CN112522429A

CN112522429A - Rpa联合crispr技术检测炭疽杆菌的方法及成套试剂

Info

Publication number: CN112522429A
Application number: CN202011484671.1A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 王景林; 孙岩松; 王菁; 辛文文; 康琳; 李岩伟
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN112522429B

Abstract

本发明公开了RPA联合CRISPR技术检测炭疽杆菌的方法及成套试剂。本发明提供了用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的成套引物组，含有特异于炭疽芽孢杆菌毒力株染色体基因BA_5345、质粒毒力基因pagA和capA的三套引物，每套引物均由RPA引物和crRNA组成，所述RPA引物根据靶基因保守序列设计，所述crRNA包括能够与cas蛋白结合的锚定序列和与RPA引物扩增产物序列相匹配的间隔序列。本发明成套引物组对临床模拟样本、土壤模拟样本样本检测均有较好的灵敏度和特异性，能有效区分炭疽杆菌毒力株和其他细菌，为炭疽杆菌体外诊断提供了快速检测方法，同时对于炭疽杆菌在中国疫区的土壤环境筛查具重要意义。

Description

RPA联合CRISPR技术检测炭疽杆菌的方法及成套试剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及RPA联合CRISPR技术检测炭疽杆菌的方法及成套试剂。

背景技术

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是人类历史上第一个被发现的病原菌，也是引起炭疽自然疫源性、人兽共患烈性传染病的一种重要的人畜共患病病原体。我国西部农牧业地区云南、贵州、新疆等地为人间炭疽高发区。此外，由于炭疽芽孢在自然环境中的抵抗力极强，易生产，在军事上一直被列为头号生物战剂。炭疽芽孢杆菌除了染色体基因组外，还含有两个与其毒力密切相关的毒力质粒pXO1和pXO2。联合检测染色体上的特异基因及毒力质粒上的毒力基因，可用于炭疽芽孢杆菌毒力株的快速筛查。当疫情来临时，实验室人员能否快速和准确的从样品中检测出炭疽芽孢杆菌是防治疫情、诊疗患者工作的关键。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是近年兴起的一种恒温扩增技术，由于RPA扩增方式无需复杂的温度改变，适合用于现场快速检测。但是，从原理上，其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前多数的实时定量PCR(q-PCR)检测方式，并不能有实质性的灵敏度提升。

在CRISPR系统中，与常用于体外诊断识别RNA的Cas13a而言，Cas12a-crRNA能够识别单链或双链DNA，不需要将RPA扩增产物转换成RNA而省去了转录步骤，且RPA产物DNA用于CRISPR的检测相对于RNA而言也更加稳定且易于操作。RPA反应与CRISPR-Cas12a反应均可在37-42℃的恒温下就能完成，这种兼顾RPA和CRISPR-Cas12a的同一等温反应条件有利于快速便携式现场检测装置的研发。

发明内容

为了有效的解决上述问题，本发明提供了一种用于炭疽芽孢杆菌毒力株的CRISPR检测引物和crRNA，将此引物组及crRNA用于基于CRISPR-Cas12a技术的基因检测中可快速现场检测炭疽芽孢杆菌，具有特异性好，灵敏度高，简易的优点。

第一方面，本发明提供了一种用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的成套引物组。

本发明所提供的用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的成套引物组，由如下组成：

(A1)引物组1：由RPA引物对1和crRNA1组成(针对的是炭疽芽孢杆菌染色体基因BA_5345)；

所述RPA引物对1是根据SEQ ID No.1所示核苷酸序列设计的；

所述crRNA1包括重复序列1和间隔序列1，所述重复序列1能够与cas蛋白结合，所述间隔序列1与所述RPA引物对1的扩增产物序列相匹配。

(A2)引物组2：由RPA引物对2和crRNA2组成(针对的是质粒pXO1上的毒力基因pagA)；

所述RPA引物对2是根据SEQ ID No.2所示核苷酸序列设计的；

所述crRNA2包括重复序列2和间隔序列2，所述重复序列2能够与cas蛋白结合，所述间隔序列2与所述RPA引物对2的扩增产物序列相匹配。

(A3)引物组3：由RPA引物对3和crRNA3组成(针对的是质粒pXO2上的毒力基因capA)；

所述RPA引物对3是根据SEQ ID No.3所示核苷酸序列设计的；

所述crRNA1包括重复序列3和间隔序列3，所述重复序列3能够与cas蛋白结合，所述间隔序列3与所述RPA引物对3的扩增产物序列相匹配。

进一步地，所述RPA引物对1为能够以炭疽芽孢杆菌全基因组为模板(实际以全基因组中的染色体基因组为模板)扩增得到SEQ ID No.1的第177-360位所示DNA片段的引物对。所述crRNA1中，所述重复序列1为SEQ ID No.23的第1-21位，所述间隔序列1为SEQ IDNo.23的第22-46位。

进一步地，所述RPA引物对2为能够以炭疽芽孢杆菌毒力株全基因组为模板(实际以全基因组中的质粒基因组为模板)扩增得到SEQ ID No.2的第4-288位所示DNA片段的引物对。所述crRNA2中，所述重复序列2为SEQ ID No.27的第1-21位，所述间隔序列2为SEQ IDNo.27的第22-46位。

进一步地，所述RPA引物对3为能够以炭疽芽孢杆菌毒力株全基因组为模板(实际以全基因组中的质粒基因组为模板)扩增得到SEQ ID No.3的第387-546位所示DNA片段的引物对。所述crRNA3中，所述重复序列3为SEQ ID No.33的第1-21位，所述间隔序列3为SEQID No.33的第22-46位。

