyl- 5， 5' - dimethyloxacarbocyanine (歸尔 CyA) ;6-carboxyrhodamine (简称 R6G) , fluorescein isothiocyanate (简称 FITC) ,等。所述萍灭基团包括但不限于 TARMA, Iowa Black (简称 IWB)等。

PECR反应的目标核酸可为任何 DNA分子，包括寡核苷酸、基因组 DNA，线粒体 DNA，由 _mRNA、 microRNA或 siRNA逆转录而来的 cDNA、以及其它任何 DNA分子。 PECR反应也可以用于直接扩增 RNA, 特别是 miRNA或者 siRNA等小分子 RNA。对于不同的目标核酸所采用的技术方案如下： ( 1 ) 对于长度为 8〜50碱基对的单链或双链寡核苷酸的扩增采用技术方案 PECR;

( 2 ) 对于 mi croRNA或 siRNA , 采用技术方案 RT- PECR，先将 microRNA或 siRNA逆转录为 cDNA 并进行扩增，或者采用技术方案 RD-PECR直接扩增目标 RNA;

( 3 ) 对于长度超过 50碱基对的长链核酸，本发明只能扩增其 3 ' 末端长度为 8〜50碱基对的特异序列，而不能扩增其全长序列；

( 4 ) 对于长链目标 DNA或 cDNA中间的一段特异序列，首先用识别位点与目标序列紧密相邻的限制性内切酶切割目标 DNA或 cDNA , 使目标序列暴露于 3 ' 末端，然后再用 PECR技术方案扩增。

本发明首次提出聚合酶-内切酶链式反应即 PECR技术，是一种新型核酸扩增技术。本发明与其它核酸扩增技术的区别以及本发明的有益效果是：

( 1 ) PECR与现有的 DNA扩增技术比较： PCR技术通过热循环将线性或环形 DNA扩增为线性单拷贝 DNA片段； RCA技术通过等温反应将环形 DNA扩增为线性多拷贝串联重复 DNA分子， LAMP 技术通过等温反应将线形 DNA扩增为线性多拷贝串联重复 DNA; EXPAR技术通过等温反应，利用串联重复 DNA扩增寡核苷酸：本发明提出的 PECR技术则通过热循环反应，利用串联重复 DNA探针扩增小分子核酸，因此 PECR技术是核酸扩增技术家族中的重要成员。

( 2 ) PECR反应与 PCR技术的比较： PECR反应原理与 PCR完全不同， PECR与 PCR主要的不同之处在于： ① PCR仅依赖于耐热 DNA聚合酶， PECR不仅依赖于耐热 DNA聚合酶，而且依赖于耐热限制性内切酶； ② PCR至少需要一对引物，而 PECR只需要一条探针； ③ PCR对引物进行延伸，而 PECR对目标 DNA进行延伸； ④ PCR无法直接扩增长度太短的核酸，而 PECR专门用于直接扩增长度较短的核酸，特别是寡核苷酸和小 RNA; ⑤ PCR扩增产物一般比引物长，而 PECR方案之一即 PECR的扩增产物比探针更短； ⑥ PCR每个循环扩增产物最多只能增加一倍，而在 PECR中，利用含有多个串联重复序列的探针，可实现每个循环扩增产物增加两倍以上。

( 3 ) PECR反应与含有耐热内切酶的 PCR反应的比较：在专利 " COUPLED POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION ENDONUCLEASE DIGESTION- LIGASE DETECTION REACTION PROCESS "

( PCT/US2000/007133 ) 中，描述了含有耐热内切酶的 PCR反应。该方法可消除或显著降低非特异性 PCR扩增产物的形。尽管在反应体系中都同样采用了 DNA聚合酶和耐热限制性内切酶，但本发明的 PECR反应与上述含有耐热内切酶的 PCR反应在原理上有根本的区别：含有耐热内切酶的 PCR反应，其基本原理仍然还是 PCR反应，耐热限制性内酶在反应中的作用是辅助性的，目的是通过酶切消除或降低含有内切酶识别位点的非目标 DNA的扩增；而在 PECR反应中，耐热限制性内切酶的作用不是消除非目标 DNA的扩增，而是实现目标 DNA指数扩增所必须的关键酶。

