CN116479093A - 基于crispr荧光法的犀牛核酸快速检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测试剂盒，包括适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，所述CRISPR荧光检测体系包括：针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA；高效等温扩增引物组合；CRISPR‑Cas12a蛋白；以及单链DNA报告系统。本发明还公开了基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速方法，以及一套用于犀牛特异性核酸检测的Cas12a反应体系和特异性crRNA，方便用于现场动物源性成分的快速检测鉴定。本发明首次采用Cas12a荧光法特异性检测犀牛核酸，具有灵敏度较高、特异性强、用时短、操作难度低、不依赖大型实验仪器和昂贵试剂等优势，其检测结果既可利用酶标仪荧光检测，也可在荧光灯下进行肉眼直接判读。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种对犀牛核酸的快速检测方法及试剂盒，更具体地说，是关于一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测方法及检测试剂盒。
背景技术
历史上曾经有二十多种犀牛广泛分布于世界各地。但目前，印度犀牛(Rhinocerosunicornis)，爪哇犀牛(Rhinocero ssondaicus)，苏门答腊犀牛(Didermocerussumatrensis)，非洲黑犀牛(Diceros bicornis)和非洲白犀牛(Ceratotherium simum)是目前仅存的5种犀牛，并且均处于濒危状态。
如何利用技术手段对犀牛源性制品进行快速准确的鉴定是业界面临的一个重大挑战。因此迫切需要建立精确、快速、高灵敏的犀牛特异性检测技术体系对犀牛角及其产品进行物种鉴定。
目前，对于犀牛角物种的鉴定技术主要依赖于传统形态学鉴定技术、蛋白质电泳法、实时荧光定量检测技术、以及基于扩增子测序和DNA条形码检测技术。其中，形态学鉴定技术依赖于专业人士的长期研究积累，可以快速对物种进行区分，但是其鉴定严重依赖于完整的特征性形态，而对于相关制品，特别是加工过的样本，例如交粉、丸剂药物、加工产品等不具备形态学特征的样本则无法完成鉴定。蛋白质相关分析方法对于经过加热导致蛋白变性的样本也无法完成检测鉴定。而基于DNA的分子生物学方法则体现出了明显的检测优势。但荧光定量PCR技术和基于扩增子测序和DNA条形码的检测技术均严重依赖高级别分子生物学实验室和较为大型的仪器设备，且检测成本较高，检测周期也比较长，无法满足现场快速检测的实际场景需求。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统(Barrangou,R.,et al.,CRISPR providesacquired resistance against viruses in prokaryotes.Science,2007,315(5819):p.1709-12)，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas12a(Cas12a)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域(Marraffini,L.A.and E.J.Sontheimer,CRISPR interference limits horizontal genetransfer in staphylococci by targeting DNA.Science,2008.322(5909):p.1843-5)。Cas12a酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine,T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当CRISPR-Cas12a蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。
发明内容
针对目前对于犀牛物种特异性现场快速检测鉴定所存在的缺点和不足，本发明基于CRISPR-Cas12a酶的上述特性，开发了一种快速准确的检测方法，用于对犀牛特异性靶序列进行检测。首先，对样品进行核酸释放和富集，并在等温条件下同时进行重组酶聚合酶扩增(ERA)(Liu,S.,et al.,CRISPR/Cas12a Technology Combined with RT-ERA for Rapidand Portable SARS-CoV-2Detection.Virol Sin,2021.36(5):p.1083-1087)和Cas12a-crRNA复合物结合并切割靶标dsDNA，其激活ssDNA的反式切割，与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。这种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因的新方法，为快速准确检测犀牛特异性核酸提供了强有力的平台。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测试剂盒，所述检测试剂盒包括适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，所述CRISPR荧光检测体系包括：
