CN114058679B - 一种crispr级联核酸检测系统及其检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用，利用Cas12酶和Cas13酶的活性，与待测靶标核酸序列互补的13‑crRNA引导Cas13酶特异性结合待测靶标核酸序列，引发级联辅助探针被Cas13酶反式切割，释放的Trigger ssDNA能够与12‑crRNA碱基互补配对，引发荧光检测探针被Cas12酶反式切割，之后产生可检测信号。所述的检测方法具有靶标特异性结合、非特异性切割活性的特点。应用该方法可以直接检测单链RNA靶标及靶标对应的多个检测位点，依靠CRISPR‑Cas系统级联即可在无需扩增的条件下实现“aM级(10^‑18mol/L)”的核酸检测，具有极高的灵敏度；而且，该方法在检测靶标的设计上灵活性高，检测所需时长较短，无需扩增步骤，成本低廉，操作简便，可以实现“核酸进‑结果出”的闭管检测。

Description

一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用。

背景技术

核酸的快速检测在临床诊断与生物技术中的应用非常重要，特别是在体外分子诊断中的应用。随着核酸分子检测市场的快速发展，对核酸检测技术不断提出新的需求，尤其对现场快速检测提出了新需求。现场快速检测(point-of-care testing , POCT)是在采样现场进行的，利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。现场快速检测POCT技术目前广泛应用于临床检验、慢病监测、应急反恐、灾害医学救援、传染病监测、检验检疫、食品安全、毒品检验等公共卫生领域。

传统的核酸检测技术通常会采用先扩增靶标核酸或基因，再检测扩增产物的方法。作为常见的特异性扩增检测技术，可以分为两大流派：一个流派是以qPCR技术为基础的分子诊断技术，qPCR技术具有特异性强和灵敏度高的特点，可以对病原体进行定量检测，但是qPCR技术的热循环过程需要热循环仪，因热循环仪存在体积大、价格较高和反应时间较长的问题，使其难以在基层进行推广普及，难以应用于现场检测。另一个流派是以恒温扩增技术为基础的分子诊断技术，恒温扩增技术可以分成两类，第一类是依赖于特异性引物延伸的扩增反应，例如：依赖核酸序列扩增技术（NASBA）、滚环扩增技术（RCA）、环介导等温扩增技术（LAMP）和重组酶聚合酶扩增技术（RPA）等；第二类是依赖于限制性内切酶的扩增反应，例如：链置换扩增技术（SDA）、指数扩增反应（EXPAR）和切刻内切酶介导等温核酸扩增技术（NEMA），恒温扩增技术不仅仅是缩短了核酸扩增时间，更重要的是恒温核酸扩增摆脱了对设备的约束，在POC检测中显示了非常好的应用前景；特别地，当这些恒温扩增技术与于CRISPR/Cas系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)基因编辑技术相结合可以进一步提高检测的灵敏度和特异性，例如：张峰等人开发的“SHERLOCK”核酸检测技术使用RT-RPA/RPA扩增靶标核酸，结合Lwacas13a的反式切割活性进行检测信号读出，实现在1小时内出检测结果，王金等人利用Cas12b的耐高温性和非特异性切割活性，巧妙结合RT-LAMP/LAMP前扩增步骤，开发出了“HOLMESv2”用于检测日本脑炎病毒，检测限为10aM。然而，在这些已报道的基于核酸扩增的检测技术中，仍然存在一些实质性问题，包括由于不完整的逆转录步骤导致样品缺失、容易出错的序列复制而导致的扩增偏差以及由于扩增子污染导致的假阳性风险。

因此，现有技术还有待改进。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用，所述检测方法在检测靶标的设计上灵活性高，无需扩增即可检测单链RNA核酸样品，具有超灵敏检测、成本低廉、操作简便、检测时间短、闭管检测和实时监测等优点。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种CRISPR级联核酸检测系统，其中，包括待测靶标核酸、级联辅助探针、核糖核蛋白复合体、荧光检测探针以及酶缓冲液；所述级联辅助探针由触发单链DNA和外凸单链RNA杂交形成；所述核糖核蛋白复合体包括Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白；所述Cas13核糖核蛋白包括靶标向导RNA-13和Cas13酶，所述靶标向导RNA-13的基因组靶向序列与待测靶标核酸序列互补；所述Cas12核糖核蛋白包括靶标向导RNA-12和Cas12酶，所述靶标向导RNA-12的基因组靶向序列与级联辅助探针的触发单链DNA碱基序列互补。

所述的CRISPR级联核酸检测系统，其中，所述触发单链DNA与外凸单链RNA分别是级联辅助探针的单链DNA和单链RNA，所述外凸单链RNA的序列与所述触发单链DNA的序列互补，所述外凸单链RNA可与触发单链DNA杂交形成一个带有外凸结构的核酸双链，所述触发单链DNA可以激活Cas12酶的核酸酶活性。

所述的CRISPR级联核酸检测系统，其中，所述靶标向导RNA-12和靶标向导RNA-13分别是Cas12酶和Cas13酶的靶标向导RNA；所述靶标向导RNA-12包括通用序列X和基因组靶向序列X，所述通用序列X可以特异性识别所述Cas12酶，所述基因组靶向序列X可以特异性识别所述触发单链DNA碱基序列；所述靶标向导RNA-13包括通用序列Y和基因组靶向序列Y，所述通用序列Y可以特异性识别所述Cas13酶，所述基因组靶向序列Y可以特异性识别待测靶标核酸序列。

所述的CRISPR级联核酸检测系统，其中，所述Cas12酶包括Cas12a蛋白、Cas12b蛋白和Cas12c蛋白中的一种或多种；所述Cas13酶包括Cas13a蛋白、Cas13b蛋白、Cas13c蛋白和Cas13d蛋白中的一种或多种。。

所述的CRISPR级联核酸检测系统，其中，所述荧光检测探针两端分别修饰有荧光基团和猝灭基团。

所述的CRISPR级联核酸检测系统，其中，所述荧光基团包括羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素和六氯-6-甲基荧光素中的一种或多种；所述猝灭基团包括4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸和黑洞猝灭剂中的一种或多种。

第二方面，本发明提供一种CRISPR级联核酸检测方法，其中，所述的核酸检测方法基于如上任一所述的CRISPR级联核酸检测系统，具体包括步骤：

步骤一，制备级联辅助探针：

所述级联辅助探针由触发单链DNA和外凸单链RNA按照一定比例混合，在杂交缓冲液中杂交形成；

步骤二，制备核糖核蛋白复合体：

所述核糖核蛋白复合体包括Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白，所述Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白分别由靶标向导RNA-13和Cas13酶、靶标向导RNA-12和Cas12酶按照一定比例混合后得到；

步骤三，制备反应体系：

将制备得到的所述级联辅助探针和所述核糖核蛋白复合体与荧光检测探针、酶缓冲液混合，即得到所述反应体系；

步骤四，进行Cas酶切反应，检测信号并分析结果：

将待测靶标核酸样品加入到所述反应体系中，进行恒温定时反应，检测产生的荧光信号并分析结果。

所述的核酸检测方法，其中，发生反应时，Cas13酶和待测靶标核酸样品的序列RNA、靶标向导RNA-13形成RNA/Cas13酶/靶标向导RNA-13复合物，激活Cas13酶的反式切割活性；被激活的Cas13酶对级联辅助探针的外凸单链RNA进行反式切割，之后，外凸单链RNA未被切割的片段从触发单链DNA上脱离，释放触发单链DNA序列；被释放的触发单链DNA与Cas12酶、靶标向导RNA-12形成Cas12酶/靶标向导RNA-12/触发单链DNA复合物，激活Cas12酶的反式切割活性；被激活的Cas12酶对荧光检测探针进行切割，释放荧光基团，最终形成级联系统；之后，检测荧光基团的荧光信号，即可以得到待测靶标核酸样品的核酸检测结果。

所述的核酸检测方法，其中，Cas12酶的工作浓度范围为0.05-1uM，Cas13酶的工作浓度范围为0.001-1μM，靶标向导RNA-12的工作浓度范围为0.05-1μM，靶标向导RNA-13的工作浓度范围为0.001-1μM，级联辅助探针的工作浓度范围为10-500nM，荧光检测探针的工作浓度范围为1-10μM；恒温25-37°C反应，反应时间20-60min。

第三方面，本发明还提供一种如上所述的CRISPR级联核酸检测方法的应用，其中，将所述的核酸检测方法应用于单链RNA检测。

有益效果：本发明提供了一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用，利用Cas12酶和Cas13酶的活性，将与待测靶标核酸序列互补的靶标向导RNA-13（13-crRNA）和Cas13酶混合得到Cas13核糖核蛋白（13-RNP），靶标向导RNA-12（12-crRNA）和Cas12酶混合得到Cas12核糖核蛋白（12-RNP），并将与12-crRNA互补的触发单链DNA（Trigger ssDNA）和外凸单链RNA（Bubble ssRNA）互补杂交形成级联辅助探针。之后，将上述材料一起组成反应体系。13-crRNA引导Cas13酶特异性结合待测靶标核酸序列，引发级联辅助探针被Cas13酶反式切割，释放的触发单链DNA能够与12-crRNA碱基互补配对，引发荧光检测探针被所述的Cas12酶反式切割，之后产生可检测信号。所述核酸检测方法具有靶标特异性结合、非特异性切割活性的特点。应用该方法可以直接检测单链RNA靶标及靶标对应的多个检测位点，依靠CRISPR-Cas系统的快速反式切割活性即可实现“aM级(10^-18mol/L)”的核酸检测，在灵敏性方面具有无与伦比的优势；而且，该方法在检测靶标的设计上灵活性高，所述检测方法无需扩增即可检测单链RNA核酸样品，具有超灵敏检测、成本低廉、操作简便、检测时间短、闭管检测和实时监测等优点。

附图说明

图1为本发明实施例中一种CRISPR级联核酸检测方法的原理示意图。

图2为本发明实施例中Cas12蛋白的活性验证结果示意图。

图3为本发明实施例中Cas13蛋白的活性验证结果示意图。

图4为本发明实施例中提供的级联辅助探针的结构示意图。

图5为本发明实施例提供的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的E基因的核酸检测的结果示意图。

图6为本发明实施例提供的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的核酸检测的灵敏检测结果示意图。

图7为本发明实施例提供的级联辅助探针为80nM时的新冠标准品动力学检测结果灵敏性示意图。

具体实施方式

本发明提供一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种CRISPR级联核酸检测系统，包括待测靶标核酸样品、级联辅助探针、核糖核蛋白复合体、荧光检测探针以及酶缓冲液；所述级联辅助探针由触发单链DNA(Trigger ssDNA)和外凸单链RNA (Bubble ssRNA)杂交形成；所述核糖核蛋白复合体包括Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白；所述Cas13核糖核蛋白包括靶标向导RNA-13(13-crRNA)和Cas13酶，13-crRNA的基因组靶向序列与待测靶标核酸序列互补；所述Cas12核糖核蛋白包括靶标向导RNA-12(12-crRNA)和Cas12酶， 12-crRNA的基因组靶向序列与Trigger ssDNA碱基序列互补。

发生反应时，Cas13酶和待测靶标核酸样品的序列RNA、13-crRNA形成RNA/Cas13酶/13-crRNA复合物，激活Cas13酶的反式切割活性；被激活的Cas13酶对级联辅助探针的外凸单链RNA(Bubble ssRNA)进行反式切割，之后，外凸单链RNA(Bubble ssRNA)未被切割的片段从触发单链DNA(Trigger ssDNA)上脱离，释放触发单链DNA(Trigger ssDNA)序列；被释放的触发单链DNA(Trigger ssDNA)与Cas12酶、12-crRNA形成Cas12酶/12-crRNA/Trigger ssDNA复合物，激活Cas12酶的反式切割活性；被激活的Cas12酶对荧光检测探针进行切割，释放荧光基团，整个反应最终会形成级联系统；之后，检测荧光基团的荧光信号，即可以得到待测靶标核酸样品的核酸检测结果。

在一些实施方式中，所述Bubble ssRNA的序列与所述Trigger ssDNA的序列互补，所述Bubble ssRNA可与Trigger ssDNA杂交形成一个带有外凸结构的核酸双链。

级联辅助探针由Trigger ssDNA和Bubble ssRNA杂交形成，所述Trigger ssDNA可以激活Cas12酶的反式切割活性。所述Bubble ssRNA与Trigger ssDNA杂交形成一个带有外凸结构的核酸双链，所述外凸的结构至少包括四个以上的核苷酸，且所述外凸的结构可以被Cas13酶切割。

运用Nupack design功能设计至少一条Trigger ssDNA，然后通过反向互补工具即可以得到对应的ssRNA。由于不同序列长度的Trigger ssDNA与相应长度的ssRNA互补时，能生成具有不同热稳定性的级联辅助探针，而针对不同热稳定性的级联辅助，其导致的Cas12酶的反式切割活性也会不同。例如，当Trigger ssDNA与相应长度的ssRNA完全互补形成的级联辅助探针的熔链温度（Tm）值大于体系反应温度，在体系反应温度下，所述的级联辅助探针就不会提前释放出Trigger ssDNA，Cas12酶的反式切割活性几乎完全被抑制；接着，设计使Trigger ssDNA与相应长度的ssRNA杂交形成一个外凸的结构，而在体系反应温度下，当外凸结构被激活的Cas13蛋白反式切割后，Trigger ssDNA就能够释放出来。

在一些实施方式中，核糖核蛋白复合体（RNP）包括Cas12核糖核蛋白（12-RNP）和Cas13核糖核蛋白（13-RNP）。

在一些实施方式中，Cas12核糖核蛋白和Cas13核糖核蛋白分别由12-crRNA和Cas12酶、13-crRNA和Cas13酶按照一定比例混合得到。

12-crRNA和13-crRNA分别是Cas12酶和Cas13酶的靶标向导RNA。所述靶标向导RNA包括通用序列和基因组靶向序列，通用序列能自主形成发卡结构，可以与Cas蛋白特异性识别；基因组靶向序列可以特异性识别靶标基因组序列。

在一些实施方式中，所述12-crRNA包括通用序列X和基因组靶向序列X，所述通用序列X可以特异性识别所述Cas12酶，所述基因组靶向序列X可以特异性识别所述TriggerssDNA碱基序列。

优选的，所述12-crRNA的通用序列X包括：5’- AAUUUCUACUCUUGUAGAU-3’。

优选的，所述12-crRNA的基因组靶向序列X包括连接在所述通用序列X 3’端的至少18个碱基，每个碱基分别独立选自A、G、C或U。

在一些实施方式中，所述13-crRNA包括通用序列Y和基因组靶向序列Y，所述通用序列Y可以特异性识别所述Cas13酶，所述基因组靶向序列Y可以特异性识别待测靶标核酸序列。

优选的，所述13-crRNA的通用序列Y包括：5’- GAGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAAC-3’。

优选的，所述13-crRNA的基因组靶向序列Y包括连接在所述通用序列Y 3’端的至少28个碱基，每个碱基分别独立选自A、G、C或U。

在一些实施方式中，所述Cas12酶包括Cas12a蛋白、Cas12b蛋白和Cas12c蛋白中的一种或多种，或者其它具有非特异性切割活性的类似Cas12蛋白。

在一些实施方式中，所述Cas13酶包括Cas13a蛋白、Cas13b蛋白、Cas13c蛋白和Cas13d蛋白中的一种或多种，或者其它具有非特异性切割活性的类似Cas13蛋白。

在一些实施方式中，Cas蛋白可以通过重组表达、蛋白纯化的方式获得，但不限于此。可选地，所述Cas蛋白也可以通过商业购买获得。

在一些实施方式中，所述荧光检测探针两端分别修饰有荧光基团和猝灭基团。

在一些实施方式中，所述荧光基团包括羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）和六氯-6-甲基荧光素（HEX）中的一种或多种。

修饰不同的荧光基团，荧光检测过程中采用的激发波长也会不同。例如，当所述荧光基团为羧基荧光素时，荧光检测过程中采用的激发波长约为494nm，收集羧基荧光素的发射波长约为518nm。所述荧光基团还可以是其他发射波长的荧光染料，并根据相应的荧光基团的性质，来选择合适的激发波长，在此不做特别限制。

在一些实施方式中，所述猝灭基团包括4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸（DABCYL）和黑洞猝灭剂（BHQ）中的一种或多种。

优选的，所述黑洞淬灭剂包括黑洞淬灭剂1 (BHQ-1)、黑洞淬灭剂2 (BHQ-2)或黑洞淬灭剂 (BHQ-3)中的一种或多种。

在一些实施方式中，酶缓冲液可选择Cas缓冲液，但不限于此。反应体系中的缓冲液有利于保持Cas蛋白的高活性，以及提升反应过程中Cas蛋白被激活后的反式切割活性。可选地，所述缓冲液也可以通过商业购买获得。

本发明实施例还提供一种CRISPR级联核酸检测方法，具体包括步骤：

S100、制备级联辅助探针：

所述级联辅助探针由Trigger ssDNA和Bubble ssRNA按照一定比例混合，在杂交缓冲液中杂交形成；

S200、制备核糖核蛋白复合体：

所述核糖核蛋白复合体包括Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白，所述Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白分别由13-crRNA和Cas13酶、12-crRNA和Cas12酶按照一定比例混合后得到；

S300、制备反应体系：

将制备得到的所述级联辅助探针和所述核糖核蛋白复合体与荧光检测探针、酶缓冲液混合，即得到所述反应体系；

S400、进行Cas酶切反应，检测信号并分析结果：

将待测靶标核酸样品加入到所述反应体系中，进行恒温定时反应，检测产生的荧光信号并分析结果。

所述CRISPR级联核酸检测方法的原理如图1所示。本发明实施例所述的核酸检测方法可以由3个传感单元组成，即传感单元Sensor1、Sensor和Sensor3，其中Sensor1、Sensor2和Sensor3为串联连接。具体来说，首先Cas13酶和待测靶标核酸样品的序列RNA、靶标向导13-crRNA可以形成RNA/Cas13酶/13-crRNA复合物，预先组装为Sensor1，激活Cas13酶的反式切割活性，即转换为具有反式切割活性的Cas13酶的输出。级联辅助探针作为Sensor2，当级联辅助探针未被切割时，此时Cas12酶的反式切割活性未被激活，荧光检测探针中荧光基团和淬灭基团之间间隔距离短，荧光检测探针处于荧光猝灭状态，外界不能检测到荧光基团发生的荧光信号；当级联辅助探针中Bubble ssRNA形成的外凸的结构（Bubble）被激活的Cas13酶反式切割后，Bubble ssRNA未被切割的片段会由于与TriggerssDNA之间的Tm值改变而迅速从Trigger ssDNA上脱离，释放Trigger ssDNA序列；即级联辅助探针可以响应具有反式切割活性的Cas13酶的输入，并输出多个Trigger ssDNA。而输出的Trigger ssDNA可以与Cas12酶、12-crRNA另外形成Cas12酶/12-crRNA/ Trigger ssDNA复合物，激活Cas12酶的反式切割活性，因此Sensor3能够将释放的Trigger ssDNA输入转化为具有反式切割活性的Cas12酶的输出。之后，被激活的Cas12酶对荧光检测探针进行切割，释放荧光基团。在这种情况下，Sensor2的每个输出会导致一个有活性的Cas12酶，进而产生更多数量的有活性的Cas12酶以及放大的荧光信号。因此，每个待测靶标核酸在所述核酸检测方法中被转换为放大的荧光信号，从而可以进行超灵敏的核酸检测。

在一些实施方式中，Cas12酶的工作浓度范围为0.05-1μM，Cas13酶的工作浓度范围为0.001-1μM，12-crRNA的工作浓度范围为0.05-1μM，13-crRNA的工作浓度范围为0.001-1μM，级联辅助探针的工作浓度范围为10-500nM，荧光检测探针的工作浓度范围为1-10μM。

在一些具体的实施方式中，每30μL的反应体系中，包括60nM Cas12酶、60nM 12-crRNA、60nM Cas13酶、60nM 13-crRNA、3× Cas缓冲液、1U/μL Murine RNase Inhibitor、80nM级联辅助探针以及3μM荧光检测探针，以及6uL待测靶标核酸样品。

在一些实施方式中，反应条件为恒温25-37°C反应，反应时间20-60min。

将待测靶标核酸样品加入反应体系中，并进行恒温定时反应。发生反应时，Cas13酶和待测靶标核酸样品的序列RNA、13-crRNA形成RNA/Cas13酶/13-crRNA复合物，激活Cas13酶的反式切割活性；被激活的Cas13酶对Bubble ssRNA形成的外凸的结构进行反式切割，之后，Bubble ssRNA未被切割的片段从Trigger ssDNA上脱离，释放Trigger ssDNA序列；被释放的Trigger ssDNA与Cas12酶、12-crRNA形成Cas12酶/12-crRNA/Trigger ssDNA复合物，激活Cas12酶的反式切割活性；被激活的Cas12酶对荧光检测探针进行切割，释放荧光基团；之后，检测荧光基团的荧光信号，即可以得到待测靶标核酸样品的核酸检测结果。

在一些实施方式中，可检测标志物可为荧光基团，但不限于此。也可以为地高辛或其它可产生检测信号的物质。

本发明实施例提供的核酸检测方法中，信号检测方法为基于荧光的信号检测，但并不限于此。还可以更换为其它的可视化信号检测方法，例如：免疫层析分析法（LFA），金纳米粒子的比色分析方法，基于电子读出系统的分析法等等。

本发明实施例还提供一种CRISPR级联核酸检测方法的应用，将所述的核酸检测方法应用于单链RNA的检测。

在一些实施方式中，待测靶标核酸样品可以为细胞、细菌、组织和血液，但不限于此。待测靶标核酸样品可经过核酸提取处理，例如，使用核酸提取试剂盒，根据核酸提取试剂盒说明书提供的核酸提取技术提取获得的总核酸样品。

在一些实施方式中，待测靶标核酸样品来源于包括人类在内的哺乳动物或植物，但不限于此。

在一些实施方式中，待测靶标核酸样品还可以为细菌、病毒等微生物。例如：非洲猪瘟病毒(ASFV)、狂犬病病毒(pseudorabies virus)、人乳头瘤病毒-18(HPV-18)、人乳头瘤病毒16(HPV-16)、艾滋病病毒(HIV)、金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)或单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等等。

下面通过具体实施例对本发明一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用做进一步的解释说明：

若无特别说明，实施例中使用的化学试剂均为市售试剂。

实施例1

1、靶标基因组的选取

利用NCBI查找靶标序列，利用基因名或基因ID等已知信息，关联到与之对应的Reference Sequence（RefSeq），从而获取到靶标序列信息，最后利用NCBI Blast进行同源性比对，找到保守序列。

2、Cas12酶的活性验证

以Lbcas12a蛋白为例：

LbCas12a蛋白的活性验证：设计并合成一条荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA探针(具体为5’-FAM-TTTTTT-BHQ1-3’)，并配制基于CRISPR-Cas系统的反应体系，用于实时荧光验证LbCas12a的反式切割。

具体反应体系包括（30μL体系）：60nM Lbcas12a，60nM靶标向导12-crRNA，3× Cas缓冲液，3μM ssDNA探针，40nM靶标序列，1U/μL Murine RNase Inhibitor。

采用恒温37°C反应30-60min，然后进行荧光终点检测，其检测条件为：激发波长为494nm，发射波长为518nm，然后检测在有或无添加LbCas12a酶的条件下，体系中的荧光信号数值变化。

结果如图2所示，添加LbCas12a酶的实验组与无添加LbCas12a酶的对照组具有明显的荧光信号差异：添加LbCas12a酶的实验组中，靶标序列和12-crRNA结合并成功激活LbCas12a的反式切割活性，体系中的ssDNA探针被切割，并释放出荧光基团；而无添加LbCas12a酶的对照组，体系中几乎没有荧光信号的产生。

3、Cas13酶的活性验证

以Lwacas13a蛋白为例：

LwaCas13a蛋白的活性验证：设计并合成一条荧光基团和淬灭基团标记的ssRNA探针(具体为5’-FAM-UUUUU-BHQ1-3’) ，并配制基于CRISPR-Cas系统的反应体系，用于实时荧光验证Lwacas13a的反式切割。

具体反应体系包括（30μL体系）：60nM Lwacas13a，60nM 靶标向导13-crRNA，3×Cas缓冲液，3μM ssDNA探针，40nM靶标序列，1U/μL Murine RNase Inhibitor。

采用恒温37°C反应30-60min，然后进行荧光终点检测，其检测条件为：激发波长为494nm，发射波长为518nm，然后检测在有或无添加LwaCas13a酶的条件下，体系中的荧光信号数值变化。

结果如图3所示，添加LwaCas13a酶的实验组与无添加LwaCas13a酶的对照组具有明显的荧光信号差异；添加LwaCas13a酶的实验组中，靶标序列和13-crRNA结合并成功激活LwaCas13a的反式切割活性，体系中的ssRNA探针被切割，并释放出荧光基团；而无添加LwaCas13a酶的对照组，体系中几乎没有荧光信号的产生。

4、级联辅助探针的设计

Cas13酶和Cas12酶之间的级联反应依赖于传感单元Sensor2和传感单元Sensor3之间的巧妙传递。因此，构建即能够被Cas13酶反式切割，又能激活Cas12酶非特异性切割的级联辅助探针是首要目标。

可运用Nupack和DINAMelt软件设计所述级联辅助探针，然后进行合成；所述级联辅助探针也可以通过委托第三方公司合成获得。

本发明实施例级联辅助探针包括Trigger ssDNA和Bubble ssRNA。其中，TriggerssDNA能够与12-crRNA碱基互补配对，引发荧光检测探针被所述的Cas12酶反式切割，进而产生可检测信号；Bubble ssRNA是能与Trigger ssDNA序列互补的序列片段。

以Trigger ssDNA序列5’-CGTTGATTAGAGGAGATTAGTTGC- 3’为例，设计与TriggerssDNA杂交的Bubble ssRNA，Bubble ssRNA包含一个5nt的外凸结构。Bubble ssRNA可以设计为：5’-GCAACUAAUCUCAUAUACUCUAAUCAACG- 3’。

构建的级联辅助探针如图4所示。在额外加入具有反式切割活性的Lwacas13a后，该级联辅助探针在37°C左右反应温度下，Bubble ssRNA的外凸结构会被切割，释放出原本封闭的Trigger ssDNA，并且该Trigger ssDNA能识别与之互补的靶标向导RNA（12-crRNA），并激活Lbcas12a的反式切割活性。

实施例2

为了进一步验证本发明实施例所描述的核酸检测方法的可行性，选择新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进行核酸检测。应当注意的是，实施例仅用来举例，并不构成对本发明保护范围的任何限制。

1、设计靶标SARS-CoV-2基因组的靶标向导RNA(13-crRNA)

13-crRNA靶向SARS-CoV-2基因组的正向序列，SARS-CoV-2基因组的正向序列源于SARS-CoV-2的E基因组。13-crRNA的正向序列为：5’-GAGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCAAGACUCACGUUAACAAUAUUGCAGCA- 3’。

待测样本的核酸由第三方合成公司合成，选取的片段为SARS-CoV-2的E基因片段（NCBI Reference Sequence: NC_045512.2），其正向序列为：5’-UGCUGCAAUAUUGUUAACGUGAGUCUUG- 3’。

2、制备检测反应体系

检测反应体系总体积为30μL，其中包括60nM Lbcas12a，60nM 12-crRNA，60nMLwacas13a，60nM 13-crRNA，3× Cas缓冲液，1U/μL Murine RNase Inhibitor，80nM级联辅助探针，3μM荧光探针，6μL待测样本RNA（10nM）, 以不加靶标SARS-CoV-2基因组为阴性对照；恒温37°C反应30-60min，然后进行终点荧光检测。

其中，Lbcas12a和Lwacas13a为实施例1中所述；级联辅助探针由以下两条核酸杂交形成，分别为：

Trigger ssDNA: 5’-CGTTGATTAGAGGAGATTAGTTGC- 3’

Bubble ssRNA: 5’-GCAACUAAUCUCAUAUACUCUAAUCAACG- 3’

结果如图5所示，可以看出，本发明实施例提供的核酸检测方法能够对SARS-CoV-2的E基因组进行快速检测。

实施例3

为了进一步评估本发明实施例所描述的核酸检测方法的检测灵敏度，以SARS-CoV-2的E基因片段为靶标，并进行一系列梯度稀释(1amol/L、10amol/L、10fmol/L、10pmol/L、10nmol/L；注：amol/L为10^-18mol/L)，以不加靶标SARS-CoV-2基因组为阴性对照，进行核酸检测。所述检测方法与试剂与实施例2相同。

结果如图6所示，可以看出，本发明实施例提供的CRISPR级联核酸检测方法可以实现低至1aM的SARS-Cov-2的E基因检测。

实施例4

为了验证本发明实施例所描述的核酸检测方法在分子诊断方面是否合格，直接利用新冠标准品作为输入，并进一步评估了本发明在检测病毒方面的效用。通过qPCR仪实时检测在不同浓度的新冠标准品下的荧光信号，以不加靶标SARS-CoV-2基因组为阴性对照，所述检测方法以及试剂与实施例2相同。

结果如图7所示，可以看出本发明可以在1小时内检测到低至1.274copies/μL的新冠标准品，这些结果证明了本发明在灵敏性方面具有无与伦比的优势。所述核酸检测方法可称为“Dr.House”（Dual-cas nucleases，Rapid，High-signal Output andUltraSEnsitive diagnosis）。

综上所述，本发明提供了一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用，利用Cas12酶和Cas13酶的活性，将与待测靶标核酸序列互补的13-crRNA和Cas13酶混合得到Cas13核糖核蛋白（13-RNP），12-crRNA和Cas12酶混合得到Cas12核糖核蛋白（12-RNP），并将与12-crRNA互补的Trigger ssDNA和Bubble ssRNA互补杂交形成级联辅助探针。之后，将上述材料一起组成反应体系。13-crRNA引导Cas13酶特异性结合待测靶标核酸序列，引发级联辅助探针被Cas13酶反式切割，释放的Trigger ssDNA能够与12-crRNA碱基互补配对，引发荧光检测探针被所述的Cas12酶反式切割，之后产生可检测信号。所述核酸检测方法具有靶标特异性结合、非特异性切割活性的特点。应用该方法可以直接检测单链RNA靶标及靶标对应的多个检测位点，依靠CRISPR-Cas系统自身即可实现“aM级(10^-18mol/L)”的核酸检测，在灵敏性方面具有无与伦比的优势；而且，与其它利用Cas酶的CRISPR核酸检测方法不同，该方法在检测靶标的设计上灵活性高，并且无需扩增即可检测单链RNA核酸样品，具有超灵敏检测、成本低廉、操作简便、检测时间短、闭管检测和实时监测等优点。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种CRISPR级联核酸检测系统及其检测方法与应用

<160> 6

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400>

aauuucuacu cuuguagau 19

<210> 2

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400>

ga gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaac32

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400>

cgttgattag aggagattag ttgc 24

<210> 4

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400>

gcaacuaauc ucauauacuc uaaucaacg 29

<210> 5

<211> 60

<212> RNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400>

ga gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac caagacucacguuaacaauauugcagca60

<210> 6

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400>

ug cugcaauauuguuaacgugagucuug28

Claims (8)

1.一种CRISPR级联核酸检测系统，其特征在于，包括待测靶标核酸、级联辅助探针、核糖核蛋白复合体、荧光检测探针以及酶缓冲液；所述级联辅助探针由触发单链DNA和外凸单链RNA杂交形成，所述外凸单链RNA的序列与所述触发单链DNA的序列互补，所述外凸单链RNA与触发单链DNA杂交形成一个带有外凸结构的核酸双链，所述触发单链DNA激活Cas12酶的核酸酶活性；所述核糖核蛋白复合体包括Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白；所述Cas13核糖核蛋白包括靶标向导RNA-13和Cas13酶，所述靶标向导RNA-13是Cas13酶的靶标向导RNA，所述靶标向导RNA-13的基因组靶向序列与待测靶标核酸序列互补，所述靶标向导RNA-13包括通用序列Y和基因组靶向序列Y，所述通用序列Y特异性识别所述Cas13酶，所述基因组靶向序列Y特异性识别待测靶标核酸序列；所述Cas12核糖核蛋白包括靶标向导RNA-12和Cas12酶，所述靶标向导RNA-12是Cas12酶的靶标向导RNA，所述靶标向导RNA-12的基因组靶向序列与级联辅助探针的触发单链DNA碱基序列互补，所述靶标向导RNA-12包括通用序列X和基因组靶向序列X，所述通用序列X特异性识别所述Cas12酶，所述基因组靶向序列X特异性识别所述触发单链DNA碱基序列。

2.根据权利要求1所述的CRISPR级联核酸检测系统，其特征在于，所述Cas12酶包括Cas12a蛋白、Cas12b蛋白和Cas12c蛋白中的一种或多种；所述Cas13酶包括Cas13a蛋白、Cas13b蛋白、Cas13c蛋白和Cas13d蛋白中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的CRISPR级联核酸检测系统，其特征在于，所述荧光检测探针两端分别修饰有荧光基团和猝灭基团。

4.根据权利要求3所述的CRISPR级联核酸检测系统，其特征在于，所述荧光基团包括羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素和六氯-6-甲基荧光素中的一种或多种；所述猝灭基团包括4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸和黑洞猝灭剂中的一种或多种。

5.一种CRISPR级联核酸检测方法，其特征在于，所述的检测方法为非诊断目的，所述的核酸检测方法基于权利要求1-4任一所述的CRISPR级联核酸检测系统，具体包括步骤：

步骤一，制备级联辅助探针：

所述级联辅助探针由触发单链DNA和外凸单链RNA按照一定比例混合，在杂交缓冲液中杂交形成；

步骤二，制备核糖核蛋白复合体：

所述核糖核蛋白复合体包括Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白，所述Cas13核糖核蛋白和Cas12核糖核蛋白分别由靶标向导RNA-13和Cas13酶、靶标向导RNA-12和Cas12酶按照一定比例混合后得到；

步骤三，制备反应体系：

将制备得到的所述级联辅助探针和所述核糖核蛋白复合体与荧光检测探针、酶缓冲液混合，即得到所述反应体系；

步骤四，进行Cas酶切反应，检测信号并分析结果：

将待测靶标核酸样品加入到所述反应体系中，进行恒温定时反应，检测产生的荧光信号并分析结果。

6.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于，发生反应时，Cas13酶和待测靶标核酸样品的序列RNA、靶标向导RNA-13形成RNA/Cas13酶/靶标向导RNA-13复合物，激活Cas13酶的反式切割活性；被激活的Cas13酶对级联辅助探针的外凸单链RNA进行反式切割，之后，外凸单链RNA未被切割的片段从触发单链DNA上脱离，释放触发单链DNA序列；被释放的触发单链DNA与Cas12酶、靶标向导RNA-12形成Cas12酶/靶标向导RNA-12/触发单链DNA复合物，激活Cas12酶的反式切割活性；被激活的Cas12酶对荧光检测探针进行切割，释放荧光基团，最终形成级联系统；之后，检测荧光基团的荧光信号，即得到待测靶标核酸样品的核酸检测结果。

7.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于，Cas12酶的工作浓度范围为0.05-1μM，Cas13酶的工作浓度范围为0.001-1μM，靶标向导RNA-12的工作浓度范围为0.05-1μM，靶标向导RNA-13的工作浓度范围为0.001-1μM，级联辅助探针的工作浓度范围为10-500nM，荧光检测探针的工作浓度范围为1-10μM；恒温25-37°C反应，反应时间20-60min。

8.一种如权利要求5所述的CRISPR级联核酸检测方法的应用，其特征在于，所述应用为非诊断目的，将所述的核酸检测方法应用于单链RNA的检测。

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