( 4 ) PECR方法与 EXPAR方法的比较：在专利 " Isot hermal react ions for the Amplification of oligonucleotides" (PCT/US04/02718) 中描述了一种恒温指数扩增反应即 EXPAR。本发明 PECR与 EXPAR反应采用了相同的探针设计策略，但 PECR与 EXPAR存在根本区别：① EXPAR进行等温扩增，反应过程不可控，而 PECR反应过程依靠热循环精密控制； ② EXPAR 必须用单链切口酶，而 PECR采用双链内切酶： ③ EXPAR无法使用热启动型 DNA聚合酶，只能进行手动热启动，而 PECR可釆用热启动型 DNA聚合酶由 PCR仪自动热启动： ④ EXPAR反应存在严重的非特异性背景扩增和假阳性问题，而 PECR反应没有非特异性背景扩增，能够克服假阳性。

尽管 Tan等报道了 EXPAR反应的非特异性扩增可以通过对反应进行手动热启动（Manual Hot Start) 来减少或者消除，但同时也指出了该反应无法像 PCR那样，利用热启动 DNA聚合酶由 PCR仪自动进行 ( Tan E, et al, Specific versus nonspecific isothermal DNA amplification through thermophilic polymerase and nicking enzyme activities. Biochemistry. 2008, 47(38)： 9987-9999) 。这是因为热启动聚合酶，即通过化学修饰或者抗聚合酶抗体（antipolymerase) 构建的可逆失活的 DNA聚合酶，无法用于 EXPAR。因为这些热启动聚合酶必须在 9CTC以上保温 10分钟左右激活，而 EXPAR反应所依赖的具有链置换活性的 Bst聚合酶和切口酶 Nb. BstNBI, 都是不能耐受 90°C以上高温的。目前虽然有能耐受 9CTC以上高温的链置换 DNA聚合酶（如 VentRexo- ) ，却没有能耐受 90Ό以上高温的切口酶可用。因此该反应的热启动必须采用手动方法进行，即先将反应混和液加热到预定温度，然后再加入 DNA 聚合酶和切口酶。手动热启动不仅操作十分麻烦，而且无法在实时荧光定量分析中实施，大大限制了该方法的推广应用。

与此相反， PECR可采用热启动 DNA聚合酶和高度耐热的内切酶，由 PCR仪自动进行热启动，具有内在的可靠性和方便性。 PECR反应的过程通过热循环控制。就像在 PCR技术中所作的那样，反应循环的各个参数，包括退火温度，退火时间和循环数目，都可以根据不同目标寡核苷酸的长度、序列、解链温度和初始分子数进行灵活调节，以满足扩增不同目标寡核苷酸的要求。

总之， PECR方法是一项既简单又有效的新型核酸扩增技术。通过 PECR方法，用一条序列特异性探针，选择性地扩增任何一段己知序列的小分子核酸。 PECR方法能够快速、准确、灵敏地扩增和定量短链核酸，包括寡核苷酸和 miRNA。 PECR技术很容易实现完全自动化和实时定量检测，能广泛应用于分子生物学的各个领域，例如，用于扩增和定量 miRNA等小分子 RNA，进行基因表达调控研究，用于基因芯片技术，进行大规模、高通量的核酸检测，以及用于扩增寡核苷酸、智能化核酸检测技术和分子计算研究等。

附图说明

图 1为聚合酶 -内切酶扩增反应即 PECR的原理示意图：

图 2为 PECR探针的荧光标记方法；图 3为对实施例 1反应原理的验证；

图 4为实施例 1中不同起始浓度目标寡核苷酸扩增反应电泳结果；

图 5为逆转录 PECRgpRT- PECR扩增 miRNA的原理示意图；

图 6为用 PECR直接扩增 RNASPRD-PECR的原理示意图；

图 7为实施例 4中 PECR产物的实时荧光检测。

具体实施方式

实施例 1

本实施例为聚合酶 -内切酶扩增反应即 PECR,采用耐热 DNA聚合酶和能切割双链 DNA的耐热限制性内切酶扩增寡核苷酸。本实施例中，要求耐热 DNA聚合酶和耐热限制性内切酶均能耐受 50Ό以上高温，最适工作温度为 45°C-89°C。耐热 DNA聚合酶包括但不限于 Taq DNA聚合酶， DyNAzyme I I DNA聚合酶 ®， LA Taq DNA聚合酶 ®， Pfu DNA聚合酶 ®, VentR DNA聚合酶 ®， Deep VentR DNA聚合酶 ®，等等。本方案如果采用热启动型 DNA聚合酶则更佳，热启动型 DNA聚合酶包括但不限于热启动 Taq DNA聚合酶， DyNAzyme I I热启动 DNA聚合酶 ®， KOD Xtreme热启动 DNA 聚合酶 ®， Phusion DN'A聚合酶 ®, PfuUltra热启动型 DNA聚合酶 ®， Platinum DNA聚合酶 ©和 Thermo- Start DNA聚合酶 ®，等等。耐热限制性内切酶包括但不限于 PspGI, ApeKI, BstUI, BstNI, wol, Phol, Tsel, Tsp45I, Tsp509I, TspRI和 Tfi l，等等。该方法包括：

( 1 ) 反应体系的构成：

①包含目标序列 X的目标核酸，目标核酸为单链或双链核酸，目标序列 X长度为 8〜50碱基或碱基对，其 Tm值的范围为 36〜79 V

②探针 X ' R' X ' ，其中 X ' 为与目标序列 X互补的序列，探针 X ' R ' X ' 是单链 DNA，含有两个串联重复的 X ' ，在这两个重复序列之间有一个限制性内切酶的识别位点的互补序列 R ' ：

③耐热 DNA聚合酶，如 Taq DNA polymerase;

④耐热限制性内切酶，如 PspGI :

⑤四种三磷酸脱氧核糖核苷酸： dATP, dGTP, dCTP, dTTP_;

⑥适当的缓冲液；

( 2 )热循环反应：将所述反应混合物在 60〜99Ό的温度下预变性 0秒钟至 20分钟后，再进行 1〜 100个热循环处理，热循环包括如下四个步骤：

①变性（Denaturing) : 保温于高于目标核酸分子的 Tm值 5°C以上的温度，温度范围 60〜 99 °C , 持续时间 1秒钟〜 1分钟：

②退火 (Anneal ing) : 保温于目标核酸分子的 Tm值上下 5Γ以内的温度，温度范围 35〜68 °C，持续时间 1秒钟〜 1分钟； ③延伸（Elongat i on) : 保温于目标核酸分子的 ½值上下 5 °C以内的温度，且为所述 DNA聚合酶的最适工作温度，范围为 45 89 °C，持续时间 1秒钟〜 1分钟；

④切割 (Cl eav i ng) : 保温于目标核酸分子的 Tm值上下 5°C以内的温度，且为所述限制性内切酶的最适工作温度温度，范围为 45 89Ό，持续时间 1秒钟〜 5分钟。

所述步骤①、 ③、 ④的温度均显著高于步骤②的退火温度，至少相差 10°C。按照①至④ 进行变性、退火、延伸和切割，使目标分子成倍扩增。扩增产物是双链分子 XRX/X ' R ' X ' ，双链目标分子 X/X ' 或单链目标分子 X

实际操作中如果步骤④的切割温度与步骤③的延伸温度相同，则步骤④与步骤③可以合并为一个步骤：步骤③延伸和切割，持续时间为 1秒钟〜 5分钟。

PECR反应技术方案的扩增机理如图 1所示：目标分子（X ) 与探针（X' R' X' ) , 箭头所示方向为 5'末端 3'末端。第一个循环中，探针和目标寡核苷酸通过变性和退火，形成部分双链 DNA分子的 X/X' R' X'。如果目标分子与探针 3'端结合，在 dNTPs存在的条件下，此部分双链 DNA分子中的目标分子 X被耐热 DNA聚合酶延伸，形成一个完全双链 DNA分子 XRX/X' R' X'。然后此双链 DNA分子被耐热限制性内切酶切割， DNA双链在两个重复序列之间断裂，形成两个双链目标分子 X/X ' , 因此反应混合物中目标寡核苷酸 X的分子数增加。于是反应进入第二个循环，幵始新一轮的退火，延伸、切割和链置换反应，反应混合物中目标分子 X的分子数呈指数模式增加，扩增产物为双链目标分子 X/X'

在步骤②中，如果一个目标分子 X与探针 5'端的互补序列结合，如图 1右上角所示，则目标分子不会被延伸，因为它没有为 DNA聚合酶提供引物 /模板结构。这会对 PECR的反应动力学产生影响，但并不会导致 PECR扩增无法进行。因为：（1 )通常目标分子具有多个拷贝，根据概率原理，必然有近一半的目标分子与探针 3'端的互补序列结合，并启动反应；（2 ) 即使反 •应中只有一个目标分子，经过若干个循环的热变性和退火后，它也终究会与探针 3'端结合，并启动反应。

另外，在步骤③和步骤④中，如果某些目标分子被延伸但没有被切割，所形成的产物带有重复序列。如图 1右下角所示，在后续热循环中含有重复序列的目标分子会再次与探针配对，并可能会通过目标与探针所含重复序列的滑动机制，使重复数目继续增加，产生多拷贝双链重复序列。这种扩增方式是线性的，对 PECR反应的动力学会产生影响，使扩增速度降低。但在内切酶含量充分的条件下，绝大部分双链重复序列都会被切割，因此不会影响 PECR扩增的指数特征。这些多拷贝重复序列在后续循环中再被内切酶切断，产生多个产物 X/X'，对扩增速度具有促进作用。为了便于分析检测，或者在后续反应中应用，必要的情况下，在热循环结束后可以再进行 10 60分钟的切割反应，使产生的多拷贝重复序列尽可能都被切割成单拷贝目标分子 χ/χ'。

PECR产物可用聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称 PAGE)检测，配置长度为 5〜15'Cm,浓度为 12%〜 15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，用 250〜300V电压电泳 20〜40分钟，然后采用以下方法之一使 DNA条带显现：

( 1 ) 用溴化乙锭染料对 DNA进行染色，然后用紫外凝胶成像系统对 DNA条带进行观察和拍照；

( 2 ) 用 Sybr Green I或 Sybr Green II染料对 DNA进行染色，然后用紫外凝胶成像系统对 DNA 条带进行观察和拍照；

( 3 ) 用银染法对 DNA条带显影；

PECR产物也可以进行实时荧光定量检测。与实时荧光定量 PCR技术类似，实时荧光定量

PECR也可以采用两种方法：

( 1 ) 在反应混合物中直接加入荧光染料：

在 PECR反应体系中加入 Sybr Green荧光染料，如 Sybr Green I或 Sybr Green I I。 Sybr Green 是一种，能与双链 DNA的小沟特异性地结合，与双链 DNA亲和力很高，而与单链 DNA结合力很低。在 PECR反应开始时探针是单链的， Sybr Green与探针结合力很低，因此荧光强度较弱。而随 PECR反应循环不断将单链探针 X' R' X'转换为双链产物 X/X'， Sybr Green与产物结合力很高，荧光强度大大增强，从而可用荧光定量 PCR仪实时检测。实时定量 PECR在 ABI 7500型或者其他型号定量 PCR仪上进行。

( 2 ) 采用荧光基团和淬灭基团标记 PECR探针：

由于 Sybr Green荧光染料具有与任何双链 DNA非特异性结合的特点，因此上述采用 Sybr Green荧光染料进行核酸定量分析的方法，如果发生假阳性或非特异性扩增，则无法与真正的阳性反应相互区分。为了更精确地用 PECR技术对寡核苷酸进行定量分析，本发明采用荧光基团（flourophore ) 和淬灭基团（quencher ) 标记 PECR探针。所用的荧光基团包括但不限于 6-carboxyf luorescein ( 简称 FAM) , Tetrachlorof luorescein ( 简称 TET)， hexachlorof luorescein (简称 HEX) , N, N, Ν ; Ν' -tetramethyl-6-carboxyrhodamine (简称 TAMRA)， 6-carboxy-X-rhodami ne (简称 R0X) , 2' 7' -dimethoxy- 4' 5' -dichloro-6-cai"boxyf luorescein (简称 JOE) , indodicarbocyanine 3(f¾¾Cy3), indodicarbocyanine 5(f¾¾Cy5)， fluorescein isothiocyanate (简称 FI C), 3_ (- carboxy - pentyl) _3' -ethyl- 5, 5' - dimethyloxacarbocyanine (简称 CyA)； Texas Red, 6-carboxyrhodamine (简称 R6G)等。所述淬灭基团包括但不限于 TARMA, Iowa Black (IWB) 等。