针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA；
高效等温扩增引物组合；
CRISPR-Cas12a蛋白；以及
单链DNA报告系统。
根据本发明的优选实施例，所述针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明的优选实施例，所述高效等温扩增引物组合为引物Rhino-ERA-F1、Rhino-ERA-F2、Rhino-ERA-R1与Rhino-ERA-R2的组合，其序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
根据本发明，所述单链DNA报告系统是被6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记的产物为/5′6FAM/TTTATTT/3′BHQ1/。
本发明的第二个方面，提供了一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测方法，采用如上所述的检测试剂盒进行检测。
进一步的，所述犀牛核酸快速检测方法包括以下步骤：
S1：取待测样品，利用快速核酸释放剂释放样品中的核酸；
S2：将S1获得的核酸、以及高效等温扩增引物组合，加入到高效等温扩增体系中进行扩增，获得特异性产物；
S3：将S2获得的特异性产物加入CRISPR检测体系中，对特异性产物进行识别切割；
S4；利用荧光酶标仪检测或荧光灯肉眼直接检测判读待测样品中是否存在犀牛特异性核酸。
本发明的第三个方面，提供了一种针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA，其序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第四个方面，提供了一种适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，包括：
针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA；
高效等温扩增引物组合；
CRISPR-Cas12a蛋白；以及
单链DNA报告系统。
根据本发明的优选实施例，所述针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明的优选实施例，所述高效等温扩增引物组合为引物Rhino-ERA-F1、Rhino-ERA-F2、Rhino-ERA-R1与Rhino-ERA-R2的组合，其序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
根据本发明，所述单链DNA报告系统是被6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记的产物为/5′6FAM/TTTATTT/3′BHQ1/。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明系首次采用Cas12a荧光法特异性检测犀牛，具有灵敏度较高、特异性强、用时短、操作难度低、不依赖大型实验仪器和昂贵试剂等优势，其检测结果既可利用酶标仪荧光检测，也可在荧光灯下进行肉眼直接判读。
2、本发明公开了一套用于犀牛特异性核酸检测的Cas12a反应体系和特异性crRNA。方便用于现场动物源性成分的快速检测鉴定。
附图说明
图1是本发明的基于CRISPR-Cas12a荧光法检测犀牛特异性核酸快速检测方法的示意图。
图2是两段crRNA用于5种犀牛的核酸检测的特异性荧光检测结果。
图3是用于ERA扩增引物组合的筛选结果示意图。
图4是CRISPR荧光检测犀牛核酸灵敏度的测试结果。
图5是CRISPR荧光检测犀牛及其它哺乳动物的特异性的结果。
图6是肉眼观测CRISPR快速检测犀牛及其它哺乳动物的特异性的结果，其中的物种与图5中的物种一一对应。
图7显示了本发明的方法对现场采样的核酸样品的荧光检测结果。
图8显示了本发明的方法对现场采样的核酸样品的肉眼检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例中：ERA扩增试剂盒Basic kit购自TwistAmp公司；常规试剂如Tris-Base,NaCl,Tris-HCl，MgCl2，BSA和甘油等购自Thermo Fisher；检测用核酸片段、ssDNA探针和RNA合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自先达基因的快速核酸释放剂获得预处理的核酸；所使用的CRISPR-Cas12a蛋白可通过常规商业途径获得，例如/>Lba Cas12a(Cpf1)。
本发明的可用酶标仪荧光检测或荧光灯下肉眼直接判读的单链DNA报告系统，即被6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/5′6FAM/TTTATTT/3′BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter。当使用酶标仪荧光检测时，设定检测激发光为485nm～520nm；当使用肉眼直接检测时，选用可产生485nm波长光源的发光器进行检测。
在使用荧光检测时，当Cas12a检测体系中存在犀牛特异性核酸，会由在犀牛特异性crRNA介导下特异性激活CRISPR-Cas12a蛋白的核酸内切酶活性。激活后的Cas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数或肉眼可见绿色反应。相对应的，待检测样品中不存在犀牛核酸时，不会有荧光读数或肉眼不可见荧光反应。
本发明通过基因生物信息学分析，基于犀牛线粒体基因序列与NCBI数据库中的犀牛物种序列，设计针对犀牛的特异性检测crRNA。为保证检测特异性，对设计的crRNA序列与NCBI核酸数据库中包括哺乳动物、淡水海水鱼类、禽类、植物和微生物等物种的线粒体基因进行比对，确定没有较高同源性匹配。根据CRISPR-Cas12a识别特定PAM序列特点，在线粒体基因靶序列上设计2条特异性crRNA：Rhino-crRNA-1和Rhino-crRNA-2。通过检测筛选到Rhino-crRNA-2，其序列如SEQ ID NO.3所示，能更好地特异性识别犀牛线粒体基因，能准确高效完成检测。
本发明的总体技术路线如图1所示，包括以下3大部分：1)待检测核酸样品制备；2)Cas12a检测；和3)荧光检测。
实施例1、筛选针对犀牛的特异性crRNA
1.1、核酸制备
本实施例中，犀牛特异性的线粒体特异性靶点基因片段，是参考NCBI序列犀牛线粒体DNA(mitochondrial 12S ribosomal RNA gene，GenBank:MF066643.1)设计，命名为Rhino-1，其序列如下：
Rhino-1：(SEQ ID NO.1)
aaccttaccaacccttgctaattcagcctatataccgccatcttcagcaaaccctaaaaaggaactaaagtaagcacaagtataagacataaaaacgttaggtcaaggtgtagcttatgggatggagagaaatgggctacattttctactacaagaacaacaattatccaaacgaaagcccccatgaaactaagggctaaaggaggatttagcagtaaattaagaacagagagcttaattgaacaaggccataaagcacgcacacaccgcccgtcaccctccttaaata。
1.2、针对犀牛线粒体基因特异性crRNA的设计制备
针对犀牛线粒体的特异性crRNA的制备按照如下方案进行：针对SEQ ID NO.1所示的犀牛特异性线粒体基因片段，寻找包含Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23bp长度的2段crRNA，命名为Rhino-crRNA-1和Rhino-crRNA-2，其序列分别如SEQ ID NO.2和3所示，具体如下：
Rhino-crRNA-1：UaaUUUcUacUaagUgUagaUUACUACAAGAACAACAAUUAUCC；(SEQ IDNO.2)；
Rhino-crRNA-2：UaaUUUcUacUaagUgUagaUUCUCCAUCCCAUAAGCUACACCU；(SEQ IDNO.3)。
1.3、筛选特异性crRNA
利用PCR引物对Rhino-ERA-F1和Rhino-ERA-R1对5种犀牛(印度犀牛(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀牛(Rhinocero ssondaicus)、苏门答腊犀牛(Didermocerussumatrensis)、非洲黑犀牛(Diceros bicornis)、非洲白犀牛(Ceratotherium simum))的核酸样品进行扩增，获得对应的核酸产物；将经AxyPrep PCR Clean-up Kit(Axygen,CA,USA)纯化的PCR产物用ddH2O稀释调整为1×e10拷贝/μL，取1μL作为检测样品进行下一步的Cas12a荧光检测反应。
所述PCR引物的序列如下：
Rhino-ERA-F1:tgctaattcagcctatataccgccatcttcagc(SEQ ID NO.4)；
Rhino-ERA-R1:ggaggatttagcagtaaattaagaatagagagc(SEQ ID NO.6)。
1.4、Cas12a检测反应
本实施例中，犀牛Cas12a检测采用20μL体系，如以下表1所示(但不限于此，包含对相应成分的比例调整)：
表1、犀牛Cas12a检测体系
对于每一个crRNA，均设计检测样品分别为印度犀牛(Rhinocero sunicornis)、爪哇犀牛(Rhinocero ssondaicus)、苏门答腊犀牛(Didermoce russumatrensis)、非洲黑犀牛(Diceros bicornis)、非洲白犀牛(Ceratotherium simum)和ddH2O的六个反应管，以检测和比较交叉反应、灵敏度及背景信号。将混匀的体系置于37℃下反应20min。
1.5、全波长酶标仪荧光检测
将反应后的产物用全波长酶标仪进行荧光检测。其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测37℃下反应10min时的荧光值，其反应检测结果如图2所示。
结果表明，Rhino-crRNA-2检测的特异性和灵敏度均较好，具体见图2，因此选择Rhino-crRNA-2用于后续检测使用。
实施例2、筛选高效等温扩增的ERA引物
2.1ERA引物设计与合成
本实施例利用等温扩增技术(ERA)对犀牛检测靶点区域进行预扩增，用于后续的CRISPR-Cas12a检测反应。根据等温扩增引物设计的要求，设计出2条上游引物与2条下游引物，序列为SEQ NO.4至SEQ NO.7(表2)。将上游引物与下游引物随机搭配，筛选出最高效的引物组合。
表2、针对犀牛核酸特异性ERA引物序列
2.2、ERA等温扩增反应
本实施例以犀牛模拟质粒为模板筛选ERA扩增引物。根据质粒大小和分子量计算拷贝数，以10倍梯度对质粒样品进行稀释，获得每微升含有1×e4拷贝的质粒样品。具体操作步骤为：
对表2所列的引物进行不同组合，将2.5μL组合引物，1μL模拟质粒样品和42μL反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2μL激活剂混匀，于37℃下反应10min。产物可直接用于下一步检测。
2.3、Cas12a荧光检测反应
本实施例采用20μL检测体系，成分如表1，其中样品为上述ERA扩增产物，取5μL进行检测。
全波长酶标仪荧光检测的结果如图3所示，结果表明，Rhino-ERA-F1、Rhino-ERA-F2、Rhino-ERA-R1与Rhino-ERA-R2引物组合针对5种犀牛质粒的扩增效率最好，因此选择此组合作为后面样品扩增所用引物。
实施例3、基于Cas12a荧光法高灵敏度检测犀牛特异性核酸
本实施例中，为测定Cas12a荧光法对犀牛特异性核酸的检测灵敏度，进行以下检测：
首先，根据犀牛的线粒体基因片段对应DNA样品，计算检测片段分子量，并进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2×e7、2×e6、2×e5、2×e4、2×e3、2×e2、2×e1和2×e0拷贝数(copy/μL)的测试样品。
利用荧光法，对上述稀释样品进行Cas12a特异性反应，参照实施例1中检测步骤进行检测和荧光结果判读。操作简述如下：2μL梯度稀释样品，加入到50μL ERA等温扩增反应体系进行扩增。取10μL等温扩增产物，加入到20μL Cas12a荧光核酸检测体系，混合均匀，37℃反应10min进行荧光结果判读。
荧光检测结果如图4所示，可知应用Cas12a荧光法检测犀牛特异性，可实现对2拷贝的高灵敏度检出。
实施例4、基于Cas12a荧光法高特异性检测犀牛核酸
本实施案例中，为检测Cas12a荧光法能否对犀牛进行高特异反应，能否有效区分哺乳动物的线粒体核酸，进行以下检测：
首先，使用测序技术对多种哺乳动物的代表物种遗传信息进行采集和分析，并在这些数据的基础上建立核酸样本库。
其次，参照实施例1，通过ERA反应，分别扩增制备犀牛和其它物种的样本。
在荧光检测中，在Cas12a检测体系中，依次加入2μL缓冲液、1μL RNA酶抑制剂、1μLCas12a、1μL ssDNA FQ reporter、1μL crRNA和10μL检测样品。各组分混合均匀，在37℃反应10min。本检测体系中，RNA酶抑制剂浓度为40U/μL，Cas12a浓度为200ng/μL，ssDNA DBreporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL。
本实施例中，利用荧光检测判定Cas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，取检测10min时荧光数值为反应值。
检测结果如图5所示，可知本发明的Cas12a荧光法可高特异性地检测犀牛核酸，而对其他物种核酸没有反应。
荧光显示肉眼直接判读：将上述Cas12a检测体系反应10min后的产物，置于在485nm激光灯下，可由肉眼直接进行结果判读。当crRNA特异性识别靶核酸片段后，反应产物颜色由无色变为荧光绿；对应的，如果待检测无对应靶核酸，反应产物颜色仍为无色。
本实施例中，在Cas12a检测反应10min后，在荧光下进行肉眼判读，并拍照记录。结果如图6所示，其中最后5个为与图5中对应的五种犀牛的核酸样品(印度犀牛(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀牛(Rhinocero ssondaicus)、苏门答腊犀牛(Didermocerussumatrensis)、非洲黑犀牛(Diceros bicornis)、非洲白犀牛(Ceratotheriumsimum))，可知该检测体系能高效特异的对犀牛检测靶点序列进行快速可视化检测，而对其它物种没有反应。
实施例5、Cas12a荧光法现场快速检测犀牛样本
本实施例涉及现场犀牛组织样品的快速检测，具体检测步骤如下：
步骤1：进行现场(走私集装箱、夹层携带、口岸查验点等)样本采集，品利用核酸快速释放试剂盒对采集的样本进行核酸释放处理。
本实施例使用购自苏州先达基因公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸，步骤如下：取约20mg的样品加入150μl DNA释放剂，95℃水浴5分钟，简短轻微震荡混匀后取裂解液，即为释放的核酸。
步骤2：将步骤1得到的核酸，以及实施例2得到的ERA引物组合，加入到高效等温扩增体系中进行扩增。具体为：在Cas12a检测体系中，每个待检测样品取5μL进行ERA预扩增，步骤与实施例1中相同，获得Cas12a检测样品。
步骤3：在Cas12a检测体系中，依次加入2μL缓冲液、1μL RNA酶抑制剂、1μLCas12a、1μL ssDNA FQ reporter、10μL步骤2获得的ERA扩增产物、1μL crRNA；各组分混合均匀，在37℃反应10min，以对ERA扩增产物进行特异性识别切割。
步骤4：利用荧光酶标仪检测或荧光灯肉眼直接检测判读待测样品中是否存在犀牛特异性核酸。
图7显示了通过酶标仪检测从现场采集的动物制品中犀牛成分进行快速判定结果，可知样品4、6、9和10中含有犀牛成分。
图8显示了在荧光灯下用肉眼观察样本中犀牛成分的快速判定结果，可知样品4、6、9和10中含有犀牛成分，该结果与酶标仪检测的结果一致。
基于以上实验结果，本领域的技术人员容易理解，可以制备一种适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，包括：针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA、高效等温扩增(ERA)引物组合、CRISPR-Cas12a蛋白；以及单链DNA报告系统。
在此基础上，可以进一步将上述CRISPR荧光检测体系制成基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测试剂盒，以用于现场快速检测动物组织样品中是否含有犀牛成分。这对于本领域技术人员来说也是显而易见的。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
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Claims (11)
1.一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，所述CRISPR荧光检测体系包括：
针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA；
高效等温扩增引物组合；
CRISPR-Cas12a蛋白；以及
单链DNA报告系统。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述高效等温扩增引物组合为引物Rhino-ERA-F1、Rhino-ERA-F2、Rhino-ERA-R1与Rhino-ERA-R2的组合，其序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述单链DNA报告系统是被6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记的产物为/5′6FAM/TTTATTT/3′BHQ1/。
5.一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测方法，其特征在于，采用权利要求1～4中任一项所述的检测试剂盒进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
S1：取待测样品，利用快速核酸释放剂释放样品中的核酸；
S2：将S1获得的核酸、以及高效等温扩增引物组合，加入到高效等温扩增体系中进行扩增，获得特异性产物；
S3：将S2获得的特异性产物加入CRISPR检测体系中，对特异性产物进行识别切割；
S4；利用荧光酶标仪检测或荧光灯肉眼直接检测判读待测样品中是否存在犀牛特异性核酸。
7.一种针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA，其特征在于，所述特异性crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。
8.一种适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，其特征在于包括：
针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA；
高效等温扩增引物组合；
CRISPR-Cas12a蛋白；以及
单链DNA报告系统。
9.根据权利要求8所述的CRISPR荧光检测体系，其特征在于，所述针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。
10.根据权利要求8所述的CRISPR荧光检测体系，其特征在于，所述高效等温扩增引物组合为引物Rhino-ERA-F1、Rhino-ERA-F2、Rhino-ERA-R1与Rhino-ERA-R2的组合，其序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
11.根据权利要求8所述的CRISPR荧光检测体系，其特征在于，所述单链DNA报告系统是被6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记的产物为/5′6FAM/TTTATTT/3′BHQ1/。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117737069A (zh) * | 2024-02-19 | 2024-03-22 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种基于CRISPR-Cas12a的BVDV特异crRNA及其相关试剂盒与检测方法 |
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2022
- 2022-09-15 CN CN202211120428.0A patent/CN116479093A/zh active Pending
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