CN112980844A

CN112980844A - 针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法

Info

Publication number: CN112980844A
Application number: CN202110294982.XA
Authority: CN
Inventors: 王鑫杰; 李浔; 钟名天; 马晓冬
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2021-03-19
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2021-06-18

Abstract

本发明公开了一种针对有转录活性的SARS‑CoV‑2的检测试剂盒和使用方法。所述的试剂盒包含针对有转录活性5UTR‑E基因的crRNA和等温扩增引物，所述的crRNA是由crRNA1、crRNA2或crRNA3中的一种以上组成，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；所述的等温扩增引物是由5’UTR‑E RPA‑F1和5’UTR‑E RPA‑R4组成，其序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14所示。本发明创造性地筛选到5UTR‑E作为检测靶标，有效区分有活性的SARS‑CoV‑2，可以特异地区分有转录活性SARS‑CoV‑2，而且检测时间可缩短到45min。

Description

针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法

技术领域

本发明属于病毒的分子生物学检测领域，具体涉及一种针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法。

背景技术

严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)是COVID-19呼吸系统疾病的病因。SARS-COV-2是一种带包膜的正义单链RNAβ冠状病毒，属于冠状病毒科。针对SARS-CoV-2基因组RNA(gRNA)的核酸检测方法有助于COVID-19的早期诊断和控制。

目前，最常用的诊断方法，包括定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测病毒基因组核酸片段，无法区分样本是来自有复制活性SARS-CoV-2，抑或仅仅是病毒基因组RNA碎片。这种局限性取决于所选取的病毒基因组RNA(gRNA)上的靶标，例如为N基因或ORF1a/b基因。基于RT-qPCR的核酸检测需要专用仪器和训练有素的技术人员，这限制了其现场诊断应用，尤其是在资源有限的地区。因此，需要开发一种能快速检测区分是否有复制活性的SARS-CoV-2的检测方法。

基于CRISPR/Cas的核酸检测技术因其灵敏度高、特异性高、简单、省时等特点而显示出巨大的优势而得到开发利用。CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，Cas12a属于Cas酶第二家族，通过引导RNA指导识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当CRISPR/Cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。

发明内容

为解决现有技术中缺乏快速准确检测有复制转录活性SARS-CoV-2的方法，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的检测有复制转录活性SARS-CoV-2的试剂盒及使用方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种针对有转录活性5UTR-E基因的crRNA，由crRNA1、crRNA2或crRNA3中的一种以上组成，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；

优选地，所述的crRNA由crRNA1、crRNA2和crRNA3等比例混合而成。

一种针对有转录活性5UTR-E基因的等温扩增引物，由5’UTR-E RPA-F1和5’UTR-ERPA-R4组成，其序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14所示。

一种针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒，包括前述的crRNA和等温扩增引物；

优选地，所述试剂盒还包括ssDNA报告系统和/或Cas12a核酸酶；

更优选地，所述单链DNA(ssDNA)报告系统包括用于荧光检测的ssDNAFQ reporter(在本文中也称ssDNAFQ报告基因)；其中，所述ssDNAFQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：6FAM-TTATT-BHQ1(5’→3’)，命名为ssDNAFQ reporter：6FAM-TTATT-BHQ1(5’→3’)；

所述的试剂盒还包括RNase抑制剂和缓冲液；所述缓冲液可用于完成所述扩增，包括但不限于NEBuffer^TM 3.1。

上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)使用RNA提取试剂盒提取待测样本的总RNA；再使用前述的等温扩增引物扩增获得供检测的核酸；

步骤(1)所述的扩增，优选在35～40℃反应15min以上，特别优选在37～39℃反应25min；

步骤(1)所述的扩增，反应体系为50μL，其包括nμL总RNA，(18.5-n)μL ddH₂O、2μL5UTR-RPA-F、2μL 5UTR-RPA-R、2.5μL乙酸镁和25μL反应缓冲液；例如

Basickit的反应缓冲液；

0＜n≤18.5；n值由所述RNA样品的浓度决定，当所述DNA样品的浓度越高，则n值相对较低；当所述RNA样品的浓度越低，则n值相对较高；具体地，本领域技术人员可通过检测所述RNA样品的浓度来决定用于反应体系的RNA样品的量。