荧光标记技术原理如图 2所示，荧光基团位于探针的 5'端，而淬灭基团位于探针中间，在限制性内切酶切割位点 R'或单链切口酶切割位点 R下游 5〜10个碱基处，荧光基团与淬灭基团距离较近。在 PECR反应幵始时，荧光基团所吸收的能量大部分通过荧光共振能量转移

( Fluorescence Resonance Energy Transfer, 简称 FRET ) 原理转移到猝灭基团，以热量的形式释放，荧光发生在一个较低的水平，如果将淬灭基团放在探针 3'端则距离太远，淬灭效果不佳。随着 PECR反应循环，单链探针不断被转换为双链，并被限制性内切酶或单链切口酶切割，造成荧光基团和猝灭基团分离，荧光基团所吸收的能量以荧光的形式释放，荧光信号大大增强，从而可用荧光定量 PCR仪实时检测。

具体地，本实施例中 dNTPs、 DyNAzyme I I热启动 DNA聚合酶、耐热限制性内切酶 PspGI及其缓冲液均购自 New England Biolabs北京分公司。人工合成的寡核苷酸和探针购自 Invi trogen上海分公司。所采用的目标寡核苷酸（X)与人类 mi croRNA hsa-mi R-375序列相同，其序列为： 5' -TTTGTTCGTTCGGCTCGCGTGA-3' ，为了使扩增速率更快，我们采用的探针

( X' R' X' R' X' ) 含有 3个拷贝的 hsa-miR-375的互补序列，其序列为：

5' -TCACGCGAGCCGAACGMCAAA-CCAGG-TCACGCGAGCCGAACGAACA -CCAGG-TCACGCGAGCCGAACGAAC AAA- 3'

下划线所示为内切酶 PspGI的识别和切割位点。

在总体积为 20uL的反应混合物中加入 100 nM探针， 10— '至 10— ¹² uM的目标寡核苷酸， 0. 05Uni t/uL热启动 Taq DNA聚合酶， 0. lUni t/uL耐热限制性内切酶 PspGI, l x DNA聚合酶的缓冲液和四种 dNTPs各 50uM。反应条件为 90°C预变性 10分钟，并激活 DyNAzyme I I热启动 DNA聚合酶，然后进行 20- 40个热循环： 90Γ变性 5秒， 45Ό-65Ό退火 5-30秒， 75°C延伸和切割 5分钟。循环结束后再切割 30分钟。 PECR反应产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ) 检测。

为了验证 PECR反应机理，我们用完全的 PECR反应混合物和缺少聚合酶、 PspGI或目标 X 的不完全的 PECR反应混合物进行了扩增，并采用不同初始浓度的目标寡核苷酸进行 PECR扩增反应。如图 3中箭头所示，电泳检测只在完全 PECR反应中可见一个 22bp的条带，相应的 PECR 产物为 χ/χ'；其上方有一个 44bp条带，是部分酶切产物。而当反应混合物中缺少聚合酶、 PspGI 或目标分子 X时，没有 PECR产物出现。表明 PECR扩增依赖于两种酶、探针和目标核酸的存在。图 4表明， PECR扩增反应是一个高度灵敏的反应，可检测 10— '° uM的目标寡核苷酸。

实施例 2

本实施例为逆转录 PECR ( Reverse transcript PECR , 简称 RT- PECR ) ，通过逆转录 PECR 反应扩增 RNA分子，特别是 mi RNA或者 si RNA等小分子 RNA。以 miRNA为例，其反应原理如图 5所示，该方法包括以下歩骤：

①先用多聚腺苷酸聚合酶（poly- A polymerase , 简称 PAP ) 对全部 mi RNA添加 poly- A尾： ②用 01 igo-dT和逆转录酶将全部 miRNA反转录为与之互补的 cDNA;

③用 RNA酶 H处理逆转录产物，除去 RNA分子，获得与 miRNA互补的 cDNA;

④然后采用 PECR扩增与特定目标 miRNA序列互补的目标 cDNA, 具体同实施例 1。

实施例 3

本实施例为 RNA指导的 PECR ( RNA- direct PECR, 简称 RD- PECR ) ，不经过逆转录，直接用 PECR探针扩增 RNA分子。以 miRNA为例，其反应原理如图 6所示，该方法包括如下四个步骤：