更进一步地，所述RPA引物对1为由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成的引物对。所述crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。

更进一步地，所述RPA引物对2为由SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的两条单链DNA组成的引物对。所述crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示。

更进一步地，所述RPA引物对3为由SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的两条单链DNA组成的引物对。所述crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示。

第二方面，本发明要求保护一种用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的试剂盒。

本发明所要求保护的用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的试剂盒含有前文任一所述的成套引物组。

进一步地，所述试剂盒中还可含有如下中的全部或部分：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和醋酸镁。

进一步地，所述试剂盒还可含有cas12a蛋白和/或信号报告探针和/或成套阳性参考质粒。

在本发明的具体实施方式中，所述cas12a蛋白具体为LbCas12a蛋白。

更进一步地，所述信号报告探针的序列如SEQ ID No.34所示，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在本发明的具体实施方式中，所述荧光报告基团具体为FAM，所述荧光淬灭基团具体为BHQ1。

即，所述信号报告探针为：5’-FAM-CCCCCCCCCCCC-BHQ1-3’。

更进一步地，所述成套阳性参考质粒由阳性参考质粒1、阳性参考质粒2和阳性参考质粒3组成。所述阳性参考质粒1为含有SEQ ID No.1的第8-517位所示DNA片段的质粒。如将SEQ ID No.1的第8-517位所示DNA片段克隆到pEASY-T1载体后得到的重组质粒。所述阳性参考质粒2为含有SEQ ID No.2的第4-753位所示DNA片段的质粒。如将SEQ ID No.2的第4-753位所示DNA片段克隆到pEASY-T1载体后得到的重组质粒。所述阳性参考质粒3为含有SEQ ID No.3的第5-872位所示DNA片段的质粒。如将SEQ ID No.3的第5-872位所示DNA片段克隆到pEASY-T1载体后得到的重组质粒。

第三方面，本发明要求保护前文所述引物组或所述试剂盒在如下任一中的应用：

(A1)制备用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的产品，或检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株；

(A2)制备用于诊断炭疽芽孢杆菌感染的产品；

(A3)制备用于诊断炭疽病的产品。

第四方面，本发明要求保护一种检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的方法。

本发明要求保护的检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的方法，可包括如下步骤：

(b1)从待测样本中提取DNA(即全基因组)；

(b2)以(b1)提取的DNA为模板，采用前文所述的RPA引物对1、所述RPA引物对2和所述RPA引物对3分别进行RPA扩增，依次得到扩增产物1、扩增产物2和扩增产物3；

(b3)取(b2)所得扩增产物1，加入前文所述的信号报告探针、前文所述的cas12a蛋白和前文所述的crRNA1，形成反应体系1；取(b2)所得扩增产物2，加入前文所述的信号报告探针、前文所述的cas12a蛋白和前文所述的crRNA2，形成反应体系2；取(b2)所得扩增产物3，加入前文所述的信号报告探针、前文所述的cas12a蛋白和前文所述的crRNA3，形成反应体系3；将所述反应体系1、所述反应体系2和所述反应体系3分别进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号按照如下确定检测结果：

若所述反应体系1的检测信号为阳性，则所述待测样本中含有或候选含有炭疽芽孢杆菌；若所述反应体系1的检测信号为阴性，则所述待测样本中不含有或候选不含有炭疽芽孢杆菌。

进一步地，在所述反应体系1的检测信号为阳性的情况下，若所述反应体系2和所述反应体系3的检测信号也均为阳性，则所述待测样本中含有或候选含有的炭疽芽孢杆菌为或候选为毒力株；若所述反应体系2和所述反应体系3的检测信号均为阴性，则所述待测样本中含有或候选含有的炭疽芽孢杆菌不为或候选不为毒力株。

在所述方法中，反应体系中RPA扩增产物1μL、crRNA浓度为1μM、Cas12a浓度为74nM。

所述方法为非疾病诊断治疗性方法。如应用于疫源地的筛查。

在本发明的具体实施方式中，步骤(b2)进行所述RPA扩增时的反应温度为39℃，反应时间为0～20min(不含0)(如20min)。

在本发明的具体实施方式中，步骤(b3)进行所述CRISPR反应时的反应温度为37-42℃，反应时间为0～30min(不含0)(如10min)。

在本发明的具体实施方式中，步骤(b3)每1min读取荧光值；使用累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：

阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的2倍。阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的2倍。阴性对照组为每个实验组对应设置的以加入非炭疽芽孢杆菌DNA作为模板的阴性信号组。

进一步地，所述阴性信号组可以以水替代模板。

在本发明的具体实施方式中，所述阴性信号组中的非炭疽芽孢杆菌DNA具体为13种非炭疽芽孢杆菌细菌的核酸DNA混合物，所述13种非炭疽芽孢杆菌细菌为鼠疫杆菌、土拉杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌。

在本发明中，所述炭疽芽孢杆菌毒力株具体为我国强毒株A16。

在本发明的具体实施方式中，所述待测样本选自如下：炭疽芽孢杆菌毒力株A16，13种非炭疽芽孢杆菌细菌(鼠疫杆菌、土拉杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌)。