(2)配制如下表所示的反应体系，于35～40℃反应15min～2h；优选于37℃反应15～30min；

其中X为1～15，优选1～10，特别优选1～5；X值由核酸的浓度决定，当浓度越高，则X值相对较低；当浓度越低，则X值相对较高；具体地，本领域技术人员可通过检测所述核酸的浓度，决定用于反应体系的核酸量。

(3)利用酶标仪分析，或在荧光灯下肉眼判读核酸检测结果；

本发明提供的基于Cas12a的有复制转录活性SARS-CoV-2核酸快速检测技术既可利用酶标仪荧光检测也可以利用荧光肉眼检测。本发明中ssDNA FQ reporter，当使用酶标仪荧光检测时，设定检测激发光为485nm-520nm；当使用肉眼直接检测时，选用可产生485nm波长光源的发光器进行检测。

在使用荧光检测时，当Cas12a检测体系中存在特定的转录活性SARS-CoV-2亚基因组核酸序列，会由在特异性扩增引物和crRNA介导下特异性激活Cas12a蛋白的核酸内切酶活性。激活后的Cas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数或经485nm激发光激发产生肉眼可见的绿色荧光。相对应的，待检测样品中不存在特定的转录活性SARS-CoV-2亚基因组核酸序列时，不会有荧光读数或激发的绿色荧光。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明创造性地筛选到5UTR-E作为检测靶标，有效区分有活性的SARS-CoV-2。

(2)本发明方法利用Cas12a特异识别核酸荧光检测技术，实现对特定有转录活性SARS-CoV-2亚基因组核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。相较于灵敏度不高、特异性不强、耗时耗力的传统培养或测序方法，本发明可以特异地区分有转录活性SARS-CoV-2，而且检测时间可缩短到45min。

(3)本发明利用Cas12a特异识别核酸荧光检测技术，所需要的设备非常简单，不需要其他基于PCR检测技术的PCR仪。本发明使检测成本大大降低，操作简便，为基层实验提供了一个准确、快速、简便的检测方法。

附图说明

图1为基于Cas12a靶向亚基因组E或N基因核酸crRNA。

图2为基于亚基因组E或N基因核酸最优等温扩增引物筛选。

图3为基于Cas12a检测亚基因组E或N基因核酸灵敏度测定。

图4为基于Cas12a检测亚基因组E基因背景核酸特异性检测。

图5为基于Cas12a检测亚基因组E基因特异性检测。

图6为基于Cas12a可视荧光法高特异检测有转录活性SARS-CoV-2；其中，样品1、2、3、4、5、7、8号为有转录活性病毒样品核酸，6号样品为没有转录活性阴性样品。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明中：RPA扩增试剂盒

Basic kit购自TwistAmp公司；crRNA体外转录盒子MEGAshortscript T7 Transcription Kit和纯化盒子MEGAclear Kit购自Ambion公司；常规试剂如Tris-Base、NaCl、Tris-HCl、MgCl₂、BSA和甘油等购自Thermo Fisher；检测用核酸片段、ssDNA探针和RNA合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。

实施例1：有转录活性SARS-CoV-2亚基因片段快速灵敏检测

1.1核酸制备

针对SARS-CoV-2的E基因和N基因设计合成包含5’UTR的核酸片段，通过体外转录获得对应的E基因和N基因亚基因组RNA，分别命名为5UTR-ERNA(SEQ ID NO:21)和5UTR-NRNA(SEQ ID NO:22)。纯化后测量基因序列的质量和浓度，并保存在-80℃直至使用。

1.2针对SARS-CoV-2的E基因和N基因的crRNA的设计制备

针对5UTR-E RNA和5UTR-N RNA基因序列，寻找包含Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA。设计完成后，合成crRNA。crRNA、及其对应的RNA均由南京金斯瑞公司合成。

本发明提供的针对E基因和N基因特异性基因的crRNA包括SEQ ID NO:1～6，具体信息如表1所示：

表1针对SARS-CoV-2E基因和N基因crRNA

1.3等温扩增反应

本发明中，利用等温扩增(RPA)对SARS-CoV-2的E基因和N基因5UTR-ERNA和5UTR-NRNA核酸片段分别进行预扩增，以便进行Cas12a检测反应。

按照等温扩增反应要求，分别设计并合成RPA扩增引物RPA-F(正向引物)和RPA-R(反向引物)，序列为SEQ ID NO:7～20，如表2所示。

参考RPA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。具体操作如下：等温扩增在50μL反应体系进行。将nμL样品，(18.5-n)μL ddH₂O，2μL RPA-F，2μL RPA-R(浓度为10μM)和25μL反应缓冲液(

Basic kit，购自TwistAmp公司)混匀，加入反应管溶解混匀。最后，加入2.5μL乙酸镁(

Basic kit，浓度为280mM)，混匀后在39℃下孵育30分钟。RPA产物进行下一步检测。

表2针对SARS-CoV-2E基因和N基因特异性RPA引物序列

1.4全波长酶标仪荧光检测

本实施例中，检测采用20μL体系，如表3所示：

表3 SARS-CoV-2E基因和N基因Cas12a检测体系

酶标仪荧光检测中，Cas12a对目的基因检测体系依次加入2μL Buffer、1μL RNase抑制剂、1μL Cas12a、1μL ssDNA FQ reporter(ssDNA FQ reporter：6FAM-TTATT-BHQ1(5’→3’))、5μL RPA产物(即表3中供检测的核酸)、1μL crRNA和9μL H₂O。各组分混合均匀后于37℃反应15min。其中，上述反应体系中RNase抑制剂浓度为40U/μL，Cas12为200ng/μL，ssDNA FQ reporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1μM/μL。

首先，依次检测针对E基因和N片段的crRNA工作效率。在Cas12a检测体系中，各加入1μL crRNA，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应30min，对上述反应产物进行后续结果检测判定。

利用荧光检测判定Cas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测15min荧光数值为反应值。其反应检测结果如图1。

结果显示：针对有转录活性5UTR-E基因crRNA1、crRNA2和crRNA3都能高特异性识别靶核酸，对其等比例混合三种crRNA并命名为E-crRNAmix；

针对有转录活性5UTR-N基因crRNA1、crRNA2和crRNA3都能高特异性识别靶核酸，对其等比例混合三种crRNA并命名为N-crRNAmix。

后续选择检测信号较强的E-crRNAmix和N-crRNAmix用于以下的实验。

实施例2：筛选高效扩增5UTR-E和5UTR-N区域的RPA引物

2.1 RPA引物设计与合成

根据等温扩增引物设计的要求，针对5UTR-E片段设计出4条For引物与4条Reverse引物，序列为SEQ NO.7至SEQ NO.14；针对5UTR-N片段设计出3条For引物与3条Reverse引物，序列为SEQ NO.15至SEQ NO.20(如表2所示)，交由南京金斯瑞公司直接合成。将For和Reverse引物两两搭配，筛选出最高效的引物组合。

2.2 RPA等温扩增反应

本实施例以5UTR-E或5UTR-N RNA为模板筛选RPA扩增引物。以10倍梯度对质粒样品进行稀释，获得每微升含有1*e3拷贝5UTR-E或5UTR-N RNA模拟质粒的样品。具体操作步骤为：将2.5μL RPA-F，2.5μL RPA-R，1μL模拟质粒样品和42μL反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2μL激活剂混匀，于37℃下反应30min。产物可直接用于下一步检测。

2.3 Cas12a荧光检测反应

本实施例采用20μL检测体系，其中样品为上述反应产物，取10μL检测。不同RPA引物组合扩增等量质粒所得产物的全波长酶标仪荧光检测结果如图2所示。

结果表明，针对5UTR-E基因片段，5’UTR-E RPA-F1与5’UTR-E RPA-R4引物组合的扩增效率最好，因此选择5’UTR-E RPA-F1与5’UTR-E RPA-R4作为5UTR-E基因片段扩增所用引物；

针对5UTR-N基因片段5’UTR-N RPA-F2与5’UTR-N RPA-R2引物组合的扩增效率最好，因此选择5’UTR-N RPA-F2与5’UTR-N RPA-R2作为5UTR-N基因片段扩增所用引物。

实施例3：基于酶标仪荧光检测，高灵敏度地检测有转录活性SARS-CoV-2核酸片段

本实施例中，为测定Cas12a荧光法在高灵敏度地检测有转录活性SARS-CoV-2核酸片段中的灵敏度，进行以下检测。

首先，根据5UTR-E RNA和5UTR-N RNA基因片段对应DNA片段样品(依据其碱基数目和质量浓度)计算检测片段的拷贝数目，并进行10倍梯度稀释，获得每微升含有1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹和1拷贝数(copy/μL)的测试样品。对上述稀释样品进行Cas12a特异性反应，参照实施例1中检测步骤进行检测。操作简述如下：1μL梯度稀释样品，加入到50μL RPA等温扩增反应体系进行扩增。取10μL等温扩增产物，加入到20μL Cas12a荧光核酸检测体系，混合均匀，37℃反应30min，测量荧光数值。

本实施例中，检测结果如图3所示：针对有转录活性5UTR-E基因可以有效检测到10拷贝的核酸；针对有转录活性5UTR-N基因可以有效检测到100拷贝的核酸采用酶标仪。

因此，优先选择针对5UTR-E基因作为检测有转录活性SARS-CoV-2病毒核酸的靶基因。

实施例4：基于Cas12a荧光法高特异性检出有转录活性SARS-CoV-2核酸片段

本实施例中，为检测Cas12a荧光法能否对有背景核酸的样品进行高特异检出有转录活性SARS-CoV-2核酸片段，进行以下检测。

首先，选取本发明中需要检测的5UTR-E RNA、与来自人源细胞系(A549、HCT116和Saliva细胞)背景核酸样品作为待测样品进行检测；以及包含5UTR或没有包含5UTR的单独E基因片段作为检测样品；水样品为阴性对照NC。

其次，参照实施例1，利用5’UTR-E RPA-F1与5’UTR-E RPA-R4引物组合通过RPA反应扩增靶核酸。随后进行Cas12a荧光检测中，依次加入2μL Buffer、1μLRNase抑制剂、1μLCas12、1μL ssDNA FQ reporter、1μL crRNA和10μL检测样品。各组分混合均匀，在37℃反应15min。本检测体系中，RNase抑制剂浓度为40U/μL，Cas12浓度为200ng/μL，ssDNA FQreporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1μM。

本实施例中，在Cas12a检测体系在37℃反应15min，在485nm激光灯下用肉眼对检测产物荧光反应进行判读。

检测结果如图4所示，5’UTR-E RPA-F1与5’UTR-E RPA-R4引物组合可以高特异地区分在有转录活性SARS-CoV-2E基因片段，而对其他背景核酸没有交叉反应。

检测结果如图5所示，5’UTR-E RPA-F1与5’UTR-E RPA-R4引物组合能高特异性地区分来自有转录活性SARS-CoV-2的5UTR-E核酸片段，而对不包含5UTR的来自没有转录活性样品的E基因片段没有交叉反应。证明本发明能实现高效特异的检测区分有转录活性SARS-CoV-2。

实施例5：Cas12a荧光法从样品中快速特异地检测区分有转录活性SARS-CoV-2

本实施例的实验方案参照上述案例，样品为包含或不包含有转录活性SARS-CoV-2核酸的样品。

首先，每个待检测样品取5μL进行RPA预扩增，步骤与实施例1中相同，获得Cas12a检测样品。在Cas12检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μL RNase抑制剂、1μL Cas12、1μLssDNA FQ reporter、10μL RPA产物、1μL crRNA。各组分混合均匀，在37℃反应30min，15min拍照记录荧光结果。

本实施例中，如结果图6所示，荧光灯下肉眼可看出样品1、2、3、4、5、7和8号为包含有转录活性SARS-CoV-2核酸，而样品6号为阴性，没有转录活性SARS-CoV-2核酸。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> 针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5UTR-E-crRNA1

<400> 1

ggaagagaca ggtacgttaa tag 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5UTR-E-crRNA2

<400> 2

ttgctttcgt ggtattcttg cta 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5UTR-E-crRNA3

<400> 3

gtggtattct tgctagttac act 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5UTR-N-crRNA1

<400> 4

gtggaccctc agattcaact ggc 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5UTR-N-crRNA2

<400> 5

atcgcgcccc actgcgttct cca 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5UTR-N-crRNA3

<400> 6

cccaataata ctgcgtcttg gtt 23

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’UTR-E RPA-F1

<400> 7

tttatacctt cccaggtaac aaaccaacca ac 32

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’UTR-E RPA-F2

<400> 8

ccttcccagg taacaaacca accaactttc gatc 34

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’UTR-E RPA-F3

<400> 9

tcccaggtaa caaaccaacc aactttcgat ctc 33

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’UTR-E RPA-F4

<400> 10

ccaaccaact ttcgatctct tgtagatctg ttctc 35

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’UTR-E RPA-R1

<400> 11

tattgcagca gtacgcacac aatcgaagcg cag 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’UTR-E RPA-R2

<400> 12

cgcacacaat cgaagcgcag taaggatggc tag 33

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’UTR-E RPA-R3

<400> 13

cagtaaggat ggctagtgta actagcaaga atacc 35

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5’UTR-E RPA-R4

<400> 14

ctagtgtaac tagcaagaat accacgaaag c 31

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5'UTR-N RPA-F1

<400> 15

ccaaccaact ttcgatctct tgtagatctg ttctc 35

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5'UTR-N RPA-F2

<400> 16

ttctctaaac gaacttatgt ctgataatgg acccc 35

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5'UTR-N RPA-F3

<400> 17

ccccaaaatc agcgaaatgc accccgcatt acg 33

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5'UTR-N RPA-R1

<400> 18

tcatctggac tgctattggt gttaattgga acgcc 35

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5'UTR-N RPA-R2

<400> 19

atttaaggtc ttccttgcca tgttgagtga gagc 34

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5'UTR-N RPA-R3

<400> 20

catgttgagt gagagcggtg aaccaagacg cag 33

<210> 21

<211> 302

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5UTR-E RNA

<400> 21

auuaaagguu uauaccuucc cagguaacaa accaaccaac uuucgaucuc uuguagaucu 60

guucucuaaa cgaacuuaug uacucauucg uuucggaaga gacagguacg uuaauaguua 120

auagcguacu ucuuuuucuu gcuuucgugg uauucuugcu aguuacacua gccauccuua 180

cugcgcuucg auugugugcg uacugcugca auauuguuaa cgugagucuu guaaaaccuu 240

cuuuuuacgu uuacucucgu guuaaaaauc ugaauucuuc uagaguuccu gaucuucugg 300

uc 302

<210> 22

<211> 420

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5UTR-N RNA

<400> 22

auuaaagguu uauaccuucc cagguaacaa accaaccaac uuucgaucuc uuguagaucu 60

guucucuaaa cgaacuuaug ucugauaaug gaccccaaaa ucagcgaaau gcaccccgca 120

uuacguuugg uggacccuca gauucaacug gcaguaacca gaauggagaa cgcagugggg 180

cgcgaucaaa acaacgucgg ccccaagguu uacccaauaa uacugcgucu ugguucaccg 240

cucucacuca acauggcaag gaagaccuua aauucccucg aggacaaggc guuccaauua 300

acaccaauag caguccagau gaccaaauug gcuacuaccg aagagcuacc agacgaauuc 360

guggugguga cgguaaaaug aaagaucuca guccaagaug guauuucuac uaccuaggaa 420

Claims

1.一种针对有转录活性5UTR-E基因的crRNA，其特征在于：是由crRNA1、crRNA2或crRNA3中的一种以上组成，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的crRNA，其特征在于：是由crRNA1、crRNA2和crRNA3等比例混合而成。

3.一种针对有转录活性5UTR-E基因的等温扩增引物，其特征在于：是由5’UTR-E RPA-F1和5’UTR-E RPA-R4组成，其序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14所示。

4.一种针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的crRNA和权利要求3所述的等温扩增引物。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：还包括ssDNA报告系统和/或Cas12a核酸酶。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的ssDNA报告系统包括用于荧光检测的ssDNA FQ reporter：6FAM-TTATT-BHQ1(5’→3’)。

7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：还包括RNase抑制剂和缓冲液。

8.权利要求4-7任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)使用RNA提取试剂盒提取待测样本的总RNA；再使用权利要求3所述的等温扩增引物扩增获得供检测的核酸；

(2)配制如下表所示的反应体系，于35～40℃反应15min～2h；

(3)利用酶标仪分析，或在荧光灯下肉眼判读核酸检测结果；

若检测体系中存在特定的转录活性SARS-CoV-2亚基因组核酸序列，使用酶标仪会检测到荧光读数或经485nm激发光激发产生肉眼可见的绿色荧光；

待检测样品中不存在特定的转录活性SARS-CoV-2亚基因组核酸序列时，不会有荧光读数或激发的绿色荧光。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：步骤(1)所述的扩增，是在35～40℃反应15min以上。

10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：步骤(1)所述的扩增，反应体系为50μL，其包括nμL总RNA，(18.5-n)μL ddH₂O、2μL 5UTR-RPA-F、2μL 5UTR-RPA-R、2.5μL乙酸镁和25μL反应缓冲液。