CN117187440A - 基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物、试剂盒和检测方法 - Google Patents
基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物、试剂盒和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117187440A CN117187440A CN202310921034.3A CN202310921034A CN117187440A CN 117187440 A CN117187440 A CN 117187440A CN 202310921034 A CN202310921034 A CN 202310921034A CN 117187440 A CN117187440 A CN 117187440A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cov
- tttago
- isothermal amplification
- ttago
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 42
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 title claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 14
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 4
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及医用生物化学分子诊断领域，涉及一种基于TtAgo的SARS‑CoV‑2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物、试剂盒和检测方法。本发明创新性地将TtAgo分析与RT‑/LAMP扩增整合成单/闭管检测，样本经核酸提取或者裂解处理后加入反应管中进行扩增检测，便可实现1小时内最低检测下限100拷贝数/反应的检测。结果准确、价格低廉、反应快速，可用于SARS‑CoV‑2病毒即时现场检测。
Description
技术领域
本发明属于医用生物化学分子诊断领域，具体涉及一种基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物、试剂盒和检测方法。
背景技术
实时荧光PCR(Real-time fluorescence PCR)法是当下检测SARS-CoV-2病毒等传染性病原体的一种临床标准。从临床应用效果看，核酸诊断试剂盒比常规基因组测序分析具有成本和时间上的优势，但因其多基于荧光PCR方法，仍然还存在检测时间较长(2小时左右)、价格高(200元/次)、设备昂贵(Q-PCR仪器30-60万元)，及操作人员专业要求高等问题，因此，开发新型传染病的诊断新技术，实现病原体的准确、快速检测对疾病的诊治和控制具有重要的意义。
逆转录LAMP核酸扩增技术的原理：逆转录LAMP即逆转录和Loop MediatedIsothermal Amplification(环介导等温扩增)的结合，专门用于快速扩增RNA。LAMP是2000年出现的一种新颖的等温核酸扩增方法。它利用4或6条模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温条件下(60～65℃左右)15-60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于逆转录PCR技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不依赖任何专门的仪器设备。目前已成功应用于人类及动植物、细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的快速检测。逆转录LAMP法(逆转录环介导等温扩增法)也应用到了SARS-CoV-2病毒核酸检测中。但逆转录LAMP法检测新型冠状病毒还存在假阳性高、可靠性差等问题。
近年来迅速发展的CRISPR诊断技术因其灵敏特异、有着良好的即时现场诊断应用潜力而备受广泛关注。但是基于CRISPR系统的核酸检测技术也仍存在许多限制因素，例如CRISPR对检测基因序列的限制、多重检测难以实现、向导RNA设计相对复杂且合成价格昂贵等，仍然成为其进入市场的限制。而Argonaute是一种通过DNA干扰参与宿主防御的具有核酸内切酶功能的蛋白质，广泛存在于真核、原核以及古生菌中，目前已被公认为是一系列生物技术应用的合适候选物。与CRISPR/Cas系统不同，Agos系统的检测不需要特定的候选识别位点的毗邻基序，即PAM序列，不受任何靶序列限制。另外，Agos可以利用5’-磷酸化的短/单链DNA作为向导(guide)，与RNA相比，DNA更容易合成，在使用过程中也更稳定。例如，一种NAVIGATER方法(通过嗜热栖热菌DNA向导的Argonaute进行核酸富集)，可以基于TtAgo技术以单核苷酸的精度特异性切割与向导DNA互补的DNA和RNA，从而提高下游检测方法如PCR和测序的灵敏度。然而，迄今为止报道的所有基于pAgo的方法要么将pAgo介导的切割与后续步骤分开，要么需要热循环仪器以实现扩增。因此，仍然有必要建立等温扩增一锅检测法，以进一步探索pAgos在诊断领域的潜力。
TtAgo是一种典型的向导DNA引导的核酸内切酶，在不需要PAM的情况下靶向同源单链DNA，从靶标双链DNA的5’端切割第10和第11碱基之间的磷酸二酯键。同时，TtAgo在较广的温度范围内(65～85℃)和多种反应buffer中均具有较高的活性，与RT-/LAMP反应表现出一定的兼容性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于基于TtAgo技术构建一种与RT-/LAMP等温扩增相结合的一锅检测方法，该方法操作简便，通过样本基因组提取后直接加入单管反应液中进行闭管反应，实时收集荧光或者读取终点荧光强度从而判定结果(图1)，结果准确、价格低廉、反应快速，可用于SARS-CoV-2病毒即时现场检测。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：
一种基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物，其包括三条向导DNA、一条荧光报告探针、一对外引物、一对内引物及一对环引物；
其中，所述向导DNA序列为：
gDNA1：5’-pTTTTCTTGAACTGTTGaa-3’，
gDNA2：5’-pTACTGCTGCCTGGAGTaa-3’，
gDNA3：5’-pTTCGCAACAGTTCAAGtt-3’；
所述荧光报告探针序列为：
ssDNA-FQ：5’-FAM-CCTGGAGTTGAATTTCTTGAA-BHQ1-3’；
所述外引物序列为：
F3：5’-GCCAAAAGGCTTCTACGCA-3’，
B3：5’-TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA-3’；
所述内引物序列为：
FIP：5’-TCCCCTACTGCTGCCTGGAG-GCAGTCAAGCCTCTTCTCG-3’，
BIP：5’-TCTCCTGCTAGAATGGCTGGCA-TCTGTCAAGCAGCAGCAAAG-3’；
所述环引物序列为：
LF：5’-GCGACTACGTGATGAGGAA-3’，
LB：5’-GGCGGTGATGCTGCTCTT-3’。
上述一种组合物在制备基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用试剂盒中的应用。
一种基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用试剂盒，其包含上述的组合物。
进一步的，上述试剂盒还包括Reaction Buffer、MgSO4、dNTP、TtAgo酶及Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶。
一种非疾病诊断治疗目的的核酸检测方法，其是利用上述的试剂盒进行基于TtAgo的核酸等温扩增一锅法反应，以检测所述核酸；其中，所述核酸为病毒核酸，所述病毒为SARS-CoV-2。
进一步的，上述基于TtAgo的核酸等温扩增一锅法反应的体系总体积为10μL：Reaction Buffer(含2mM MgSO4)，8mM MgSO4，1.4mM dNTP，250nM gDNA1，250nM gDNA2，250nM gDNA3，100nM TtAgo酶，50nM ssDNA-FQ，0.2μM F3，0.2μM B3，0.4μMLF，0.4μM LB，1.6μM FIP，1.6μM BIP，0.32U/μL Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，模板1μL，用无核酸酶水补足至10μL。
进一步的，上述基于TtAgo的核酸等温扩增一锅法反应的程序为：66℃反应1～2小时，每间隔1分钟收集一次荧光。
本发明的显著优点在于：
本发明克服了CRISPR对检测基因序列的限制、向导RNA设计相对复杂且合成价格昂贵等缺点，创新性地将TtAgo分析与RT-/LAMP扩增整合成单/闭管检测，建立了一个基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增检测一锅法。样本经核酸提取或者裂解处理后加入反应管中进行扩增检测，便可实现1小时内最低检测下限100拷贝数/反应的检测。结果准确、价格低廉、反应快速，可用于SARS-CoV-2病毒即时现场检测。
附图说明
图1：基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测流程及原理示意图。
图2：SARS-CoV-2病毒(N基因)TtAgo检测体系可行性分析。
图3：于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测体系优化。
图4：基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测体系及其灵敏度。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1：基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒N基因检测的可行性分析从SARS-CoV-2病毒N基因上选择一段特异且保守的短序列，该短序列需满足用于TtAgo分析的向导DNA(gDNA)设计原则。具体地，gDNA设计原则包括以下几个方面：
1)gDNA是一条5’磷酸化的16-18nt的单链短DNA；
2)不管是否与目的靶标匹配，gDNA 5’端第一个碱基为T；
3)应避免gDNA第12位是A碱基。
本实施例所用gDNA的核苷酸序列为5’-pTTCAAGAAATTCAACT-3’，其中5’磷酸化采用T4多核苷酸激酶进行修饰。该gDNA的制备方法为：配制总体积为100μL的反应体系：1×T4DNA连接酶缓冲液，5μM单链寡核苷酸(5’-TTCAAGAAATTCAACT-3’)，0.1U/μL T4多核苷酸激酶(#M0201V，NEB)，用无核酸酶水补足至100μL；37℃过夜反应，而后65℃反应20min使T4多核苷酸激酶失活，收集反应液，得到浓度为5μM的gDNA，可用于后续TtAgo分析。
除此之外，本实施例还需一条序列含有与gDNA反向互补的荧光报告探针。具体的，本实施例所用荧光报告探针为ssDNA-FQ，其核苷酸序列为5’-FAM-CCTGGAGTTGAATTTCTTGAA-BHQ1-3’。
利用所设计的gDNA和荧光报告探针ssDNA-FQ探究基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒N基因检测的可行性：配制总体积为10μL的TtAgo分析体系：Reaction Buffer(含2mM MgSO4，#B9004，NEB)，8mM MgSO4，250nM gDNA，100nM TtAgo酶(#M0665，NEB)，100nMssDNA-FQ，用无核酸酶水补足至10μL；66℃反应1～2小时，每间隔1分钟收集一次荧光。如图2所示，只有体系中gDNA、TtAgo酶、ssDNA-FQ同时存在时，TtAgo分析体系才有荧光信号，即在gDNA、TtAgo酶、ssDNA-FQ同时存在时TtAgo酶表现出高切割活性。
实施例2：基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测体系成分优化基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测体系成分优化主要包括以下几个方面，包括但不局限于MgSO4用量、gDNA与TtAgo酶用量及比例，荧光报告探针用量、反应buffer(图3)。
其一，MgSO4用量涉及RT-LAMP中Bst DNA聚合酶的反应活性及TtAgo分析表现出的反应活性。本实施例考察了TtAgo分析体系中MgSO4终浓度分别为3mM、5mM、1mM情况下的检测信号。结果显示，随着TtAgo分析体系中MgSO4终浓度的提高，单管扩增检测反应(RT-/LAMP结合TtAgo分析)信号逐步增强；TtAgo分析体系中MgSO4终浓度为10mM时，体系信号更优。
其二，gDNA及TtAgo酶用量影响TtAgo分析体系的效能。本实施例考察了TtAgo分析体系中gDNA与TtAgo酶的比例对检测信号的影响，体系中gDNA与TtAgo酶的终浓度设置为：①500nM gDNA，100nM TtAgo酶，即gDNA与TtAgo酶的摩尔比为5：1；②500nM gDNA，50nMTtAgo酶，即gDNA与TtAgo酶的摩尔比为5：0.5；③1μM gDNA，100nM TtAgo酶，即gDNA与TtAgo酶的摩尔比为10：1；④250nM gDNA，100nM TtAgo酶，即gDNA与TtAgo酶的摩尔比为2.5：1。结果显示，TtAgo分析体系中含250nM gDNA、100nM TtAgo酶条件下，单管扩增检测反应(RT-/LAMP结合TtAgo分析)信号更优。
其三，荧光报告探针用量直接决定着TtAgo分析作用的底物浓度。本实施例考察了TtAgo分析体系中荧光报告探针ssDNA-FQ终浓度分别为50nM、100nM、200nM情况下的检测信号。结果显示，随着TtAgo分析体系中ssDNA-FQ终浓度的下降，体系反应信号达到平台期所需时间越短，反应速率越高；当TtAgo分析体系中ssDNA-FQ终浓度为50nM时，单管扩增检测反应(RT-LAMP结合TtAgo分析)信号更优。
其四，兼容性的反应缓冲液有助于RT-/LAMP反应和TtAgo切割能够在单管反应中实现整合，并表现出体系信号较优。本实施例比较考察了Reaction Buffer(#B9004，NEB)，Isothermal Amplification Buffer(#B0537，NEB)，NEBuffer 1.1(#B7201，NEB)，NEBuffer 2.1(#B7202，NEB)，NEBuffer 3.1(#B7203，NEB)，/>Buffer(#B7204，NEB)在单管扩增检测反应(RT-/LAMP结合TtAgo分析)体系中检测信号情况。通过比较，发现，/>Reaction Buffer更有助于实现RT-/LAMP与TtAgo单管扩增检测，体系检测信号最优。
实施例3：基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测体系及其灵敏度基于上述优化条件，针对SARS-CoV-2病毒N基因，本实施例设计了三条gDNA，用于TtAgo切割RT-/LAMP扩增产物，产生一个单链缺口和一个双链平末端缺口，具有3’活性的单链缺口在Bst DNA聚合酶延伸置换下，产生新的靶标特异的向导DNA，随后与TtAgo组装用于靶向特定荧光报告分子ssDNA-FQ，从而产生特定荧光通道信号；用于靶向SARS-CoV-2病毒N基因的gDNA的设计原则主要包括以下几个方面：
1)gDNA是一条5’磷酸化的16-18nt的单链DNA；
2)不管是否与目的靶标匹配，gDNA 5’端第一个碱基为T；
3)应避免gDNA第12位是A碱基；
4)靶标的检测由三条特异性gDNA在TtAgo酶作用下切割扩增子和Bst DNA聚合酶的链置换协同作用下完成的，其中两条gDNA通过切割同一靶标链产生新的gDNA，该gDNA同样满足上述条件1)至3)并可在TtAgo酶作用下靶向并切割荧光报告探针。
此外，为避免gDNA 3’端在Bst DNA聚合酶作用下产生延伸反应，造成体系gDNA含量的变化，本实施例用2～3个与靶标不匹配的碱基添加在其3’端，以此阻碍gDNA以靶标链为模板的延伸反应。
具体的，本实施例靶向SARS-CoV-2病毒N基因的三条gDNA为：gDNA1：5’-pTTTTCTTGAACTGTTGaa-3’，gDNA2：5’-pTACTGCTGCCTGGAGTaa-3’，gDNA3：5’-pTTCGCAACAGTTCAAGtt-3’，gDNA的制备方法参照实施例1；
本实施例荧光报告探针ssDNA-FQ为：5’-FAM-CCTGGAGTTGAATTTCTTGAA-BHQ1-3’；本实施例用于SARS-CoV-2病毒N基因扩增的RT-LAMP引物对为：
F3：5’-GCCAAAAGGCTTCTACGCA-3’，
B3：5’-TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA-3’，
LF：5’-GCGACTACGTGATGAGGAA-3’，
LB：5’-GGCGGTGATGCTGCTCTT-3’，
FIP：5’-TCCCCTACTGCTGCCTGGAG-GCAGTCAAGCCTCTTCTCG-3’，
BIP：5’-TCTCCTGCTAGAATGGCTGGCA-TCTGTCAAGCAGCAGCAAAG-3’。
将SARS-CoV-2的N基因片段(5’-GCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAA-3’)插入到PUC57载体，得到N基因质粒，经体外转录获得RNA片段，而后经转录纯化试剂盒(#AM1908，Thermo Fisher)纯化后用EASY Dilution(#9160Q，Takara)进行梯度稀释作为模板对基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测体系进行灵敏度考察。基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测体系总体积为10μL：Reaction Buffer(含2mM MgSO4)，8mM MgSO4，1.4mM dNTP，250nM gDNA1，250nM gDNA2，250nM gDNA3，100nM TtAgo酶，50nM ssDNA-FQ，0.2μM F3，0.2μM B3，0.4μM LF0.4μM LB，1.6μM FIP，1.6μM BIP，0.32U/μL Bst 2.0WarmStart DNAPolymerase(#M0538，NEB)，反应模板1μL，用无核酸酶水补足至10μL；66℃反应1～2小时，每间隔1分钟收集一次荧光。结果显示(图4)，该体系能够在1个小时内达到100拷贝数/反应的最低检测下限。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物，其特征在于：包括三条向导DNA、一条荧光报告探针、一对外引物、一对内引物及一对环引物；
其中，所述向导DNA序列为：
gDNA1：5’-pTTTTCTTGAACTGTTGaa-3’，
gDNA2：5’-pTACTGCTGCCTGGAGTaa-3’，
gDNA3：5’-pTTCGCAACAGTTCAAGtt-3’；
所述荧光报告探针序列为：
ssDNA-FQ：5’-FAM-CCTGGAGTTGAATTTCTTGAA-BHQ1-3’；
所述外引物序列为：
F3：5’-GCCAAAAGGCTTCTACGCA-3’，
B3：5’-TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA-3’；
所述内引物序列为：
FIP：5’-TCCCCTACTGCTGCCTGGAG-GCAGTCAAGCCTCTTCTCG-3’，
BIP：5’-TCTCCTGCTAGAATGGCTGGCA-TCTGTCAAGCAGCAGCAAAG-3’；
所述环引物序列为：
LF：5’-GCGACTACGTGATGAGGAA-3’，
LB：5’-GGCGGTGATGCTGCTCTT-3’。
2.如权利要求1所述的组合物在制备基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用试剂盒中的应用。
3.一种基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的组合物。
4.一种非疾病诊断治疗目的的核酸检测方法，其特征在于：利用如权利要求3所述的试剂盒进行基于TtAgo的核酸等温扩增一锅法反应，以检测所述核酸；其中，所述核酸为病毒核酸，所述病毒为SARS-CoV-2。
5.根据权利要求4所述的核酸检测方法，其特征在于：所述基于TtAgo的核酸等温扩增一锅法反应的体系总体积为10μL：1×ThermoPol® Reaction Buffer，8mM MgSO4，1.4mMdNTP，250nM gDNA1，250nM gDNA2，250nM gDNA3，100nM TtAgo酶，50nM ssDNA-FQ，0.2μMF3，0.2μM B3，0.4μM LF，0.4μM LB，1.6μM FIP，1.6μM BIP，0.32U/μL Bst 2.0 WarmStartDNA聚合酶，模板1μL，用无核酸酶水补足至10μL；所述1×ThermoPol® Reaction Buffer中含有2mM MgSO4。
6.根据权利要求4所述的核酸检测方法，其特征在于：所述基于TtAgo的核酸等温扩增一锅法反应的程序为：66℃反应1~2小时，每间隔1分钟收集一次荧光。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310921034.3A CN117187440A (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物、试剂盒和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310921034.3A CN117187440A (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物、试剂盒和检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117187440A true CN117187440A (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=89002395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310921034.3A Pending CN117187440A (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物、试剂盒和检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117187440A (zh) |
-
2023
- 2023-07-26 CN CN202310921034.3A patent/CN117187440A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111926117B (zh) | SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法 | |
| CN114058679B (zh) | 一种crispr级联核酸检测系统及其检测方法与应用 | |
| CN108796036B (zh) | 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用 | |
| KR20210039989A (ko) | 고온 내성 Cas 단백질의 용도, 표적 핵산 분자의 검출 방법 및 시약 키트 | |
| US8906621B2 (en) | Cross priming amplification of target nucleic acids | |
| CN112877410B (zh) | 一种优化的基于crispr介导的核酸检测系统及其检测方法 | |
| JP2021514651A (ja) | 単一分子配列決定のための一本鎖環状ｄｎａ鋳型の作成 | |
| CN111926114A (zh) | 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 | |
| CN108642144A (zh) | 一种恒温链置换扩增技术及试剂盒 | |
| CN116083541B (zh) | 一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法 | |
| WO2023071788A1 (zh) | 一种用于检测核酸的荧光pcr方法 | |
| CN114592042B (zh) | 一种微rna检测方法及试剂盒 | |
| CN113789368B (zh) | 核酸检测试剂盒、反应体系及方法 | |
| CN115029345A (zh) | 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用 | |
| CN117187440A (zh) | 基于TtAgo的SARS-CoV-2病毒核酸等温扩增一锅法检测用组合物、试剂盒和检测方法 | |
| CN116179652A (zh) | 基于LAMP联合Cas13a核酸酶的检测痕量核酸的方法以及应用 | |
| CN112501166A (zh) | 一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法 | |
| Shen et al. | Progress in recombinant polymerase nucleic acid amplification technology | |
| CN116083655B (zh) | 一种用于I-IV型登革病毒检测的DENV-crRNA及其试剂盒和应用 | |
| WO2023125582A1 (zh) | 多重pcr反应体系 | |
| WO2023246033A1 (zh) | 一锅法滚环转录和CRISPR/Cas介导的核酸检测方法及试剂盒 | |
| CN112921119B (zh) | 环介导切刻等温-crispr联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法 | |
| CN114045330B (zh) | 一种基于滑动复制的核酸等温扩增方法 | |
| CN117363806A (zh) | 一种半重叠引物核酸恒温扩增方法、试剂盒及应用 | |
| CN117363708A (zh) | 一种基于Cas免扩增核酸检测方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |