CN113528686B

CN113528686B - 用于布氏杆菌的detectr核酸检测的试剂和试剂盒

Info

Publication number: CN113528686B
Application number: CN202110959241.9A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 徐健皓; 王景林; 孙岩松; 李佳欣; 李岩伟; 王菁; 康琳; 辛文文; 高姗
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113528686A

Abstract

本发明公开了用于布氏杆菌的DETECTR核酸检测的试剂和试剂盒。本发明所保护的用于检测布鲁氏菌的试剂盒含有omp2a‑F4/R3引物对、ssDNA reporter和crRNA。所述omp2a‑F4/R3引物对对应序列表中SEQ ID No.12和SEQ ID No.19所示的单链DNA分子，所述crRNA为序列表中SEQ ID No.26所示的RNA分子。实验证明，本发明所提供的用于检测布鲁氏菌的试剂盒对模拟样本(血液样本和牛奶样本)检测均有较好的灵敏度和特异性，灵敏度接近1拷贝数/μL(2拷贝数/反应)，并能特异检测布鲁氏菌，为布鲁氏菌的体外诊断提供了可用的快速检测方法。

Description

用于布氏杆菌的DETECTR核酸检测的试剂和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于布氏杆菌的DETECTR核酸检测的试剂和试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌(Brucella)属所引起的布鲁氏菌病是一种广泛的人畜共患病，主要感染牛、羊、猪及犬等，对畜牧业造成重大的损失。其中牛、羊和猪布鲁氏菌能够传染人类，以牛、羊布鲁氏菌最为常见，严重威胁人类的身体健康。作为生物安全防治的第一步，对引起公共卫生事件的源头进行快速的检测和鉴定至关重要。重组酶聚合酶介导的扩增技术(RPA)是近年兴起的一种恒温扩增技术，由于RPA扩增方式无需复杂的温度改变，适合用于现场快速检测。但是，其单级扩增反应的原理，与目前常用的实时定量PCR(q-PCR)方法比较，该技术方法的灵敏度很难有实质性的提升。近年报道的DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统(DETECTR)中，其效应子Cas12a能够识别单链或双链DNA，与常用于体外检测的CRISPR-Cas13a相比，该效应子无需将底物转换成RNA而省去了反转录步骤。因此，基于RPA技术上的DETECTR系统用于细菌基因组DNA的核酸检测操作更加简便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备快速检测布鲁氏菌核酸分子的试剂或试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测布鲁氏菌的试剂盒。所述试剂盒含有omp2a-F4/R3引物对、ssDNA reporter和crRNA。所述omp2a-F4/R3引物对由omp2a-F4引物和omp2a-R3引物组成。所述omp2a-F4引物为序列表中SEQ ID No.12所示的单链DNA分子。所述omp2a-R3引物为序列表中SEQ ID No.19所示的单链DNA分子。所述ssDNAreporter为序列表中SEQ ID No.29所示的单链DNA分子。所述crRNA为序列表中SEQ IDNo.26所示的RNA分子。

上文所述试剂盒中，所述ssDNA reporter在SEQ ID No.29的第1位核苷酸上可标记荧光基团、第12位核苷酸可标记淬灭基团BHQ1。所述荧光基团可为FAM。所述荧光基团还可选自FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LC RED460、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。

上文所述试剂盒还可含有Cas12a蛋白。所述Cas12a可为毛螺旋菌的Cas12a重组表达蛋白LbCas12a。

上文所述试剂盒还可包括含有核苷酸序列是SEQ ID No.28的omp2a基因序列的重组载体。所述重组载体可为重组T载体质粒pEASY-T1-omp2a。

上文所述试剂盒的使用方法可包括RPA反应步骤和CRISPR/Cas12a反应步骤。

上文所述RPA反应步骤可为使用上文所述的omp2a-F4引物和omp2a-R3引物对待测样品进行恒温扩增反应，得到RPA扩增产物。

上文所述CRISPR/Cas12a反应步骤可为使用上文所述的crRNA和上文所述的Cas12a蛋白对所述RPA扩增产物进行DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统反应。

上文所述RPA扩增产物可为序列表中序列28所示的DNA分子。所述DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统反应中，所述Cas12a蛋白可切割所述ssDNA reporter产生荧光。所述待测样品可为含有布鲁氏菌基因组DNA样品。

上文所述RPA扩增产物也可为非序列表中序列28所示的DNA分子。所述Cas12a蛋白也可不切割ssDNA reporter产生荧光。所述待测样品也可为非布鲁氏菌基因组DNA样品。

上文所述恒温扩增反应的条件可为39℃反应30min(1800s)。上文所述CRISPR反式报告系统反应的条件可为37℃反应20min(1200s)。

上文所述试剂盒中，所述crRNA可由向导序列和锚定序列组成。所述向导序列可为序列表中SEQ ID No.26的第22-45位核苷酸。所述锚定序列可为序列表中SEQ ID No.26的第1-21位核苷酸。

上文所述试剂盒中还可含有RNA酶抑制剂。上文所述试剂盒还可包括含镁离子缓冲液。上文所述试剂盒还可包括基础型核酸扩增试剂。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测布鲁氏菌的基因组DNA的系统。所述系统可含有上文所述的试剂盒。

上文所述系统还可含有Genie II等温扩增荧光检测系统。所述系统还可含有其他试剂和/或仪器。

上文所述布鲁氏菌可为羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、犬布鲁氏菌和/或猪布鲁氏菌。

本发明所提供的基于RPA技术的DETECTR系统的用于检测布鲁氏菌的成套试剂盒对模拟样本(血液样本和牛奶样本)检测均有较好的灵敏度和特异性，灵敏度接近1拷贝数/μL(2拷贝数/反应)，能有效检测布鲁氏菌，为布鲁氏菌的体外诊断提供了可用的快速检测方法。

附图说明

图1为布鲁氏菌RPA引物对的筛选(荧光法RPA)。F1～F8代表上游引物omp2aF1～omp2a-F8，R1～R8代表下游引物omp2aR1～omp2a-R8。图中颜色梯度代表荧光值，颜色越深代表荧光值越高。

图2为布鲁氏菌CRISPR检测技术crRNA的筛选。颜色梯度代表荧光值，颜色越深代表荧光值越高。

图3为布鲁氏菌CRISPR-Cas12a检测方法质粒拷贝数灵敏度及稳定性评价。

图4为布鲁氏菌CRISPR方法检测基因组特异性评价。纵坐标为信号倍数(检测组荧光信号强度/阴性对照组荧光信号强度)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一、基于DETECTR技术的布氏杆菌的检测方法及相关试剂

一、实验材料及仪器。

实验材料：

羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、猪布鲁氏和犬布鲁氏，其他非布鲁氏菌(炭疽芽孢杆菌、土拉杆菌、伤寒沙门氏菌、鼻疽和类鼻疽伯克霍尔德菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌)的全基因组核酸均由军事医学研究院微生物流行病研究所提供。RPA引物、crRNA与信号报告探针由上海生工生物有限公司合成，Lbcas12a(毛螺旋菌的Cas12a重组表达蛋白)为上海吐露港生物科技有限公司产品(货号32108)。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

实验仪器：

实时荧光PCR仪(qTOWER³G)，GenieⅡ等温扩增荧光检测系统(英国OptiGene公司)。

二、序列的设计。

1.靶标序列选定

本发明在前期研究基础上，经过多番筛选和比对，选定布鲁氏菌的特异保守序列omp2a(GenBank:MN735501.1，序列表中SEQ ID NO.1)为靶标序列，可将布鲁氏菌特异性检出。

2.扩增引物对和crRNA的设计

2.1RPA扩增引物对和RPA特异荧光探针设计

针对上述布鲁氏菌的特异保守基因omp2a，首先设计一对RPA扩增引物omp2a-F/omp2a-R(表1，序列表中SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)。在omp2a-F/omp2a-R扩增序列中设计多条RPA特异荧光探针omp2a-P1/omp2a-P2/omp2a-P3(表1，SEQ ID No.6-SEQ ID No.8)，将omp2a-F/omp2a-R扩增引物与3条RPA特异荧光探针组合进行筛选(筛选步骤见步骤三)，结果显示omp2a-F/omp2a-R能够扩增检出羊布鲁氏菌基因组核酸。故在omp2a-F/omp2a-R引物对的的基础上进一步设计8条RPA扩增上游引物omp2a-F1/omp2a-F2/omp2a-F3/omp2a-F4/omp2a-F5/omp2a-F6/omp2a-F7/omp2a-F8，以及8条RPA扩增下游引物omp2a-R1/omp2a-R2/omp2a-R3/omp2a-R4/omp2a-R5/omp2a-R6/omp2a-R7/omp2a-R8，具体见表1，16条上、下游引物对应的序列为序列表中SEQ ID No.9-SEQ ID No.24所示。经过RPA反应筛选，选择omp2a-F4/omp2a-R3引物对为最佳RPA扩增引物对，以omp2a-F4/omp2a-R3引物进行RPA扩增后的扩增产物序列为序列表中SEQ ID No.28所示。

2.2crRNA序列设计

在进行RPA筛选后，在步骤2.1筛选出来的RPA扩增引物对扩增区域内设计相应的crRNA：在omp2a的RPA扩增区域(序列表中SEQ ID No.28)的TTTN(PAM序列，N为任意核苷酸)下游设计出3条crRNA序列：crRNA-omp2a-1、crRNA-omp2a-2和crRNA-omp2a-3(表1)。crRNA序列中带有向导序列和锚定序列，向导序列与omp2a基因的RPA扩增产物序列相配对，锚定序列用于结合Cas12a蛋白。

表1本发明候选RPA扩增引物对和crRNA

注：探针omp2a-P1、omp2a-P2和omp2a-P3中下划线部分为标记基团位点(omp2a-P1中TTT修饰标记为FAM-dT—THF—BHQ1-dT，即SEQ ID NO.6的第31位碱基上标记FAM、第32位碱基用四氢呋喃修饰，第33位碱基标记淬灭基团BHQ1以及3’端标记C3-spacer；SEQ IDNO.7的第31位碱基上标记FAM、第32位碱基用四氢呋喃修饰，第33位碱基标记淬灭基团BHQ1以及3’端标记C3-spacer；SEQ ID NO.8的第31位碱基上标记FAM、第32位碱基用四氢呋喃修饰，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1以及3’端标记C3-spacer)；crRNA(SEQ ID NO.25～SEQID NO.27)中下划线部分为向导序列(与RPA引物对的扩增产物序列相匹配)，下划线之前的碱基部分为锚定序列(用于结合Cas12a蛋白)。RPA扩增产物序列中下划线部分(TTTN)为PAM序列，N为C或G。SEQ ID NO.29所示的ssDNA reporter序列的5’末端核苷酸标记FAM，3’末端核苷酸标记淬灭基团BHQ1。

三、RPA引物及crRNA靶序列的筛选。

1.布鲁氏菌检测靶标基因阳性参考质粒的制备

利用Primer Premier 6.0软件对布鲁氏菌特异保守序列omp2a设计PCR引物，参见表1中PCR-omp2a-F(序列表中SEQ ID No.2)和PCR-omp2a-R(序列表中SEQ ID No.3)，使其扩增片段涵盖预设计的RPA扩增片段(序列表中SEQ ID No.28)。以羊布鲁氏基因组DNA为模板对目的片段进行PCR扩增，利用A-overhang mixture(TaKaRa)对纯化产物3’端添加“A”碱基，随后加入pEASY-T1 Simple Cloning Vector(transgen)完成T-A克隆得到重组T载体质粒pEASY-T1-omp2a，采用菌落PCR检测出阳性克隆并通过测序进一步确认，结果表明pEASY-T1-omp2a含有核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.28的omp2a基因的序列。使用TIANprepMini Plasmid Kit(TianGen)提取阳性参考质粒(pEASY-T1-omp2a)，用Qubit 3.0核酸定量仪测定提取重组质粒浓度，并换算出拷贝数浓度(拷贝数/μL)，对已知拷贝数浓度的质粒进行适当的倍比稀释后即为布鲁氏菌检测靶标基因阳性参考质粒，用于CRISPR检测体系灵敏度的分析。

2.布鲁氏菌RPA扩增引物的筛选

将步骤1得到的布鲁氏菌靶标基因阳性参考质粒(pEASY-T1-omp2a)原液按10倍梯度稀释至1～1000拷贝数/μL，以各梯度稀释液为模板按照RPA法扩增分别取2μL质粒稀释模板，使用步骤二的2.1中的18条RPA扩增上、下游引物交叉组合进行RPA扩增，同时以2μL H₂O为模板作为阴性对照。

按照以下操作进行：将所合成引物探针100μmol/L母液稀释成10μmol/L工作液，按TwistAmp exo Kit Quick Guide(货号:TAEXO02KIT)方法进行RPA的扩增反应：

将所合成RPA引物100μmol/L母液稀释成10μmol/L工作液，按如下体系配成50.5μL反应体系。其中先配成如下预混液并混合均匀：Primer Free Rehydration buffer29.5μL，Primer A(上游引物)和Primer B(下游引物)(10μmol/L)各2.1μL，TwistAmp exo Probe(荧光探针)0.6μL，用去离子水补足45μL。

向每管基础反应单元(含有每一对RPA扩增引物对对应的RPA反应体系的离心管为一管基础反应单元)中加入上述45μL预混液并溶解均匀，加入2μL模板DNA(布鲁氏菌靶标基因阳性参考质粒pEASY-T1-omp2a的各梯度稀释液)。吸取3μLMgAc于管盖上，盖上盖子后稍离心，迅速放入Genie II等温扩增荧光检测系统进行RPA反应，反应条件：39℃，20min(1200s)，记录荧光信号值。按照同一反应体系先对设计的RPA特异荧光探针SEQ ID No.6-SEQ ID No.8和初步设计RPA扩增引物SEQ ID No.4、SEQ ID No.5进行筛选；同样的体系对进一步设计的RPA扩增引物SEQ ID No.9—SEQ ID No.24进行筛选。

结果显示：A)序列表中SEQ ID NO.8所示的omp2a-P3荧光探针与omp2a-F/R组合对羊布鲁氏菌核酸(阳性参考质粒pEASY-T1-omp2a)的检测荧光值最高，扩增效率最好，故选用omp2a-P3荧光探针与其他RPA引物(SEQ ID No.9-SEQ ID No.24)组合，进一步进行RPA引物的筛选；B)设置阳性参考质粒(pEASY-T1-omp2a)浓度700拷贝数/μL作为模板DNA，筛选出omp2a-F2/omp2a-R3，omp2a-F4/omp2a-R3，omp2a-F5/omp2a-R2，omp2a-F5/omp2a-R7，omp2a-F7/omp2a-R7检测荧光值更高，高于其他引物对检测荧光值(图1中A)；C)设置阳性参考质粒(pEASY-T1-omp2a)浓度70拷贝数/μL作为模板DNA，筛选出omp2a-F4/R3荧光值更高(图1中B)，故，omp2a-F4/R3是较为理想的RPA扩增引物，因此选择omp2a-F4和omp2a-R3引物对(简称omp2a-F4/R3)的扩增产物序列作为靶序列进行后续crRNA的设计。

3.CRISPR-Cas12a检测反应crRNA序列的筛选

按照TwistAmp Basic Kit Quick Guide(货号：TAEXO03KIT)方法：0.48μM的Primer A(上游引物)和Primer B(下游引物)；Primer Free Rehydration buffer 29.5μL；用去离子水补足45μL；MgAc溶液3μL；DNA模板2μL。总体反应体积50μL，放入Genie II等温扩增荧光检测系统，反应温度39℃，扩增30min(1800s)。

用omp2a-F4/R3引物对作为上下游引物，阳性参考质粒(pEASY-T1-omp2a)作为DNA模板，进行扩增得到RPA扩增产物(序列表中SEQ ID No.28)。在SEQ ID No.28序列中TTTN(N代表任意核苷酸)代表的PAM序列(序列表中SEQ ID No.28的第35-38位、第83-86位、第141-144位)下游设计crRNA前导序列，在前导序列上游加入锚定序列，设计出3条crRNA，分别为crRNA-omp2a-1，crRNA-omp2a-2，crRNA-omp2a-3(见表1)。

按照如下CRISPR反应体系在Genie II等温放大荧光检测系统中筛选crRNA：LbCas12a(Cas12a蛋白)0.2μL(80nM)；ssDNA reporter(SEQ ID NO.29)1μL(400nM)；RNA酶抑制剂0.3μL；含镁离子缓冲液1.5μL；crRNA(crRNA-omp2a-2，浓度400nM)5μL；RPA扩增产物7μL(序列表中SEQ ID No.28)；最后加入去离子水将总反应体积补至25μL，放入Genie II等温扩增荧光检测系统，反应温度37℃，扩增20min(1200s)，记录10min(600s)荧光信号值。结果如图2所示，设置阳性参考质粒(pEASY-T1-omp2a)浓度为50拷贝数/μL和5拷贝数/μL两个浓度，crRNA-omp2a-2荧光值最高，效果最好。

实施例二、布鲁氏菌DETECTR检测方法的灵敏度及特异性评价

使用实施例一中筛选得到的RPA反应引物omp2a-F4/R3引物对、CRISPR/Cas12a反应ssDNA reporter、crRNA(crRNA-omp2a-2)制备布鲁氏菌DETECTR检测试剂盒。其中omp2a-F4/R3引物对用于进行布鲁氏菌DETECTR检测中的RPA反应，ssDNA reporter、crRNA-omp2a-2用于进行布鲁氏菌DETECTR检测中的CRISPR/Cas12a反应。

布鲁氏菌DETECTR检测试剂盒中omp2a-F4/R3引物对、ssDNA reporter、crRNA-omp2a-2的配比为omp2a-F4引物24pmol，omp2a-R3 24pmol，ssDNA reporter 10pmol，crRNA-omp2a-2 10pmol。

一、基因组灵敏度及稳定性分析

1.1RPA扩增反应

由杭州众测生物科技有限公司合成omp2a-F4/R3引物对，并使用其产品基础型核酸扩增试剂(RAA法)(货号:S001ZC)，按照其方法配制核酸扩增反应50μL体系：去离子水32.5μL，A buffer(RPA反应基础缓冲液)12.5μL，B buffer(含镁离子缓冲液)3μL，DNA模板2μL。阳性参考质粒(pEASY-T1-omp2a)作为DNA模板，梯度稀释至1000拷贝数/μL～0.1拷贝数/μL(共5个浓度梯度：1000拷贝数/μL、100拷贝数/μL、10拷贝数/μL、1拷贝数/μL、0.1拷贝数/μL，对照为NC：0拷贝数/μL)，反应温度39℃，扩增30min(1800s)，得到扩增不同浓度梯度DNA模板对应的RPA扩增产物。

1.2CRISPR/Cas12a反应

按照如下CRISPR反应体系在Genie II等温放大荧光检测系统中评价布鲁氏菌DETECTR检测方法基因组灵敏度：LbCas12a 0.2μL(80nM)；ssDNA reporter(SEQ ID NO.29)1μL(400nM)；RNA酶抑制剂0.3μL；含镁离子缓冲液1.5μL；crRNA(crRNA-omp2a-2，浓度400nM)5μL；RPA扩增产物(1.1中不同浓度梯度阳性参考质粒为模板获得的RPA扩增产物)7μL(序列表中SEQ ID No.28)；最后加入去离子水将总反应体积补至25μL，反应温度37℃，扩增20min(1200s)，记录10min(600s)荧光信号值。每个浓度梯度反应设置7个重复实验，验证稳定性。结果如图3所示，该技术方法灵敏度接近1拷贝数/μL(2拷贝数/反应)，且实验重复性好，说明该检测方法具有高灵敏度、高稳定性。

二、基因组特异性评价

以4种布鲁氏菌基因组模板以及无布鲁氏菌的8种致病细菌混合基因组模板和去离子水为阴性对照评价布鲁氏菌DETECTR检测方法检测方法的特异性。4种布鲁氏菌包括羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、犬布鲁氏菌和猪布鲁氏菌；非布鲁氏菌混合基因组是由高浓度的无布鲁氏菌的8种致病细菌基因组混合组成，即包含了炭疽芽孢杆菌、土拉杆菌、伤寒沙门氏菌、鼻疽和类鼻疽伯克霍尔德菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌的提纯基因组。

布鲁氏菌DETECTR检测方法具体步骤同步骤一，包括RPA扩增反应和CRISPR/Cas12a反应。其中RPA扩增反应的DNA模板分别换成4种布鲁氏菌基因组DNA和无布鲁氏菌的8种致病细菌基因组DNA。

结果如图4所示，结果表明针布鲁氏菌DETECTR检测方法对布鲁氏菌的检测(图4中I、J、K、L为布鲁氏菌样品)特异性较好。

实施例三、布鲁氏菌DETECTR检测方法在模拟临床样本、模拟环境样本(血液，牛奶)的布鲁氏菌核酸检测中的应用。

为了验证布鲁氏菌DETECTR检测方法的实用性，分别在正常人全血、牛奶中加入布鲁氏菌全基因组DNA，分别得到含有不同浓度(2.25pg/μL-0.025pg/μL)的羊布鲁氏菌核酸的全血(共24份样本)，加入水的一组为阴性对照样本(NC组)(共4份样本)；含有牛布鲁氏菌核酸牛奶模拟样本(2.25pg/μL-0.025pg/μL)(共12份样本)，加入水的一组为阴性对照样本(NC组)(共2份样本)。以QIAamp DNA Mini Kit提取全血和牛奶模拟样本的核酸。

对上述42份样本进行盲测：取上述样本的提取核酸2μL作为模板，以公开发表文献方法对样本的布鲁氏菌特异基因IS711靶标进行了实时荧光PCR检测获得CT值[Gumaa M M,X Cao,Li Z,et al.Establishment of a recombinase polymerase amplification(RPA)assay for the detection of Brucella spp.Infection[J].Molecular and CellularProbes,2019,47:101434.]，IS711的引物和探针分别为:IS711-F(5’—CGCTCGCGCGGTGGAT—3’)；IS711-R(5’—CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC—3’)；IS711-P(5’—FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-TAMARA—3’)。同时将上述样本提取核酸进行本发明DETECTR检测方法的检测(同实施例二步骤1的检测步骤)。结果如表2所示，DETECTR检测方法的阳性样本检出率优于实时荧光PCR，且该方法针对血液样本、牛奶样本均具有较好的特异性，与全血基因组、牛奶基因组均不发生非特异性反应(阴性对照组无阳性信号)。

因此，本发明中的基于RPA技术的DETECTR检测方法及成套试剂对模拟样本(血液样本和牛奶样本)中的布鲁氏菌检测均有较好的灵敏度和特异性，能有效检测布鲁氏菌，为布鲁氏菌的体外诊断提供了可用的快速检测方法。

表2全血及牛奶模拟样本CRISPR-Cas12a技术和qPCR技术检测结果

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 用于布氏杆菌的DETECTR核酸检测的试剂和试剂盒

<130> GNCSQ211712

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 467

<212> DNA

<213> 布鲁氏杆菌（Brucella）

<400> 1

gccagagccc gaagccgttg aatatgtccg cgtttgcgac gcttacggcg ctggctactt 60

ctacattccg ggcaccgaaa cctgcctgcg catcagcggc tacgtccgtt acgacgtaaa 120

gggcggcgac gacgtctaca ccggctcgga tcgtaaaggc tgggacaagg gcgctcgttt 180

cgcactcatg ttcaacacga attcggaaac cgaactcggc acactcggca cctacactca 240

gctgcgtttc aactacacca gcaacaattc acgtcatgat ggccaatacg gcgatttcag 300

cgatgatcgt gatgtcgctg atggcggcgt aagcaccggc accgatctgc agtttgcata 360

tatcacgctt ggtggtttca aggttggtat cgacgaatcc gaattccata ccttcaccgg 420

ttacctcggt gatgtcatca acgatgatgt cgtcgctgct ggctcct 467

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

gccagagccc gaagccgttg aatatg 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

aggagccagc agcgacgaca tcat 24

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

gaactcggca cactcggcac ctacactcag 30

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

ttcggattcg tcgataccaa ccttgaaacc accaa 35

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

caattcacgt catgatggcc aatacggcga tttcagcgat gatcgtga 48

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

ccaatacggc gatttcagcg atgatcgtga tgtcgctgat ggcggcgt 48

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

tttcaactac accagcaaca attcacgtca tgatggccaa tacggcgat 49

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

cgaactcggc acactcggca cctacactca 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

ccgaactcgg cacactcggc acctacactc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

accgaactcg gcacactcgg cacctacact 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 12

aactcggcac actcggcacc tacactcagc 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

actcggcaca ctcggcacct acactcagct 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 14

ctcggcacac tcggcaccta cactcagctg 30

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 15

gaactcggca cactcggcac ctacactcag c 31

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 16

cgaactcggc acactcggca cctacactca g 31

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 17

tcggattcgt cgataccaac cttgaaacca ccaag 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 18

cggattcgtc gataccaacc ttgaaaccac caagc 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 19

ggattcgtcg ataccaacct tgaaaccacc aagcg 35

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 20

attcggattc gtcgatacca accttgaaac cacca 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 21

aattcggatt cgtcgatacc aaccttgaaa ccacc 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 22

gaattcggat tcgtcgatac caaccttgaa accac 35

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 23

tcggattcgt cgataccaac cttgaaacca ccaa 34

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 24

ttcggattcg tcgataccaa ccttgaaacc acca 34

<210> 25

<211> 45

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 25

uaauuucuac uaaguguaga uaacuacacc agcaacaauu cacgu 45

<210> 26

<211> 45

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 26

uaauuucuac uaaguguaga uagcgaugau cgugaugucg cugau 45

<210> 27

<211> 45

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 27

uaauuucuac uaaguguaga ucauauauca cgcuuggugg uuuca 45

<210> 28

<211> 188

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 28

aactcggcac actcggcacc tacactcagc tgcgtttcaa ctacaccagc aacaattcac 60

gtcatgatgg ccaatacggc gatttcagcg atgatcgtga tgtcgctgat ggcggcgtaa 120

gcaccggcac cgatctgcag tttgcatata tcacgcttgg tggtttcaag gttggtatcg 180

acgaatcc 188

<210> 29

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 29

cccccccccc cc 12

Claims

1.用于检测布鲁氏菌的试剂盒，所述试剂盒含有omp2a-F4/R3引物对、ssDNA reporter和crRNA，所述omp2a-F4/R3引物对由omp2a-F4引物和omp2a-R3引物组成，所述omp2a-F4引物为序列表中SEQ ID No.12所示的单链DNA分子，所述omp2a-R3引物为序列表中SEQ IDNo.19所示的单链DNA分子，所述ssDNA reporter为序列表中SEQ ID No.29所示的单链DNA分子，所述crRNA为序列表中SEQ ID No.26所示的RNA分子。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA reporter在SEQ ID No.29的第1位核苷酸上标记荧光基团、第12位核苷酸上标记淬灭基团BHQ1。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有Cas12a蛋白。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括含有核苷酸序列是SEQ ID No.28的omp2a基因序列的重组载体。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述crRNA由向导序列和锚定序列组成；所述向导序列为序列表中SEQ ID No.26的第22-45位核苷酸；所述锚定序列为序列表中SEQ ID No.26的第1-21位核苷酸。

6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有RNA酶抑制剂。

7.检测布鲁氏菌的基因组DNA的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求1-6中任一所述的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述系统还含有Genie II等温扩增荧光检测系统。

9.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒或权利要求7或8所述的系统，其特征在于：所述布鲁氏菌为羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、犬布鲁氏菌和/或猪布鲁氏菌。