①将目标 RNA直接与 PECR探针混合，通过变性和退火，目标 miRNA与 PECR探针结合，形成 miRNA/DNA杂合双链分子；

②在反应体系中加入一种能够直接延伸 RNA分子的 DNA聚合酶，如大肠杆菌 DNA聚合酶 I。将第一个热循环的温度设置为大肠杆菌 DNA聚合酶 I的最适工作温度即 37°C，大肠杆菌 DNA聚合酶 I 将与探针 3 ' 端结合的 miRNA分子延伸，形成与目标 miRNA序列相同的目标 DNA分子；

③然后用 RNA酶 H处理延伸产物，除去 RNA分子，获得与目标 miRNA序列相同的目标 DNA分子；

④然后采用采用 PECR扩增与特定目标 miRNA序列相同的目标 DNA，具体同实施例 1。

实施例 4

选取 4个斑马鱼 miRNA作为目标，分别为 miR- 375， miR- 430a， miR- 206和 miR- 124。其中 miR- 375和 miR_430a的序列和功能都己知，以便进行技术验证。 miR- 430对斑马鱼胚胎中不再需要的母源 mRNA进行清除。 miR-375是胰岛发育所必须的，降低 miR-375水平能抑制胰岛细胞的聚集。另外，已经发现 miR- 430a, miR- 206和 miR- 124分别在斑马鱼胚胎受精后 4h， 12h和 24h 出现表达高峰。本实例用逆转录 PCR和逆转录 PECR两种技术对斑马鱼早期胚胎 miRNA表达进行对比分析。

( 1 ) 总 RNA提取和逆转录

采用 Appl ied Biosystems mirVana miRNA Isolation Kit ( Cat«AM1560 ) ，提取受精后. lh、 2h、 4h、 12h、 24h的斑马鱼胚胎 miRNA。用 Appl ied Biosystems TaqMan miRNA Reverse Transcript ion Ki t (Cat# 4366596 ) 将 miRNA逆转录为 cDNA, 作为 PCR和 PECR反应的模板。

( 2 ) 实时定量 PCR

用甘油三磷酸脱氢酶（简称 GAPDH ) 基因作为内对照，对所有的 miRNA样品的逆转录产物 cDNA用 Appl ied Biosystems TaqMan MicroRNA Assay ( Cat# 4383443 ) 和 TaqMan Universal PCR Master Mix (Cat# 4364338 ) 进行定量检测，对样品进行标准化，并为本实例作为外对照。

( 3 ) 实时定量 PECR

用实时定量 PECR对所有的 miRNA样品的逆转录产物 cDNA进行定量分析，反应体系和热循环参数与实施例 1相同。其中的探针用荧光基团和淬灭基团标记。所有反应包括无模板对照组，都至少重复三次。扩增反应在 Appl ied Biosystems 7500型实时定量 PCR系统中进行，并实时检测反应混合物荧光密度随 PECR循环的变化。

( 4 ) 结果与分析

如图 7所示，实时荧光检测证实荧光密度随着 PECR循环数增强。将实时定量 PECR和实时定量 PCR的结果进行比较分析，实时定量 PECR和实时定量 PCR的结果是基本一致，表明实时定量 PECR的准确性很高。

用逆转录 PCR扩增 mi RNA，必须使用通用引物。这很容易带来非特异性扩增、假阳性和假阴性等问题。而采用逆转录 PECR扩增 miRNA , 不需使用通用引物，仅需一条带有重复序列的特异性探针就可对目标 cDNA进行扩增和定量分析。这意味着 PECR技术具有操作简便、高效和稳定的特点，并且扩增特异性更高，因此 PECR技术在 mi RNA扩增和定量分析中具有良好的应用前學

本说明书以和权利要求中，除文中清楚地说明外，否则单数形式可包括复数形式。例如，在反应体系中加入 "耐热内切酶" 时，包括加入 1种或 1种以上耐热内切酶混合物；在反应体系中加入 "耐热 DNA聚合酶" 时，包括加入 1种或 1种以上耐热 DNA聚合酶混合物； " 1个目标分子"包括 1种或 1种以上的目标分子； " 1条探针 "包括 1种或 1种以上的探针，等等。

另外，本发明并不仅限于这里所陈述的特定的配置，说明书和权利要求书种所用的名词术语仅用于阐述特定的具体实施方式，而不是要使本发明仅限于所用的名词术语所限定的范围，因为本发明的范围仅由所附加的权利要求及其他与之相当的条款来限定。

Claims

WO 2010/075659 权. 禾 ij 要求书 PCT/CN2009/000362

1、一种利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，该方法包括：

(1) 反应混合物的构成：

①包含目标序列 X的目标核酸，目标核酸为单链或双链核酸，目标序列 X长度为 8〜50碱基或碱基对，其解链温度即 Tm值的范围为 36〜79Ό_;

②探针 X' R' X' ，其中 X' 为与目标序列 X互补的序列，探针 X' R' X' 是单链 DNA，含有两个串联重复的 X' ，在这两个重复序列之间有一个限制性内切酶的识别位点的互补序列 R' ；

③耐热 DNA聚合酶；

④耐热限制性内切酶；

⑤四种三磷酸脱氧核糖核苷酸： dATP， dGTP, dCTP和 dTTP;

⑥适当的缓冲液；

(2)热循环反应：将所述反应混合物在 6CTC至 99°C预变性 0〜600秒后，再进行 1至 100个热循环处理，热循环包括如下 4个步骤：

①变性（Denaturing): 保温于高于目标核酸分子的解链温度即 Tm值 5Ό以上的温度，温度范围为 60〜99°C，持续时间 1〜60秒；

②退火（Annealing): 保温于目标核酸分子的解链温度即 Tm值上下 5°C以内的温度，温度范围为 35〜68 °C，持续时间 1〜60秒；

③延伸（Elongation): 保温于高于目标核酸分子的解链温度即 Tm值 5°C以上的温度，且为所述 DNA聚合酶的最适工作温度，范围为 45〜89°C，持续时间 1〜60秒：

④切割（Cleaving): 保温于高于目标核酸分子的解链温度即 Tm值 5°C以上的温度，且为所述限制性内切酶的最适工作温度，范围为 45〜89°C，持续时间 1〜300秒- 所述步骤①、 ③、 ④的温度均高于步骤②的退火温度，至少相差 10Ό。按照①至④进行变性、退火、延伸和切割，使目标分子成倍扩增，扩增产物是双链分子 XRX/X' R' X' , 双链目标分子 X/X' 或单链目标分子 X。
2、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述耐热 DNA聚合酶没有链置换活性，所述耐热限制性内切酶是双链内切酶。
3、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述的目标核酸为 DNA分子，包括寡核苷酸、基因组 DNA、线粒体 DNA、由 mRNA、 microRNA或 siRNA逆转录而来的 cDNA、以及其它任何人工合成的或者天然的 DNA分子。

4、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述目标核酸为 RNA分子，包括 mRNA、 niicroRNA和 siRNA, 以及其它任何 RNA分子，同时在所述反应混合物中包含一种能够直接延伸 RNA分子的 DNA聚合酶。

5、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述探针含有两个或两个以上串联重复的目标序列的互补序列 , ( Α ' ) ，在这些重复序列之间均有一个耐热内切酶的识别位点（R ' ) ，其通式为 A ' - (R ' A ' )„，其中 _η为大于 1的正整数。

6、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述探针含有两种或两种以上不同的目标序列的互补序列（Α ' ， B ' , C ' ) ，在这些序列之间至少有一个耐热内切酶的识别位点（R ' ) ，其通式为 A ' - (R ' B ' )„， B ' R ' A ' - (R， Β，）„，或 A ' R ' B， -（R， C )„，其中 n为大于或等于 1的正整数。
7、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述探针末端或中间含有同位素标记的核苷酸。
8、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述反应混合物中加入一种与双链 DNA特异性结合的荧光染料。
9、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述探针末端或中间连接有化学基团。
10、根据权利要求 9所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述化学基团之一是荧光基团。
1 1、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述目标核酸末端或中间含有荧光基团。
12、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述探针中的酶切位点被甲基化。
13、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小■的方法，其特征在于：所述探针被固定在基因芯片或其他固体材料表面。
14、根据权利要求 1所述的利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小 RNA的方法，其特征在于：所述探针末端与纳米材料连接。