本发明所提供的引物及crRNA涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂，是针对炭疽芽孢杆菌的特异性染色体基因BA_5345，以及毒力株所具有的pXO1质粒毒力基因pagA和pXO1质粒毒力基因capA进行设计的，通过RPA完成目标序列的扩增和加上DNA内切酶(Cas12a)靶向的CRISPR反式报告系统的放大反应，可显著提高检测灵敏度。RPA和CRISPR-Cas12a的同等温度反应均可使用OptiGene II等温扩增荧光检测系统完成，该系统紧凑小巧，其内置长航时锂电池，可在无电源环境中全天户外工作，可实现便携式的致病菌现场快速检测，摆脱了对Q-PCR仪等精密仪器的依赖，使得CRISPR-Cas技术在炭疽芽孢杆菌的现场诊断方面具有广阔的应用前景。本发明的成套试剂盒对临床血液模拟样本、土壤模拟样本检测均有较好的灵敏度和特异性，能有效检测出炭疽杆菌毒力株，区分炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，为炭疽杆菌的体外诊断提供了可用的快速检测方法，同时对于炭疽杆菌在中国疫区的现场筛查也具有重要意义。

附图说明

图1为炭疽芽孢杆菌RPA引物对的筛选。N为阴性对照组。

图2为炭疽芽孢杆菌CRISPR检测技术crRNA的筛选。

图3为炭疽杆菌CRISPR检测方法质粒拷贝数灵敏度评价。

图4为炭疽杆菌RPA-CRISPR cas12a检测方法特异性的评价。

各图中，ns，无显著差异；*，p<0.05；**，P<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、实验材料：

炭疽芽孢杆菌毒力株(我国强毒株A16)，其他非炭疽芽孢杆菌(土拉杆菌、鼠疫杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌)均由军事医学研究院微生物流行病研究所细菌学研究室提供。RPA引物、crRNA与信号报告探针由上海生工生物有限公司合成，Lbcas12a蛋白表达质粒由上海吐露港生物科技有限公司提供，Lbcas12a重组表达蛋白由军事医学研究院微生物流行病研究所细菌学研究室纯化。炭疽芽孢杆菌检测阳性参考质粒(pEASY-T1-5345、pEASY-T1-PagA、pEASY-T1-CapA)由军事医学研究院微生物流行病研究所细菌学研究室构建，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2、实验仪器：

金属浴，离心机，涡旋仪，实时荧光PCR仪(qtower³G),Genie III等温扩增荧光检测系统(OptiGene公司)等。

实施例1、用于检测炭疽杆菌筛查毒力株的CRISPR-Cas12a引物的设计及筛选

一、设计序列

1、选定靶标序列

发明人在前期研究基础上，经过多番筛选和比对，选定炭疽芽孢杆菌的染色体特异序列BA_5345的保守序列(如SEQ ID No.1所示)、质粒毒力基因pagA的保守序列(如SEQID No.2所示)和质粒毒力基因capA的保守序列(如SEQ ID No.3所示)为靶标序列，三条序列配套使用可将炭疽芽孢杆菌毒力株特异性检出。

2、扩增引物对和crRNA的设计

针对上述炭疽芽孢杆菌的染色体特异基因BA_5345，质粒毒力基因pagA和capA的特异性保守序列，设计多条RPA扩增引物对：Rpa-5345-F1/Rpa-5345-R1、Rpa-5345-F2/Rpa-5345-R2、Rpa-pagA-F1/Rpa-pagA-R1、Rpa-pagA-F2/Rpa-pagA-R2、Rpa-capA-F1/Rpa-capA-R1、Rpa-capA-F2/Rpa-capA-R2；在进行RPA筛选后，在筛选出来的RPA扩增区域内设计相应的crRNA：在BA_5345的扩增区域1(以Rpa-5345-F1/Rpa-5345-R1引物进行扩增)的TTTN(PAM序列)下游设计出2条crRNA：crRNA-5345-1-1和crRNA-5345-1-2；在pagA扩增区域1(以Rpa-pagA-F1/Rpa-pagA-R1引物进行扩增)的TTTN(PAM序列)下游设计出4条crRNA：crRNA-pagA-1-1，crRNA-pagA-1-2，crRNA-pagA-1-3，crRNA-pagA-1-4；在pagA扩增区域2(以Rpa-pagA-F2/Rpa-pagA-R2引物进行扩增)的TTTN(PAM序列)下游设计出2条crRNA:crRNA-pagA-2-1，crRNA-pagA-2-2；在capA扩增区域1(以Rpa-capA-F1/Rpa-capA-R1引物进行扩增)的TTTN(PAM序列)下游设计出2条crRNA：crRNA-capA-1-1，crRNA-capA-1-2；在capA扩增区域2(以Rpa-capA-F2/Rpa-capA-R2引物进行扩增)的TTTN(PAM序列)下游设计出2条crRNA：crRNA-capA-2-1，crRNA-capA-2-2。具体序列如表1所示。

表1、本发明候选RPA扩增引物对和crRNA

序列名称	序列(5’-3’)	序列编号
			PCR-5345-F	ATACCAGGATGGGTCTCG	SEQ ID No.4
PCR-5345-R	TACCGCAAGTTGAATAGCA	SEQ ID No.5
			PCR-pagA-F	GAGGTGATTCAGGCAGAAG	SEQ ID No.6
PCR-pagA-R	CTTATCAATCCGTCCTGTAAC	SEQ ID No.7
			PCR-capA-F	CCTCGTTATGTAGCAATCG	SEQ ID No.8
PCR-capA-R	TTGTTCTTGTCCATCCTTG	SEQ ID No.9
			Rpa-5345-F1	GAATTGCTTGGGTGATGAATCAATGGCGAAAT	SEQ ID No.10
Rpa-5345-R1	CGTCCTTCTATGTATGTACGAGTCTCTGAATCTTG	SEQ ID No.11
			Rpa-5345-F2	GTTACTGGTCTCTTTAGCCGCTGTGGGTGTA	SEQ ID No.12
Rpa-5345-R2	ACCGCAAGTTGAATAGCAAGCCCTATCCAAA	SEQ ID No.13
			Rpa-pagA-F1	GAGGTGATTCAGGCAGAAGTTAAACAGGAGAAC	SEQ ID No.14
Rpa-pagA-R1	CCACATTGTTACATGATTATCAGCGGAAGTAGCA	SEQ ID No.15
			Rpa-pagA-F2	GGATTGGATTTCAAGTTGTACTGGACCGATT	SEQ ID No.16
Rpa-pagA-R2	TCAACCGTATATCCTTCTACCTCTAATGAATCAGG	SEQ ID No.17
			Rpa-capA-F1	TGGTGTTAGGGTTGCTACTCTTGGATTTACAGATG	SEQ ID No.18
Rpa-capA-R1	TGAAGTACATGCGGATGGTGTCCCACAATAATATC	SEQ ID No.19
			Rpa-capA-F2	TGACGGATTATGGTGCTAAGGGAACTAAAGATAC	SEQ ID No.20
Rpa-capA-R2	GCATCTGTAAATCCAAGAGTAGCAACCCTAACAC	SEQ ID No.21
			crRNA-5345-1-1	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAUGAAAUCAAAAGCAUCAUUGAAA</u>	SEQ ID No.22
crRNA-5345-1-2	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAUUGUGAAUUUGUCUGGCACAUGG</u>	SEQ ID No.23
			crRNA-pagA-1-1	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAAGCACCCAUGGUGGUUACCUCUU</u>	SEQ ID No.24
crRNA-pagA-1-2	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AUCUAUUCCUAGUUCUGAGUUAGAA</u>	SEQ ID No.25
			crRNA-pagA-1-3	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAAUCUGCUAUUUGGUCAGGAUUUA</u>	SEQ ID No.26
crRNA-pagA-1-4	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AUCAAAGUUAAGAAGAGUGAUGAAU</u>	SEQ ID No.27
			crRNA-pagA-2-1	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAAGUUGUACUGGACCGAUUCUCAA</u>	SEQ ID No.28
crRNA-pagA-2-2	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AUAGUGAUAACUUACAAUUGCCAGA</u>	SEQ ID No.29
			crRNA-capA-1-1	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>UGGCGAGUGAUACUGCUUGUAAGA</u>	SEQ ID No.30
crRNA-capA-1-2	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAUAAACUUGGUCAGGAUAAAAUA</u>	SEQ ID No.31
			crRNA-capA-2-1	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAAGAAGCUGAUCUUGACUAUGUGG</u>	SEQ ID No.32
crRNA-capA-2-2	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU<u>AAAAGAUGUAAAAAAUAUUGUGUAU</u>	SEQ ID No.33

注：crRNA中下划线部分为间隔序列(也称为向导序列，是crRNA中与RPA扩增产物序列互补的序列)，之前的部分为重复序列(也称锚定序列，是crRNA中与Cas12a蛋白结合的部分)。

二、细菌基因组DNA和炭疽芽孢杆菌检测靶基因阳性参考质粒的制备

供试细菌：炭疽芽孢杆菌毒力株(A16)、鼠疫杆菌、土拉杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌。

将上述各供试细菌1mL菌液进行热灭活处理，平板培养显示无活菌后采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号DP302)提取菌液全基因组(包括染色体基因组和质粒基因组)DNA，用100μL TE缓冲液洗脱，采用Qubit 3.0荧光法进行基因组核酸定量。

炭疽芽孢杆菌毒力株全基因组(包括染色体基因组和质粒基因组)进行适当的倍比稀释后用于CRISPR检测体系灵敏度的分析，13种非炭疽芽孢杆菌混合基因组用于炭疽杆菌CRISPR检测体系特异性的评价。

检测靶基因阳性参考质粒的制备：利用Primer Premier 6.0软件对炭疽芽孢杆菌的染色体特异基因BA_5345，质粒毒力基因pagA和capA基因设计PCR引物，参见表1中SEQ IDNo.4至SEQ ID No.9所示序列，使其扩增片段涵盖RPA扩增片段。以提取的基因组DNA为模板，利用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)对目的片段进行PCR扩增，利用A-overhang mixture(TaKaRa)对纯化产物3’端添加“A”碱基，随后加入pEASY-T1 SimpleCloning Vector(transgen)完成T-A克隆，采用PCR检测出阳性克隆并对其进行测序进一步确认。使用TIANprep Mini Plasmid Kit(TianGen)提取阳性参考质粒(pEASY-T1-5345、pEASY-T1-PagA、pEASY-T1-CapA)，利用Qubit 3.0核酸定量仪测定提取重组质粒的浓度，并换算出拷贝数浓度(拷贝数/μL)(具体方法是本领域公知的方法)，对已知拷贝数浓度的质粒进行适当的倍比稀释后用于CRISPR检测体系灵敏度的分析。

阳性参考质粒pEASY-T1-5345：将SEQ ID No.1的第8-517位所示DNA片段克隆到pEASY-T1载体后得到的重组质粒。

阳性参考质粒pEASY-T1-PagA：将SEQ ID No.2的第4-753位所示DNA片段克隆到pEASY-T1载体后得到的重组质粒。

阳性参考质粒pEASY-T1-CapA：将SEQ ID No.3的第5-872位所示DNA片段克隆到pEASY-T1载体后得到的重组质粒。

三、炭疽芽孢杆菌检测三靶标RPA扩增引物的筛选

将炭疽杆菌靶基因阳性参考质粒(pEASY-T1-5345、pEASY-T1-PagA、pEASY-T1-CapA)原液按10倍梯度稀释至1～10拷贝/μL，以各梯度稀释液为模板按照RPA法扩增分别取2μL质粒稀释模板进行RPA扩增，同时以2μL H₂O为模板作为阴性对照，按照以下操作进行：将所合成引物干粉溶解稀释成10μmol/L工作液，按RPA试剂盒(TwistAmp^TM Basic Kit；货号：INTABAS)方法进行RPA的扩增反应：将所合成的RPA引物干粉溶解稀释成10μM工作液，按如下体系配成50μL反应体系。其中先配成如下45.5μL预混液并混合均匀：Primer FreeRehydration buffer 29.5μL，正反向引物(10μM)各2.4μL，ddH₂O 11.2μL。上述45.5μL预混液中加入2μL模板DNA。吸取2.5μL MgAc于PCR管盖上，盖上盖子后稍离心，迅速放入GenieIII等温扩增荧光检测系统进行RPA反应。反应条件：39℃，20min(1200s)，进行凝胶电泳检查扩增情况。

结果如图1所示：Rpa-5345-F1/Rpa-5345-R1和Rpa-5345-F2/Rpa-5345-R2分别扩增184bp的和405bp条带，其中Rpa-5345-F2/Rpa-5345-R2未能扩增出目的条带，Rpa-5345-F1/Rpa-5345-R1能扩增出184bp条带，扩增效率能达到100拷贝/μL；Rpa-capA-F1/Rpa-capA-R1和Rpa-capA-F2/Rpa-capA-R2都能分别扩增282bp和160bp的目的条带，其中Rpa-capA-F2/Rpa-capA-R2的扩增效率更高，可达到100拷贝/μL；Rpa-pagA-F1/Rpa-pagA-R1和Rpa-pagA-F2/Rpa-pagA-R2都能分别扩增285bp和200bp的目的条带，扩增效率分别为10³拷贝/μL和10⁴拷贝/μL；由此可见除Rpa-5345-F2/Rpa-5345-R2能扩增出目的条带外，其余RPA引物都能扩增出目的条带，其扩增产物可进一步与crRNA匹配进行筛选，优化获得效果最佳的CRISPR-cas12a反应体系。

四、炭疽芽孢杆菌毒力株CRISPR-Cas12a检测体系的建立

LbCas12a蛋白的表达与纯化：将由上海吐露港生物科技有限公司提供的Cas12a表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将阳性克隆培养至OD600＝0.8，然后加入0.2mM的IPTG于16℃下诱导16h。对诱导后的菌体在裂解缓冲液中(50mM Tris-HCl，1.5M NaCl，1mMDTT，1mM PMSF和5％甘油，pH 8.0)进行超声破碎并离心获取上清。通过Ni柱(GEHealthcare)纯化上清里的重组表达蛋白Lbcas12a，PBS透析后，稀释至终浓度为1mg/ml，分装后冻存于-80℃。LbCas12a蛋白在上海吐露港生物科技有限公司也有销售，货号为32108。

炭疽芽孢杆菌毒力株CRISPR-Cas12a检测体系的筛选：以capA基因作为检测靶标，将上述RPA扩增产物(1μL、3μL、6μL、9μL)与不同浓度的crRNA(1μM、3μM、5μM)进行组合；将不同浓度crRNA(1μM、3μM)与不同浓度Cas12a(37nM、74nM、148nM)进行组合；通过以上组合对CRISPR-Cas12a检测反应体系进行筛选，按如下体系配成20μL反应体系：加入1～9μL RPA产物，1μL crRNA，1μL Cas12a，1μL信号报告探针(0.5-1μM)，1μL RNA inhibitor(10U)，其余体积用水补足。

其中，信号报告分子为：5’-FAM-CCCCCCCCCCCC-BHQ1-3’(SEQ ID No.34)。

反应条件和时间：37℃或42℃反应0-30min，每1min读取FAM荧光值。

将以上最佳组合反应体系用于对CapA、pagA和BA_5345基因的CRISPR检测反应的RPA引物对及crRNA筛选。

结果分析：使用荧光检测仪得到的10min反应累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的2倍。阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的2倍。以水作为模板的组为阴性对照组。

在反应产物为1μL时，crRNA在1μM和3μM时的CRISPR反应强度一致，与反应产物为3μL时相当；考虑检测灵敏度，将反应产物为1μL时，crRNA浓度为1μM或3μM的反应条件再与不同浓度Cas12a的进行组合筛选。crRNA浓度为1μM，Cas12a浓度为74nM反应组合效率最佳。经以上组合筛选，将RPA扩增产物2μL、crRNA浓度为1μM、Cas12a浓度为74nM的组合要素用于CRISPR-cas12a的检测的基本反应体系。

五、CRISPR检测反应crRNA序列的筛选

针对Rpa-5345-F1/Rpa-5345-R1引物对的扩增产物1，在含有TTTN的PAM序列下游设计crRNA间隔序列(向导序列)，在间隔序列上游加入重复序列，设计出两条crRNA：crRNA-5345-1-1和crRNA-5345-1-2(见表1)；同上，针对Rpa-pagA-F1/Rpa-pagA-R1引物对的扩增产物1，设计出4条crRNA：crRNA-pagA-1-1、crRNA-pagA-1-2、crRNA-pagA-1-3、crRNA-pagA-1-4(见表1)；针对Rpa-pagA-F2/Rpa-pagA-R2引物对的扩增产物2，设计出2条crRNA：crRNA-pagA-2-1、crRNA-pagA-2-2(见表1)；针对Rpa-capA-F1/Rpa-capA-R1引物对的扩增产物1，设计出2条crRNA：crRNA-capA-1-1、crRNA-capA-1-2(见表1)；针对Rpa-capA-F2/Rpa-capA-R2引物对的扩增产物2,设计出2条crRNA：crRNA-capA-2-1、crRNA-capA-2-2(见表1)。采用步骤四的CRISPR反应体系在实时荧光PCR仪(qtower³G)上对以上crRNA序列进行筛选。

荧光强度信号如图2，可见crRNA-5345-1-2、crRNA-pagA-1-2、crRNA-pagA-1-4、crRNA-capA-2-1和crRNA-capA-2-2对RPA产物具有较好的阳性检测反应(实验组荧光量大于阴性对照荧光量的2倍)。进一步选择反应速度快，反应强度高的crRNA序列crRNA-5345-1-2、crRNA-pagA-1-4、crRNA-capA-2-2进行炭疽芽孢杆菌CRISPR检测灵敏度和特异性的评价。

六、炭疽杆菌毒力株CRISPR检测方法的灵敏度及特异性评价

1、灵敏度分析

将前文构建的炭疽杆菌阳性参考质粒(pEASY-T1-5345、pEASY-T1-PagA、pEASY-T1-CapA)质粒原液按10倍梯度稀释，以梯度稀释液(n×10³～n×10^-2拷贝/μL，)2μL模板按照前文建立的方法进行灵敏度的评价，进行10次独立重复实验，将每个梯度组与阴性对照组(NC组，以水为模板)进行T检验统计分析(***为P<0.001,**为*P<0.01，ns为无显著性差异)。

结果显示(图3)，以Rpa-5345-F1/Rpa-5345-R1引物对进行RPA扩增，以扩增产物为靶DNA，crRNA-5345-1-2与Cas12a组合进行CRISPR检测拷贝数灵敏度的评价，检测模板最低浓度可达到7×10^-1拷贝/μL，即1-2拷贝数/反应；以Rpa-pagA-F1/Rpa-pagA-R1引物对进行RPA扩增，以扩增产物为靶DNA，crRNA-PagA-1-4与Cas12a组合进行CRISPR检测拷贝数灵敏的评价，检测模板最低浓度达到3×10^-2拷贝/μL，即1拷贝/反应；以Rpa-CapA-F2/Rpa-CapA-R2引物对进行RPA扩增，以扩增产物为靶DNA，crRNA-CapA-2-2与Cas12a组合进行CRISPR检测拷贝数灵敏度的评价，检测模板最低浓度达到9×10^-1拷贝/μL，即1-2拷贝数/反应。

2、特异性检测

以我国炭疽杆菌强毒株(A16)的全基因组(包含染色体基因组和质粒基因组)模板、无炭疽杆菌的13种细菌混合基因组模板和水为模板检测前文建立的炭疽杆菌毒力株CRISPR-Cas12a检测方法的特异性，独立重复试验至少4次。

结果如图4所示：针对BA_5345、pagA和capA检测靶标的CRISPR-Cas12a检测，以非炭疽杆菌细菌混合基因组与以水为模板的阴性对照组(NC组)检测信号进行t检验显示无显著差异。非炭疽杆菌细菌混合基因组是一种由高浓度的无炭疽杆菌的13种细菌基因组混合组成，即包含了鼠疫杆菌、土拉杆菌、鼻疽和类鼻疽伯克霍尔德菌、羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、副溶血弧菌等致病菌，也包含了蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等与炭疽芽孢杆菌具有较高相似度的芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等工程菌。上述结果表明针对炭疽杆菌的CRISPR-Cas12a检测系统特异性较好，与上述致病菌、蜡样芽孢杆菌等高度同源的芽孢杆菌和常见工程菌均没有发生非特异性反应。

七、本发明方法在模拟临床样本、模拟环境样本(土壤)的炭疽杆菌核酸检测中的应用。

为了验证炭疽芽孢杆菌RPA-Cas12a检测方法的实用性，请其他研究人员分别在正常人全血、土壤加入炭疽杆菌毒力株(A16)全基因组(包含染色体基因组和质粒基因组)，分别得到含有不同浓度的炭疽芽孢杆菌核酸的全血、土壤模拟样本，加入水的一组为阴性对照组样本(NC组)。以QIAamp DNA Mini kit和DNeasy PowerSoil Pro Kit试剂盒分别提取全血和土壤模拟样本的核酸。检测人员对上述20份样本进行盲测：取上述样本的提取核酸2μL作为模板，以公开发表文献方法对样本的染色体特异基因BA_5345靶标进行了实时荧光PCR检测[

P,Knap J,Kolodziej M,Mirski T,Joniec J,Graniak G,Zakowska D,Winnicka I,Bielawska-Drózd A.Real-Time PCR Identification of Unique Bacillusanthracis Sequences.Folia Biol(Praha).2015；61(5):178-83.]，BA_5345的引物和探针分别为：5345-F(5’-CCTATAGAAGCGGATTTGTC-3’)；5345-R(5’-CCATTGATTCATCACCCAAG-3’)；5345-P(5’-FAM-TACACCCACAGCGGCTAA AGAG-TAMRA-3’)。同时将上述样本提取核酸进行本发明RPA-Cas12a联合方法的检测。结果如表2所示，RPA-Cas12a检测方法的阳性样本检出率优于实时荧光PCR，且该方法针对血液样品、土壤样品均具有较好的特异性，与人血基因组，土壤提取基因组均不发生非特异性反应(阴性对照组无阳性信号)。

表2、CRISPR-Cas12a和real-time PCR对模拟样本检测结果。

注：NC为样本中加入2μL体积H₂O的阴性对照组；/为无阳性信号。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> RPA联合CRISPR技术检测炭疽杆菌的方法及成套试剂

<130> GNCLN201856

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 523

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgggggata ccaggatggg tctcgatttt gtggattgcg tatgcagttc tacttttaaa 60

aggaatcaat cctatagaag cggatttgtc acaaatgagc aaaggtttgg ggttactggt 120

ctctttagcc gctgtgggtg tacctttggg gtatgtaatg caccaagtat attttggaat 180

tgcttgggtg atgaatcaat ggcgaaattt tgatgaaatc aaaagcatca ttgaaaagaa 240

ataccctaaa aagggtggat ggggaaaaga caaaaatgat gattattttc attgtgaatt 300

tgtctggcac atggtactac tcaaacaaga ttcagagact cgtacataca tagaaggacg 360

atacagacat ttattgggaa ctacacatgc actagggtca ttgttcatta gctcatcgat 420

tgcattatta acaacggctt ttattgtcct tacgcattta tctagcttta tgaacaatta 480

ctatttttgg atagggcttg ctattcaact tgcggtattt ttt 523

<210> 2

<211> 759

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ttagaggtga ttcaggcaga agttaaacag gagaaccggt tattaaatga atcagaatca 60

agttcccagg ggttactagg atactatttt agtgatttga attttcaagc acccatggtg 120

gttacctctt ctactacagg ggatttatct attcctagtt ctgagttaga aaatattcca 180

tcggaaaacc aatattttca atctgctatt tggtcaggat ttatcaaagt taagaagagt 240

gatgaatata catttgctac ttccgctgat aatcatgtaa caatgtgggt agatgaccaa 300

gaagtgatta ataaagcttc taattctaac aaaatcagat tagaaaaagg aagattatat 360

caaataaaaa ttcaatatca acgagaaaat cctactgaaa aaggattgga tttcaagttg 420

tactggaccg attctcaaaa taaaaaagaa gtgatttcta gtgataactt acaattgcca 480

gaattaaaac aaaaatcttc gaactcaaga aaaaagcgaa gtacaagtgc tggacctacg 540

gttccagacc gtgacaatga tggaatccct gattcattag aggtagaagg atatacggtt 600

gatgtcaaaa ataaaagaac ttttctttca ccatggattt ctaatattca tgaaaagaaa 660

ggattaacca aatataaatc atctcctgaa aaatggagca cggcttctga tccgtacagt 720

gatttcgaaa aggttacagg acggattgat aagaatgta 759

<210> 3

<211> 877

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

aaatcctcgt tatgtagcaa tcgtattacc tcttatcgca gttatattaa tagctgcgac 60

atgggtacaa cgtacagaag cagtagcacc agtaaaacat cgtgagaacg aaaaattgac 120

gatgacgatg gttggtgaca ttatgatggg acgtcacgta aaagagattg ttaatcgtta 180

cggtacagat tatgtttttc gtcatgtttc gccatattta aaaaactcag attacgtaag 240

tgggaatttc gaacatcctg ttttgttaga agataaaaag aattatcaaa aagcagataa 300

gaatattcac ttaagtgcaa aagaagaaac agttaaggca gtaaaagaag ccggatttac 360

agtattaaat ttggcgaata accatatgac ggattatggt gctaagggaa ctaaagatac 420

aataaaggcc tttaaagaag ctgatcttga ctatgtgggt gctggtgaaa atttcaaaga 480

tgtaaaaaat attgtgtatc aaaatgtaaa tggtgttagg gttgctactc ttggatttac 540

agatgcattt gtagcaggag ctattgcaac gaaagaacaa ccaggttcgt taagtatgaa 600

cccagatgta ttacttaagc aaattagtaa ggcaaaggat cctaaaaaag gtaatgctga 660

tcttgtcgta gtaaatacgc actgggggga agaatacgat aataaaccga gtcctagaca 720

ggaagcctta gcaaaagcaa tggttgatgc aggggcagat attattgtgg gacaccatcc 780

gcatgtactt caatcttttg atgtgtataa gcaagggatt atcttctata gtttaggtaa 840

ctttgtgttt gaccaaggat ggacaagaac aaaagat 877

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ataccaggat gggtctcg 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

taccgcaagt tgaatagca 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gaggtgattc aggcagaag 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cttatcaatc cgtcctgtaa c 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cctcgttatg tagcaatcg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ttgttcttgt ccatccttg 19

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gaattgcttg ggtgatgaat caatggcgaa at 32

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

cgtccttcta tgtatgtacg agtctctgaa tcttg 35

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

gttactggtc tctttagccg ctgtgggtgt a 31

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

accgcaagtt gaatagcaag ccctatccaa a 31

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

gaggtgattc aggcagaagt taaacaggag aac 33

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

ccacattgtt acatgattat cagcggaagt agca 34

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

ggattggatt tcaagttgta ctggaccgat t 31

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

tcaaccgtat atccttctac ctctaatgaa tcagg 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

tggtgttagg gttgctactc ttggatttac agatg 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

tgaagtacat gcggatggtg tcccacaata atatc 35

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

tgacggatta tggtgctaag ggaactaaag atac 34

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

gcatctgtaa atccaagagt agcaacccta acac 34

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

uaauuucuac uaaguguaga uaaugaaauc aaaagcauca uugaaa 46

<210> 23

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

uaauuucuac uaaguguaga uaauugugaa uuugucuggc acaugg 46

<210> 24

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

uaauuucuac uaaguguaga uaaagcaccc auggugguua ccucuu 46

<210> 25

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

uaauuucuac uaaguguaga uaucuauucc uaguucugag uuagaa 46

<210> 26

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

uaauuucuac uaaguguaga uaaaucugcu auuuggucag gauuua 46

<210> 27

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

uaauuucuac uaaguguaga uaucaaaguu aagaagagug augaau 46

<210> 28

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

uaauuucuac uaaguguaga uaaaguugua cuggaccgau ucucaa 46

<210> 29

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

uaauuucuac uaaguguaga uauagugaua acuuacaauu gccaga 46

<210> 30

<211> 45

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

uaauuucuac uaaguguaga uuggcgagug auacugcuug uaaga 45

<210> 31

<211> 45

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 31

uaauuucuac uaaguguaga uaauaaacuu ggucaggaua aaaua 45

<210> 32

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 32

uaauuucuac uaaguguaga uaaagaagcu gaucuugacu augugg 46

<210> 33

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 33

uaauuucuac uaaguguaga uaaaagaugu aaaaaauauu guguau 46

<210> 34

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 34

cccccccccc c 11

Claims

1.用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的成套引物组，由如下组成：

(A1)引物组1：由RPA引物对1和crRNA1组成；

所述RPA引物对1是根据SEQ ID No.1所示核苷酸序列设计的；

所述crRNA1包括重复序列1和间隔序列1，所述重复序列1能够与cas蛋白结合，所述间隔序列1与所述RPA引物对1的扩增产物序列相匹配；

(A2)引物组2：由RPA引物对2和crRNA2组成；

所述RPA引物对2是根据SEQ ID No.2所示核苷酸序列设计的；

所述crRNA2包括重复序列2和间隔序列2，所述重复序列2能够与cas蛋白结合，所述间隔序列2与所述RPA引物对2的扩增产物序列相匹配；

(A3)引物组3：由RPA引物对3和crRNA3组成；

所述RPA引物对3是根据SEQ ID No.3所示核苷酸序列设计的；

2.根据权利要求1所述的成套引物组，其特征在于：所述RPA引物对1为能够以炭疽芽孢杆菌全基因组为模板扩增得到SEQ ID No.1的第177-360位所示DNA片段的引物对；和/或

所述crRNA1中，所述重复序列1为SEQ ID No.23的第1-21位，所述间隔序列1为SEQ IDNo.23的第22-46位；

和/或

所述RPA引物对2为能够以炭疽芽孢杆菌毒力株全基因组为模板扩增得到SEQ ID No.2的第4-288位所示DNA片段的引物对；和/或

所述crRNA2中，所述重复序列2为SEQ ID No.27的第1-21位，所述间隔序列2为SEQ IDNo.27的第22-46位；

和/或

所述RPA引物对3为能够以炭疽芽孢杆菌毒力株全基因组为模板扩增得到SEQ ID No.3的第387-546位所示DNA片段的引物对；和/或

所述crRNA3中，所述重复序列3为SEQ ID No.33的第1-21位，所述间隔序列3为SEQ IDNo.33的第22-46位。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：所述RPA引物对1为由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成的引物对；和/或

所述crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；

和/或

所述RPA引物对2为由SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的两条单链DNA组成的引物对；和/或

所述crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；

和/或

所述RPA引物对3为由SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的两条单链DNA组成的引物对；和/或

所述crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示。

4.用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的试剂盒，含有权利要求1-3中任一所述的成套引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有如下中的全部或部分：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和醋酸镁。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有cas12a蛋白和/或信号报告探针和/或成套阳性参考质粒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述cas12a蛋白为LbCas12a蛋白；和/或

所述信号报告探针的序列如SEQ ID No.34所示，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；和/或

所述成套阳性参考质粒由阳性参考质粒1、阳性参考质粒2和阳性参考质粒3组成；所述阳性参考质粒1为含有SEQ ID No.1的第8-517位所示DNA片段的质粒；所述阳性参考质粒2为含有SEQ ID No.2的第4-753位所示DNA片段的质粒；所述阳性参考质粒3为含有SEQ IDNo.3的第5-872位所示DNA片段的质粒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

9.权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4-8中任一所述的试剂盒在如下任一中的应用：

(A2)制备用于诊断炭疽芽孢杆菌感染的产品；

(A3)制备用于诊断炭疽病的产品。

10.一种检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的方法，包括如下步骤：

(b1)从待测样本中提取DNA；

(b2)以(b1)提取的DNA为模板，采用权利要求1-3任一中所述的RPA引物对1、所述RPA引物对2和所述RPA引物对3分别进行RPA扩增，依次得到扩增产物1、扩增产物2和扩增产物3；

(b3)取(b2)所得扩增产物1，加入权利要求6-8任一中所述的信号报告探针、权利要求6-8任一中所述的cas12a蛋白和权利要求1-3任一中所述的crRNA1，形成反应体系1；取(b2)所得扩增产物2，加入权利要求6-8任一中所述的信号报告探针、权利要求6-8任一中所述的cas12a蛋白和权利要求1-3任一中所述的crRNA2，形成反应体系2；取(b2)所得扩增产物3，加入权利要求6-8任一中所述的信号报告探针、权利要求6-8任一中所述的cas12a蛋白和权利要求1-3任一中所述的crRNA3，形成反应体系3；将所述反应体系1、所述反应体系2和所述反应体系3分别进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号按照如下确定检测结果：

若所述反应体系1的检测信号为阳性，则所述待测样本中含有或候选含有炭疽芽孢杆菌；若所述反应体系1的检测信号为阴性，则所述待测样本中不含有或候选不含有炭疽芽孢杆菌；