CN113528626A

CN113528626A - 一种合成核酸的方法

Info

Publication number: CN113528626A
Application number: CN202110749188.XA
Authority: CN
Inventors: 刘孟坛
Original assignee: Changsha Zhifei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Liu Mengtan
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113528626B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种合成核酸的方法。本发明的合成核酸的方法，包括以下步骤：S1、在寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP包含有茎环结构和单链末端结构的核苷酸片段形成寡核苷酸引物；S2、靶标核酸在步骤S1的寡核苷酸引物和聚合酶下进行聚合反应。本发明的方法解决了现有等温核酸扩增技术的扩增靶标区域长度有明显限制、需要多酶多引物等缺点。

Description

一种合成核酸的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种合成核酸的方法。

背景技术

核酸可被分为两大类：脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，其在生物体内担负着贮存和传递遗传信息的作用，同时在生物合成和复制以及生命活动中蛋白质的表达中有重要作用，对各种生物生存及其遗传变异发挥着重要作用。

核酸合成技术，尤其是核酸扩增技术的出现为核酸的分析和检测提供了重要手段。目前，聚合酶链式反应(Rolymerase Chain Reaction，PCR)是体外核酸扩增最常用的方法。PCR能以微量核酸为模板实现指数级扩增，而且产物相对简单，被广泛用作核酸扩增和克隆的工具。但是PCR需要高温解链，低温结合引物，适温延伸，精确温度控制导致PCR离不开精密调控温度的仪器设备，在一定程度上限制了该技术的应用。

等温核酸扩增技术是一种新型的核酸合成技术，在一个特定的温度进行核酸合成，克服了PCR方法需要特殊仪器的弊端，受到越来越多研究者的青睐。如依赖于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA)、滚环扩增技术(RollingCircleAmplification，RCA)、环介导等温扩增技术(Loop-mediated IsothermalAmplification，LAMP)、基于变性泡的链置换扩增技术(Strand Exchange Amplification，SEA)等。等温核酸扩增技术摆脱了对热循环仪的依赖，可用于检测某些特定的病原体或疾病标记，为人类健康，食品安全和环境保护提供了便利。

依赖于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA)，通过AMV逆转录酶、RNase H、T7RNA聚合酶等稳定持续的酶促反应，在恒温条件下在体外将核酸序列进行大量复制。但是，NASBA需要加入三种酶，且需要三种酶在同一温度、同一反应体系下被激活，需要复杂条件优化且检测成本高。

滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)，基于自然界微生物环状DNA的复制过程，通过体外模拟这种环状DNA的扩增而发明。通过引物设计和在DNA聚合酶的作用下将靶标核酸大量扩增出来。但RCA只能扩增环状的核酸靶标，这些缺点限制了RCA应用范围。

环介导恒温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)，针对靶标核酸序列，设计至少4条引物或6条引物来特异性识别靶标目标片段的6个、7个或者8个区域，在聚合酶作用下将靶标核酸扩增。具有简单、特异、高效、迅速的特点，已经被广泛应用于微生物检测，疾病诊断等领域。但是，由于需要设计4条或6条引物，LAMP法不能有效实现小的靶标区域的扩增(如小于100bp)，同时，多条引物的设计也比较复杂，这些缺点使LAMP的应用受到一定限制。

基于变性泡的链置换扩增技术(Strand Exchange Amplification，SEA)，是基于DNA呼吸作用引起的变性泡介导的等温核酸扩增。利用双链间的动态解离原理，设计的引物通过侵入变性泡结构，在聚合酶作用下进行扩增。SEA法有效实现短于100bp靶标核酸区域的扩增，但是不能有效扩增较长的靶标区域，在实际应用中受到一定限制。

目前等温核酸扩增技术过程中存在扩增靶标区域长度有明显限制、需要多种酶多引物等缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种合成核酸的方法，解决了现有等温核酸扩增技术中存在扩增靶标区域长度有明显限制、需要多种酶多引物等缺点。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了一种合成核酸的方法，包括以下步骤：

S1、合成寡核苷酸引物：在寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP包含有茎环结构和单链末端结构的核苷酸片段形成寡核苷酸引物；

S2、合成核酸：靶标核酸在步骤S1的寡核苷酸引物和聚合酶下进行聚合反应。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述步骤S1中寡核苷酸引物FP至少含有M区、1区和2区，所述2区和M区的5’侧相连，所述1区和2区的5’侧相连，所述M区是含有与靶标核酸MC区互补的核苷酸序列，所述2区是含有茎环结构的核苷酸序列，所述1区是含有单链末端结构的核苷酸序列；所述寡核苷酸引物BP至少含有N区、3区和4区，所述3区和N区的5’侧相连，所述4区和3区的5’侧相连，所述N区是含有与靶标核酸相同的N区核苷酸序列，所述3区是含有茎环结构的核苷酸序列，所述4区是含有单链末端结构的核苷酸序列。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP含有靶标识别、茎环结构和单链末端结构的核苷酸序列。在反应温度下，所述靶标识别核苷酸序列能够特异识别靶标核酸并与靶标核酸互补配对，启动核酸聚合反应，所述茎环结构核苷酸序列是形成分子内杂交的序列，启动分子内杂交，所述单链末端结构是游离的核苷酸序列，有利于与互补核酸杂交。

本发明利用寡核苷酸引物合成核酸的原理：有靶标核酸存在时，在反应温度下，寡核苷酸引物与靶标核酸互补延伸，形成3’端和5’端含有茎环结构和单链末端结构形式的合成核酸结构，合成核酸与寡核苷酸引物通过碱基互补配对延伸，形成双链结构，双链结构在反应温度下动态解离和分子内杂交，再次形成两端含有茎环结构和单链末端结构形式的合成核酸结构。通过循环聚合反应，实现不同长度靶标核酸的合成。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述步骤S2中等温核酸合成的具体步骤包括四部分：

第一部分：

1)、靶标核酸在反应温度下动态解离，寡核苷酸引物FP的M区与靶标核酸的MC区退火，在聚合酶作用下延伸，得到第一合成核酸；所述第一合成核酸的3’端含有靶标核酸的NC区，5’端含有1区、2区和M区；

2)、第一合成核酸与靶标核酸在反应温度下动态解离，寡核苷酸引物BP的N区与第一合成核酸的NC区退火，在聚合酶作用下延伸，得到第二合成核酸；所述第二合成核酸含有靶标核酸的MC区和N区，所述第二合成核酸的3’端含有1C区和2C区，5’端含有3区和4区；

3)、所述第二合成核酸与靶标核酸在反应温度下动态解离，通过分子内杂交形成3’端和5’端含有茎环结构和单链末端结构形式；

4)、寡核苷酸引物FP与第二合成核酸的1C、2C和MC区通过碱基互补配对，在聚合酶作用下延伸，形成双链结构，一条含4区、3区、N区和MC区、2C区、1C区；一条含1区、2区、M区和NC区、3C区、4C区；

5)、步骤4)形成的双链结构在反应温度下动态解离，通过分子内杂交形成3’端和5’端含有茎环结构和单链末端结构形式；

6)、步骤3)到步骤5)循环聚合反应，合成核酸产物；

和；第二部分：

1)、靶标核酸在反应温度下动态解离，寡核苷酸引物BP的N区与靶标核酸的NC区退火，在聚合酶作用下延伸，得到第一合成核酸；所述第一合成核酸的3’端含有靶标核酸MC区，5’端含有4区、3区和N区；

2)、第一合成核酸与靶标核酸在反应温度下发生动态解离，寡核苷酸引物FP的M区与第一合成核酸的MC区退火，在聚合酶作用下延伸，得到第二合成核酸；所述第二合成核酸含有靶标核酸M区和NC区，所述第二合成核酸的5’端含有1区和2区，3’端含有3C区和4C区；

4)、寡核苷酸引物BP与第二合成核酸的4C、3C和NC区通过碱基互补配对，在聚合酶作用下延伸，形成双链结构，一条含1区、2区、M区和NC区、3C区、4C区；一条含4区、3区、N区和MC区、2C区、1C区；

6)、步骤3)到步骤5)循环聚合反应，合成核酸产物。

和；第三部分：

第一部分的步骤5)中，步骤4)形成的双链结构在反应温度下动态解离，通过分子内杂交形成两端含有茎环结构和单链末端结构形式，进入第二部分反应过程，通过第二部分的步骤3)到步骤5)循环聚合反应，合成核酸产物。

和；第四部分：

第二部分的步骤5)中，步骤4)形成的双链结构在反应温度下动态解离，通过分子内杂交形成两端含有茎环结构和单链末端结构形式，进入第一部分反应过程，通过第一部分的步骤3)到步骤5)循环聚合反应，合成核酸产物。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述反应温度为37℃～73℃。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述反应温度为60℃～67℃。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述寡核苷酸引物的Tm值≥反应温度。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述靶标核酸为双链核酸或单链核酸。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述合成的核酸的区域长度为40～300bp。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述合成的核酸的区域长度为45～223bp。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，当靶标核酸为RNA时，所述聚合酶具有反转录酶活性或加入反转录酶的酶反应温度与聚合酶反应温度相同。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述合成核酸的方法包括在体系中添加促进核酸动态解离的促进剂，如甜菜碱和PEG-200。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述合成核酸的方法处于一个等温条件下或几个温度条件下。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述寡核苷酸引物为直接合成或间接合成。

作为本发明所述合成核酸的方法的优选实施方式，所述寡核苷酸引物由酶反应间接合成。例如寡核苷酸引物由连接酶连接形成或由聚合酶聚合形成。

本发明还提供了一种利用寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP合成核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述的寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)、本发明合成核酸过程中只需要一种聚合酶，在一个等温条件下或几个温度条件下都可以实现核酸合成，其反应具有成本低和操作简单的优点；

2)、本发明寡核苷酸引物含有茎环结构和单链末端结构，通过核酸分子内杂交和核酸分子间杂交，实现40-300bp长度靶标区域的扩增；

3)、本发明合成核酸过程中只需要用到一对引物，不需要环介导恒温扩增技术中4条到6条引物，降低了反应成本，且引物设计简单。

附图说明

图1为本发明寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP的结构示意图；

图2为本发明合成核酸方法的原理示意图；

图3为实施例1合成核酸方法中的荧光信号图(3a)和对应电泳图(3b)；图(3a)中：曲线1代表反应体系中加入靶标核酸、聚合酶、引物FP和BP，曲线2代表反应体系中加入靶标核酸和聚合酶，曲线3代表反应体系中加入聚合酶、引物FP和BP，曲线4代表反应体系中加入靶标核酸、引物FP和BP，曲线5代表反应体系中以水代替靶标核酸的空白对照体系；电泳图(3b)条带为图3a对应电泳图；

图4为实施例2不同浓度的甜菜碱体系的荧光信号图(曲线1代表加入甜菜碱终浓度为1.2mol/L体系的荧光信号图，曲线2代表加入甜菜碱终浓度为0.8mol/L体系的荧光信号图，曲线3代表加入甜菜碱终浓度为1.8mol/L体系的荧光信号图，曲线4代表没有甜菜碱体系的荧光信号图，曲线5代表以水代替靶标的体系的荧光信号图，曲线6是没有加引物FP和BP体系的荧光信号图)；

图5为实施例3扩增不同长度(45bp，81bp，141bp，223bp)的靶标核酸区域的荧光信号图(曲线1为靶标区域长度为45bp体系的荧光信号图，曲线2为靶标区域长度为81bp体系的荧光信号图，曲线3为靶标区域长度为141bp体系的荧光信号图，曲线4为靶标区域长度为223bp体系的荧光信号图，曲线5-8为靶标区域不同长度的对照体系的荧光信号图)；

图6为实施例4特异性检测实验的荧光信号图(曲线1为靶标铜绿假单胞菌体系的荧光信号图，曲线2为大肠杆菌体系的荧光信号图，曲线3为枯草芽孢杆菌体系的荧光信号图，曲线4为空白对照体系的荧光信号图)；

图7为实施例5不同浓度RNA靶标核酸的荧光信号图(曲线1-6分别代表靶标浓度为20pmol/L、2pmol/L、200fmol/L、20fmol/L、2fmol/L、200amol/L体系的荧光信号图，曲线7代表以水代替靶标，1.2mol/L甜菜碱的空白对照体系的荧光信号图，曲线8代表以水代替靶标，0mol/L甜菜碱的空白对照体系的荧光信号图)；

图8为实施例6不同温度下靶标核酸的荧光信号图(曲线1是在65℃反应90分钟体系的荧光信号图，曲线2是在不同等温条件[65℃(30分钟)-60℃(30分钟)-67℃(30分钟)]体系的荧光信号图，曲线3是在60℃反应90分钟体系的荧光信号图，曲线4是在67℃反应体系的荧光信号图，曲线5是在65℃阴性对照体系的荧光信号图，曲线6是在65℃以水代替靶标的空白对照的荧光信号图)；

图9为实施例7多靶标检测的荧光信号图(曲线1为D管(鸡、鱼和驴混合靶标和其对应引物的体系)的荧光信号图，曲线2为A管(鸡和其对应引物的体系)的荧光信号图，曲线3为B管(鱼和其对应引物的体系)的荧光信号图，曲线4为C管(驴和其对应引物的体系)的荧光信号图，曲线5为E管(只有三种动物混合引物的对照体系)的荧光信号图，曲线6为空白对照体系的荧光信号图)；

图10为实施例8突变碱基检测的荧光信号图(曲线1为丙肝病毒靶标体系的荧光信号图，曲线2为丙肝病毒单碱基突变靶标1体系的荧光信号图，曲线3为丙肝病毒单碱基突变靶标2体系的荧光信号图，曲线4为以水代替靶标的空白对照体系的荧光信号图)。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均在常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本说明书所用术语“茎环”结构，是指一种寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该寡核苷酸分子内部的两个互补区域形成，其还包括至少一个“环”结构，即非互补的核苷酸分子(单链区域)。

本说明书所用术语“解离”是指双链核苷酸变为单链核苷酸的过程。

下述实施例中生物样品的核酸提取物(DNA和RNA)样品均通过市售核酸提取试剂盒提取获得。

在实施例中的基础反应液，是指核酸合成反应的反应液，其中各物质及浓度为：20mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷(pH 8.8)，0.1％Triton X-100，10mmol/L硫酸铵，4mmol/L硫酸镁，20mmol/L氯化钾，1X Eva Green染料，0.8mmol/L dNTPs，4U Bst聚合酶和1.2mol/L甜菜碱。

实施例1、一种合成核酸的方法

利用提取的金黄色葡萄球菌fib基因作为靶标核酸(5’-CATCAACTGCTGATGCGAGCGAAGGATACGGTCCAAGAGAAAAGAAACCAGTGAGTATTAATCACAATATCGTAGAGTACA-3’，即SEQ IDNO.1)，设计寡核苷酸引物FP和BP，进行扩增反应。

一种合成核酸的方法，包括以下步骤：

S1、合成寡核苷酸引物：在寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP的5’端包含有茎环结构和单链末端结构的核苷酸片段形成寡核苷酸引物；寡核苷酸引物FP至少含有M区、1区和2区，所述2区和M区的5’侧相连，所述1区和2区的5’侧相连，所述M区是含有与靶标核酸MC区互补的核苷酸序列，所述2区是含有茎环结构的核苷酸序列，所述1区是含有单链末端结构的核苷酸序列；所述寡核苷酸引物BP至少含有N区、3区和4区，所述3区和N区的5’侧相连，所述4区和3区的5’侧相连，所述N区是含有与靶标核酸相同的N区核苷酸序列，所述3区是含有茎环结构的核苷酸序列，所述4区是含有单链末端结构的核苷酸序列；其中，寡核苷酸引物FP为黄色葡萄球菌引物FP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(5’-GGCAGAGCGATGACTCCTCGATTCAGTTCGGTCATCGCATCAACTGCTGATGCGAGC-3’)，寡核苷酸引物BP为黄色葡萄球菌引物BP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(5’-CGTCTCGCCTGAACTGCTACGTCTCCTTGGGTTCAGGTGTACTCTACGATATTGTGAT-3’)。

S2、核酸合成：

1)配制22uL的反应液，除不加Bst聚合酶外，其他组分与基础反应液相同。

2)在上述5管反应液中，分别加入①1μL(10nmol/L)靶标核酸提取物、4U Bst聚合酶和1ul(400nmol/L)引物FP和BP，②1μL(10nmol/L)靶标核酸提取物和4UBst聚合酶、③4UBst聚合酶和1ul(400nmol/L)引物FP和BP，④1μL(10nmol/L)靶标核酸提取物和1ul(400nmol/L)引物FP和BP，⑤1ul水代替靶标核酸提取物。最后补充水至体系25uL，混匀反应液。

3)信号检测。利用ABI7300实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，65℃反应120分钟。

4)85℃灭活，终止扩增反应，扩增产物用15％的PAGE胶电泳，点样5uL，电压130V，电泳60分钟。

荧光信号图见图3a，在图中曲线1代表反应体系中加入靶标核酸、聚合酶、引物FP和BP，曲线2代表反应体系中加入靶标核酸和聚合酶，曲线3代表反应体系中加入聚合酶、引物FP和BP，曲线4代表反应体系中加入靶标核酸、引物FP和BP，曲线5代表反应体系中以水代替靶标核酸的空白对照体系。从图可以看出：只有在曲线1(有靶标核酸、聚合酶、引物FP和BP)的条件下荧光信号明显上升，表明发生了显著扩增反应，在曲线2、3、4和5(没有聚合酶、引物FP和BP或靶标核酸及空白对照体系)时，没有明显荧光信号上升，表明扩增反应没有有效进行，验证了本发明方法的可行性和正确性。图3b为图3a相应的电泳图，结果显示：只有在lane1(有靶标核酸、聚合酶、引物FP和BP)的条件下才有明显的扩增条带，在lane2-5中，没有明显扩增条带，电泳结果与荧光信号图一致，电泳再次验证了本发明方法的可行性和正确性。

实施例2、一种促进靶标核酸动态解离的促进剂

一种促进靶标核酸动态解离的促进剂包括甜菜碱和PEG-200。

本实施例利用提取的金黄色葡萄球菌fib基因作为靶标核酸(即SEQ ID NO.1)，金黄色葡萄球菌引物FP(即SEQ ID NO.2)、金黄色葡萄球菌引物BP(即SEQ ID NO.3)，进行扩增反应。

具体步骤如下：

(1)配制22uL的反应液，除不加甜菜碱外，其他组分与基础反应液相同。

(2)加入1ul(400nmol/L)引物FP和BP及1ul(10nmol/L)靶标核酸。

(3)反应液中分别加入1ul甜菜碱，使甜菜碱终浓度分别为0mol/L，0.8mol/L，1.2mol/L，1.8mol/L，补充水至体系25uL，混匀反应液。

(4)信号检测。同实施例1。

结果见图4。曲线1代表加入甜菜碱终浓度为1.2mol/L体系的荧光信号图，曲线2代表加入甜菜碱终浓度为0.8mol/L体系的荧光信号图，曲线3代表加入甜菜碱终浓度为1.8mol/L体系的荧光信号图，曲线4代表没有甜菜碱体系的荧光信号图，曲线5代表以水代替靶标的体系的荧光信号图，曲线6是没有加引物FP和BP体系的荧光信号图。从图中可以看出，对照体系没有明显荧光信号上升，在没有甜菜碱体系中，荧光信号在90分钟时也有上升，表明扩增反应发生，但是在加入浓度为0.8mol/L，1.2mol/L，1.8mol/L的甜菜碱体系的荧光信号较没有加甜菜碱的体系的荧光信号出现的早，说明甜菜碱作为一种促进核酸解链的试剂对扩增有明显促进作用。

实施例3、扩增不同长度的靶标核酸区域

本实施例扩增不同长度的铜绿假单胞菌的OPrI基因，在保守靶序列位点设计4对寡核苷酸引物，这些引物扩增不同长度的靶标核酸区域(45bp，81bp，141bp，223bp)。具体步骤如下：

(1)设计合成铜绿假单胞菌引物FP和BP；

(2)配制22uL的基础反应液；

(3)分别加入1uL(400nmol/L)铜绿假单胞菌引物FP和BP；

(4)加入1μL(10nmol/L)铜绿假单胞核酸提取物，补充水至体系25uL，混匀反应液；

(5)信号检测。同实施例1。

①其中扩增靶标区域长度为45bp的铜绿假单胞菌的OPrI基因的序列为5’-CCGAAGACGCAGCTGCTCGTGCTCAGGCTCGCGCTGACGAAGCCT-3’，即SEQ ID NO.4，铜绿假单胞菌引物FP1的序列为5’-GCGACGGTAGACAGGCTCGTTGGCAATAGTCTACCCCGAAGACGCAGCTGCTCGT-3’，即SEQID NO.5，铜绿假单胞菌引物BP1的序列为5’-GCGCGCGTGTTCAGGGTTGACGTCAGAGGAACACGAGGCTTCGTCAGCGCGAGCC-3’，即SEQ ID NO.6。

②其中扩增靶标区域长度为81bp的铜绿假单胞菌的OPrI基因的序列为5’-CTGTTCTGGCCACCGGTTGCAGCAGCCACTCCAAAGAAACCGAAGCTCGTCTGACCGCTACCGAAGACGCAGCTGCTCGTA-3’，即SEQ ID NO.7，铜绿假单胞菌引物FP2的序列为5’-GGCTCAGGGTAGACGCTCAGTCTGATTGGCAGGCGTCTACCCTGTTCTGGCCACCGGTTGC-3’，即SEQ ID NO.8，铜绿假单胞菌引物BP2的序列为5’-CAGGTCGCGTGTGTCAGGCTGCTGCCCTTGGGACACACGTACGAGCAGCTGCGTCTTCGG-3’，即SEQ IDNO.9；

③其中扩增靶标区域长度为141bp的铜绿假单胞菌的OPrI基因的序列为5’-AGCAGCCACTCCAAAGAAACCGAAGCTCGTCTGACCGCTACCGAAGACGCAGCTGCTCGTAGCAGCCACTCCAAAGAAACCGAAGCTCGTCTGACCGCTACCGAAGACGCAGCTGCTCGTGCTCAGGCTCGCGCTGACGAA-3’，即SEQ IDNO.10，铜绿假单胞菌引物FP3的序列为5’-CGTGGTCTGGGTAGACGCTGCAGGTCAGCTCCGTCTACCAGCAGCCACTCCAAAGAAACCG-3’，即SEQ ID NO.11，铜绿假单胞菌引物BP3的序列为5’-GACACTTGTGCGTGTTCAGTGCCTTGGGAACACGAACACGCTTCGTCAGCGCGAGCCTGAGC-3’，即SEQ ID NO.12；

④其中扩增靶标区域长度为223bp的铜绿假单胞菌的OPrI基因的序列为5’-CCAAAGAAACCGAAGCTCGTCTGACCGCTACCGAAGACGCAGCTGCTCGTAGCAGCCACTCCAAAGAAACCGAAGCTCGTCTGACCGCTACCGAAGACGCAGCTGCTCGTGCTCAGGCTCGCGCTGACGAAGCCTATCGCAAGGCTGACGAAGCTCTGGGCGCTGCTCAGGCTCAGGCTCGCGCTGACGAAGCCTATCGCAAGGCTGACGAAGCTCTGGGCGC-3’，即SEQID NO.13)，铜绿假单胞菌引物FP4的序列为5’-CGCAAGTGCTGGGTAGACGTTCAGTCGTCGGTGAGTCTACCCCAAAGAAACCGAAGCTCGTCT-3’，即SEQ ID NO.14，铜绿假单胞菌引物BP4的序列为5’-CCACCTCTGCGCGTGTTCAGGGTCACGCACTGCTCGAACACGGCGCCCAGAGCTTCGTCAGC-3’，即SEQ IDNO.15。

荧光信号结果见图5。曲线1为靶标区域长度为45bp体系的荧光信号图，曲线2为靶标区域长度为81bp体系的荧光信号图，曲线3为靶标区域长度为141bp体系的荧光信号图，曲线4为靶标区域长度为223bp体系的荧光信号图，曲线5-8为靶标区域不同长度的对照体系的荧光信号图。从图中可以看出，在80分钟时间内，曲线1-4的荧光信号都有明显的上升，说明靶标区域长度为45bp、81bp、141bp和223bp体系都得到了有效扩增。而45bp、81bp、141bp和223bp的靶标核酸区域的对照体系在检测时间内没有明显的扩增曲线。这个实验说明本发明能有效实现不同长度靶标区域的扩增。

实施例4、特异性检测实验

本实施例利用提取的铜绿假单胞菌的OPrI基因作为靶标核酸(即SEQ ID NO.7)，设计合成铜绿假单胞菌引物FP和BP。选择铜绿假单胞菌引物FP2(即SEQ ID NO.8)、铜绿假单胞菌引物BP2(即SEQ ID NO.9)，选择大肠杆菌核酸和枯草芽孢杆菌核酸作为阴性对照，以水代替靶标作为空白对照，验证本发明检测特异性。具体步骤如下：

(1)配制22uL的基础反应液；

(2)加入1ul(400nmol/L)绿假单胞菌引物FP2和BP2；

(3)4管反应液中，分别加入1ul(10nmol/L)的铜绿假单胞菌核酸提取物、大肠杆菌核酸提取物、枯草芽孢杆菌核酸提取物和水，补充水至体系25uL，混匀反应液；

(4)信号检测。同实施例1。

荧光信号结果见图6。曲线1为靶标铜绿假单胞菌体系的荧光信号图，曲线2为大肠杆菌体系的荧光信号图，曲线3为枯草芽孢杆菌体系的荧光信号图，曲线4为空白对照体系的荧光信号图。从图中可以看出，在反应时间100分钟内，只有铜绿假单胞菌核酸有明显荧光信号上升，随着时间延长，荧光信号逐渐增大，而大肠杆菌核酸、枯草芽孢杆菌核酸和空白体系样品没有明显荧光信号。说明本发明具有很好的检测特异性。

实施例5、扩增不同浓度的RNA靶标

本实施例利用提取的大肠杆菌的16S rRNA作为靶标核酸(序列：5'-GCUGUCGUCAGCUCGUGUUGUGAAAUGUUGGGUUAAGUCCCGCAACGAGCG-3'，即SEQ ID NO.16)。设计合成大肠杆菌引物FP和BP。大肠杆菌引物FP的序列为5’-CGGCCGGTAGACGGTACAGTGAGGGTGAGTCTACCGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTG-3’，即SEQ ID NO.17，大肠杆菌引物BP的序列为5’-CGTGGCGTGTTCGAGGTGCACGGCAATGCTCCGAACACGCGCTCGTTGCGGGACTTAACC-3’，即SEQ ID NO.18，进行扩增反应。具体步骤如下：

(1)配制22uL的基础反应液；

(2)加入1ul(400nmol/L)大肠杆菌引物FP和BP；

(3)分别加入1μL不同浓度的大肠杆菌16S rRNA(20pmol/L、2pmol/L、200fmol/L、20fmol/L、200amol/L、0mol/L)，补充水至体系25uL，混匀反应液；

(4)信号检测。同实施例1。

荧光信号结果见图7。曲线1-6分别代表靶标浓度为20pmol/L、2pmol/L、200fmol/L、20fmol/L、2fmol/L、200amol/L体系的荧光信号图，曲线7代表以水代替靶标，1.2mol/L甜菜碱的空白对照体系的荧光信号图，曲线8代表以水代替靶标，0mol/L甜菜碱的空白对照体系的荧光信号图。不同浓度的大肠杆菌16S rRNA有明显的荧光信号上升，在大肠杆菌16SrRNA浓度低至200amol/L时，也有明显荧光信号，浓度低的体系比浓度高的体系的荧光信号出现晚，空白体系没有明显的荧光信号。该方法的检测灵敏度可以达到200amol/L。

实施例6、不同温度对扩增的影响

本实施例利用提取的单链DNA的博卡病毒作为靶标核酸，序列为5’-CCAATCAGAATTGAGTATTAAACCTATATAAGCTGCTGCACTTCCTGATTCAATCAGACTGCATCCGGTC-3’，即SEQ IDNO.19)。设计合成博卡病毒引物FP和BP。博卡病毒引物FP的序列为5’-GGCTCCAGGGTAGACGCTCAGTCTGATTGGCAGGCGGTCTACCCCAATCAGAATTGAGTATTA-3’，即SEQ ID NO.20，博卡病毒引物BP的序列为5’-GCAGAGCGCGTGTTCAGGGTTGGGCACGTCAGAGGAACACGGACCGGATGCAGTCTGATTG-3’，即SEQ ID NO.21，同时用乙肝病毒作为阴性对照，以水代替博卡病毒作为空白对照，验证温度对扩增的影响。具体步骤如下：

(1)配制22uL的基础反应液；

(2)加入1ul(400nmol/L)博卡病毒引物FP和BP；

(3)在上述4管反应液中加入1μL(20nmol/L)博卡病毒核酸提取物、1管中加入乙肝病毒核酸提取物、1管中加入水，补充水至体系25uL,混匀反应液；

(4)利用ABI7300实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，4管靶标样品分别在60℃,65℃，67℃反应90分钟，和60℃、65℃、67℃各反应30分钟，阴性和空白对照体系在65℃反应90分钟。

荧光信号结果见图8，曲线1是在65℃反应90分钟体系的荧光信号图，曲线2是在不同温度条件[65℃(30分钟)-60℃(30分钟)-67℃(30分钟)]体系的荧光信号图，曲线3是在60℃反应90分钟体系的荧光信号图，曲线4是在67℃反应体系的荧光信号图，曲线5是在65℃阴性对照体系的荧光信号图，曲线6是在65℃以水代替靶标的空白对照的荧光信号图。结果发现：在60,65，67℃三个不同温度条件及温度组合下，靶标博卡病毒体系的荧光信号都有明显上升，其中，65℃和不同温度条件下的反应体系的荧光信号较60℃和67℃反应体系的荧光信号出现的早。阴性对照体系和空白对照体系在90分钟内没有明显检测信号出现。这个实验说明靶标在一个等温条件和不同温度条件下都能实现特异扩增。

实施例7、体系对多靶标的检测能力。

本实施例利用鸡(序列为5’-ACACCAATGATACTGAACCTATGAATACACAGACTTCAAGGACCTCTCAT-3’,即SEQ ID NO.22)、鱼(序列为5’-GAACAGTACGTGGTGGTGTCCAACTATAAGAAACAAGAGAACTCGGAGCT-3’，即SEQ ID NO.25)和驴(序列为5’-TGGCGGTGCTTTACATCCCTCTAGAGGAGCCTGTTCCGTAATCGATAAAC-3’,即SEQ ID NO.28)的核酸提取物作为靶标，及相应的引物：鸡引物FP(序列为5’-GGCAATGGGTAGACGCTCAGTCGTGCAGCTGCAGGCGTCTACCACACCAATGATACTGAACCT-3’，即SEQ ID NO.23)和鸡引物BP(序列为5’-GAGTTCCCGTGTGTCAGGTTGGACGGCCGTCTTGGGACACACGATGAGAGGTCCTTGAAGTCT-3’，即SEQ ID NO.24)、鱼引物FP(序列为5’-CGGTCTGGGTAGACGCTCAGTGCTCGACCAGGCGTCTACCGAACAGTACGTGGTGGTGT-3’，即SEQ ID NO.26)和鱼引物BP(序列为5’-CTGGTGGCGTGTGTCAACGGCTCGACCCTTGGGACACACGAGCTCCGAGTTCTCTTGTTT-3’，即SEQ ID NO.27)、驴引物FP(序列为5’-CAGGTCGCGTGTGTCAGGGTGGCAACGCTTGGGACACACGTGGCGGTGCTTTACATCCCT-3’，即SEQ ID NO.29)和驴引物BP(序列为5’-GCCTCTGGGTAGACGCTCAGTGGCAACTGCAGGCGTCTACCGTTTATCGATTACGGAACAG-3’，即SEQ ID NO.30)，检测本发明同一个体系中检测多个靶标的能力。以水代替靶标作为空白对照。具体步骤如下：

(1)配制22uL的基础反应液；

(2)6管反应液管中分别加入：1ul(400nmol/L)鸡引物FP和鸡引物BP及1ul(10nmol/L)鸡靶标(作为A管)、1ul(400nmol/L)鱼引物FP和鱼引物BP及1ul(10nmol/L)鱼靶标(作为B管)、1ul(400nmol/L)驴引物FP和驴引物BP及1ul(10nmol/L)驴靶标(作为C管)、1ul(400nmol/L)三种动物引物FP和BP及1ul(10nmol/L)三种动物混合靶标(作为D管)、1ul(400nmol/L)三种动物混合引物FP和BP(作为E管)、1ul水代替靶标作为空白对照(作为F管)；

(3)利用ABI7300实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，在65℃反应90分钟。

结果见图9所示，其中曲线1为D管(鸡、鱼和驴混合靶标和其对应引物的体系)的荧光信号图，曲线2为A管(鸡和其对应引物的体系)的荧光信号图，曲线3为B管(鱼和其对应引物的体系)的荧光信号图，曲线4为C管(驴和其对应引物的体系)的荧光信号图，曲线5为E管(只有三种动物混合引物的对照体系)的荧光信号图，曲线6为空白对照体系的荧光信号图。从结果可以得出：同时含有鸡、鱼和驴混合靶标的体系的荧光信号较单独含有其中任意一个靶标体系的荧光信号出现的早，而没有靶标的对照体系没有明显荧光信号。这个结果说明本发明可以实现在同一个反应体系中，实现多个靶标的同时检测，减少检测多个靶标的工作量。

实施例8、寡核苷酸引物由连接酶连接形成验证对突变碱基的检测能力。

本实施例利用合成的丙肝病毒序列作为靶标核酸(序列为：5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAG-3’，即SEQ ID NO.31)，丙肝病毒引物FP和BP采用连接酶连接形成，丙肝病毒引物连接片段FP1(序列为：5’-GGCCAGGGTAGACGCTCAGCGGAGGCAGGCGTCTACCGGGAGAGCCA-3’，即SEQ ID NO.32)和FP2(序列为：5’-TAGTGGTCTG-3’，即SEQ IDNO.33)，在有靶标存在时，丙肝病毒引物连接片段FP1和FP2连接形成丙肝病毒引物FP(5’-GGCCAGGGTAGACGCTCAGCGGAGGCAGGCGTCTACCGGGAGAGCC ATAGTGGTCTG-3’，即SEQ IDNO.34)，丙肝病毒引物连接片段BP1(序列为：5’-CAGGCGCGTGTGTCAGGCTGCTGTGGTCGGGACACACGCTGGCAATTC-3’，即SEQ ID NO.35)和BP2(序列为：5’-CGGTGTACTC-3’，即SEQ ID NO.36)在有靶标存在时，丙肝病毒引物连接片段BP1和BP2连接形成丙肝病毒引物BP(5’-CAGGCGCGTGTGTCAGGCTGCTGTGGTCGGGACACACGCTGGCAATTCCGGTGTACTC-3’，即SEQ ID NO.37)，同时设计合成丙肝病毒突变靶标1(序列为：

，即SEQ ID NO.38，与SEQ ID NO.31相比为3’端单碱基突变，斜体下划线碱基为突变碱基)，丙肝病毒突变靶标2(序列为：

即SEQ ID NO.39，与SEQ ID NO.31相比为5’端单碱基突变，斜体下划线碱基为突变碱基)，验证连接酶连接寡核苷酸引物检测靶标单碱基突变的能力。具体步骤如下：

S1:寡核苷酸引物由连接酶连接形成

(1)8uL连接反应液(100mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷(pH7.6),10mmol/L氯化镁,10mmol/L二硫苏糖醇,0.1mmol/L dNTPs，1.2U T4 DNA连接酶)；

(2)加入1ul 800nmol/L的丙肝病毒引物连接片段FP1、FP2和BP1、BP2；

(3)上述不同反应液管中，分别加入2ul(10nmol/L)丙肝病毒靶标、丙肝病毒突变靶标1、丙肝病毒突变靶标2或水；

(4)水浴锅37℃水浴30分钟，85℃处理5分钟，灭活连接酶；

S2:核酸合成

(1)配制21uL的基础反应液；

(2)不同反应管中，分别加入上述连接反应的产物4ul；

(3)利用ABI7300实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，65℃反应90分钟。

本实施例结果如图10，图中曲线1为丙肝病毒靶标体系的荧光信号图，曲线2为丙肝病毒单碱基突变靶标1体系的荧光信号图，曲线3为丙肝病毒单碱基突变靶标2体系的荧光信号图，曲线4为以水代替靶标的空白对照体系的荧光信号图。从图中可以看出，丙肝病毒靶标体系的荧光信号较靶标突变体系的荧光信号出现的早，说明寡核苷酸连接片段以靶标为模板连接形成寡核苷酸引物可以进行核酸合成反应，而在靶标发生突变时，不能发生连接反应形成寡核苷酸引物，从而不能有效进行核酸合成。这个实验说明寡核苷酸引物可以间接形成，而且本方法具有检测靶标单碱基突变的能力。

本发明用到的寡核苷酸引物FP和BP如表1所示(其中，有双划线碱基为单链末端碱基，有波浪线碱基为茎环结构碱基，有间隔线碱基为靶标互补碱基)。

表1

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 长沙智飞生物科技有限公司

<120> 一种合成核酸的方法

<130> 2021.05.08

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌fib基因

<400> 1

catcaactgc tgatgcgagc gaaggatacg gtccaagaga aaagaaacca gtgagtatta 60

atcacaatat cgtagagtac a 81

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌引物FP

<400> 2

ggcagagcga tgactcctcg attcagttcg gtcatcgcat caactgctga tgcgagc 57

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌引物BP

<400> 3

cgtctcgcct gaactgctac gtctccttgg gttcaggtgt actctacgat attgtgat 58

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 靶标区域长度为45bp的铜绿假单胞菌的OPrI基因

<400> 4

ccgaagacgc agctgctcgt gctcaggctc gcgctgacga agcct 45

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌引物FP1

<400> 5

gcgacggtag acaggctcgt tggcaatagt ctaccccgaa gacgcagctg ctcgt 55

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌引物BP1

<400> 6

gcgcgcgtgt tcagggttga cgtcagagga acacgaggct tcgtcagcgc gagcc 55

<210> 7

<211> 81

<212> DNA

<213> 靶标区域长度为81bp的铜绿假单胞菌的OPrI基因

<400> 7

ctgttctggc caccggttgc agcagccact ccaaagaaac cgaagctcgt ctgaccgcta 60

ccgaagacgc agctgctcgt a 81

<210> 8

<211> 61

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌引物FP2

<400> 8

ggctcagggt agacgctcag tctgattggc aggcgtctac cctgttctgg ccaccggttg 60

c 61

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌引物BP2

<400> 9

caggtcgcgt gtgtcaggct gctgcccttg ggacacacgt acgagcagct gcgtcttcgg 60

<210> 10

<211> 141

<212> DNA

<213> 靶标区域长度为141bp的铜绿假单胞菌的OPrI基因

<400> 10

agcagccact ccaaagaaac cgaagctcgt ctgaccgcta ccgaagacgc agctgctcgt 60

agcagccact ccaaagaaac cgaagctcgt ctgaccgcta ccgaagacgc agctgctcgt 120

gctcaggctc gcgctgacga a 141

<210> 11

<211> 61

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌引物FP3

<400> 11

cgtggtctgg gtagacgctg caggtcagct ccgtctacca gcagccactc caaagaaacc 60

g 61

<210> 12

<211> 62

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌引物BP3

<400> 12

gacacttgtg cgtgttcagt gccttgggaa cacgaacacg cttcgtcagc gcgagcctga 60

gc 62

<210> 13

<211> 223

<212> DNA

<213> 靶标区域长度为223bp的铜绿假单胞菌的OPrI基因

<400> 13

ccaaagaaac cgaagctcgt ctgaccgcta ccgaagacgc agctgctcgt agcagccact 60

ccaaagaaac cgaagctcgt ctgaccgcta ccgaagacgc agctgctcgt gctcaggctc 120

gcgctgacga agcctatcgc aaggctgacg aagctctggg cgctgctcag gctcaggctc 180

gcgctgacga agcctatcgc aaggctgacg aagctctggg cgc 223

<210> 14

<211> 63

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌引物FP4

<400> 14

cgcaagtgct gggtagacgt tcagtcgtcg gtgagtctac cccaaagaaa ccgaagctcg 60

tct 63

<210> 15

<211> 62

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌引物BP4

<400> 15

ccacctctgc gcgtgttcag ggtcacgcac tgctcgaaca cggcgcccag agcttcgtca 60

gc 62

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 大肠杆菌16S rRNA

<400> 16

gcugucguca gcucguguug ugaaauguug gguuaagucc cgcaacgagc g 51

<210> 17

<211> 57

<212> DNA

<213> 大肠杆菌引物FP

<400> 17

cggccggtag acggtacagt gagggtgagt ctaccgctgt cgtcagctcg tgttgtg 57

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 大肠杆菌引物BP

<400> 18

cgtggcgtgt tcgaggtgca cggcaatgct ccgaacacgc gctcgttgcg ggacttaacc 60

<210> 19

<211> 70

<212> DNA

<213> 博卡病毒

<400> 19

ccaatcagaa ttgagtatta aacctatata agctgctgca cttcctgatt caatcagact 60

gcatccggtc 70

<210> 20

<211> 63

<212> DNA

<213> 博卡病毒引物FP

<400> 20

ggctccaggg tagacgctca gtctgattgg caggcggtct accccaatca gaattgagta 60

tta 63

<210> 21

<211> 61

<212> DNA

<213> 博卡病毒引物BP

<400> 21

gcagagcgcg tgttcagggt tgggcacgtc agaggaacac ggaccggatg cagtctgatt 60

g 61

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 鸡的核酸提取物

<400> 22

acaccaatga tactgaacct atgaatacac agacttcaag gacctctcat 50

<210> 23

<211> 63

<212> DNA

<213> 鸡引物FP

<400> 23

ggcaatgggt agacgctcag tcgtgcagct gcaggcgtct accacaccaa tgatactgaa 60

cct 63

<210> 24

<211> 63

<212> DNA

<213> 鸡引物BP

<400> 24

gagttcccgt gtgtcaggtt ggacggccgt cttgggacac acgatgagag gtccttgaag 60

tct 63

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 鱼的核酸提取物

<400> 25

gaacagtacg tggtggtgtc caactataag aaacaagaga actcggagct 50

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 鱼引物FP

<400> 26

cggtctgggt agacgctcag tgctcgacca ggcgtctacc gaacagtacg tggtggtgt 59

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 鱼引物BP

<400> 27

ctggtggcgt gtgtcaacgg ctcgaccctt gggacacacg agctccgagt tctcttgttt 60

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> 驴的核酸提取物

<400> 28

tggcggtgct ttacatccct ctagaggagc ctgttccgta atcgataaac 50

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 驴引物FP

<400> 29

caggtcgcgt gtgtcagggt ggcaacgctt gggacacacg tggcggtgct ttacatccct 60

<210> 30

<211> 61

<212> DNA

<213> 驴引物BP

<400> 30

gcctctgggt agacgctcag tggcaactgc aggcgtctac cgtttatcga ttacggaaca 60

g 61

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 丙肝病毒

<400> 31

gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 50

<210> 32

<211> 47

<212> DNA

<213> 丙肝病毒引物连接片段FP1

<400> 32

ggccagggta gacgctcagc ggaggcaggc gtctaccggg agagcca 47

<210> 33

<211> 10

<212> DNA

<213> 丙肝病毒引物连接片段FP2

<400> 33

tagtggtctg 10

<210> 34

<211> 57

<212> DNA

<213> 丙肝病毒引物FP

<400> 34

ggccagggta gacgctcagc ggaggcaggc gtctaccggg agagccatag tggtctg 57

<210> 35

<211> 48

<212> DNA

<213> 丙肝病毒引物连接片段BP1

<400> 35

caggcgcgtg tgtcaggctg ctgtggtcgg gacacacgct ggcaattc 48

<210> 36

<211> 10

<212> DNA

<213> 丙肝病毒引物连接片段BP2

<400> 36

cggtgtactc 10

<210> 37

<211> 58

<212> DNA

<213> 丙肝病毒引物BP

<400> 37

caggcgcgtg tgtcaggctg ctgtggtcgg gacacacgct ggcaattccg gtgtactc 58

<210> 38

<211> 50

<212> DNA

<213> 丙肝病毒突变靶标1

<400> 38

gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg taattgccag 50

<210> 39

<211> 50

<212> DNA

<213> 丙肝病毒突变靶标2

<400> 39

gggagagccg tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 50

Claims

1.一种合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述步骤S1中寡核苷酸引物FP至少含有M区、1区和2区，所述2区和M区的5’侧相连，所述1区和2区的5’侧相连，所述M区是含有与靶标核酸MC区互补的核苷酸序列，所述2区是含有茎环结构的核苷酸序列，所述1区是含有单链末端结构的核苷酸序列；所述寡核苷酸引物BP至少含有N区、3区和4区，所述3区和N区的5’侧相连，所述4区和3区的5’侧相连，所述N区是含有与靶标核酸相同的N区核苷酸序列，所述3区是含有茎环结构的核苷酸序列，所述4区是含有单链末端结构的核苷酸序列。

3.如权利要求1或2所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中核酸合成的具体步骤包括四部分：

第一部分：

6)、步骤3)到步骤5)循环聚合反应，合成核酸产物；

和；第二部分：

6)、步骤3)到步骤5)循环聚合反应，合成核酸产物。

和；第三部分：

第一部分的步骤5)中，形成的两端含有茎环结构和单链末端结构形式进入第二部分反应过程，通过第二部分的步骤3)到步骤5)循环聚合反应，合成核酸产物。

和；第四部分：

第二部分的步骤5)中，形成的两端含有茎环结构和单链末端结构形式进入第一部分反应过程，通过第一部分的步骤3)到步骤5)循环聚合反应，合成核酸产物。

4.如权利要求3所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述反应温度为37℃～73℃。

5.如权利要求4所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述反应温度为60℃～67℃。

6.如权利要求1～3任一项所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述寡核苷酸引物的Tm值≥反应温度。

7.如权利要求1～3任一项所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述靶标核酸为双链核酸或单链核酸。

8.如权利要求1～3任一项所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述合成的核酸的区域长度为40～300bp。

9.如权利要求8所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述合成的核酸的区域长度为45～223bp。

10.如权利要求1～3任一项所述的合成核酸的方法，其特征在于，当靶标核酸为RNA时，所述聚合酶具有反转录酶活性或加入反转录酶的酶反应温度与聚合酶反应温度相同。

11.如权利要求1～3任一项所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述合成核酸的方法包括在体系中添加促进核酸动态解离的促进剂，如甜菜碱和PEG-200。

12.如权利要求1～3任一项所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述合成核酸的方法处于一个等温条件下或几个温度条件下。

13.如权利要求1～3任一项所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述寡核苷酸引物为直接合成或间接合成。

14.如权利要求13所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述寡核苷酸引物由酶反应间接合成。

15.一种利用寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP合成核酸的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1～14任一项所述的寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP。