RU2404251C1 - Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида yersinia pestis - Google Patents
Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида yersinia pestis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2404251C1 RU2404251C1 RU2009116579/10A RU2009116579A RU2404251C1 RU 2404251 C1 RU2404251 C1 RU 2404251C1 RU 2009116579/10 A RU2009116579/10 A RU 2009116579/10A RU 2009116579 A RU2009116579 A RU 2009116579A RU 2404251 C1 RU2404251 C1 RU 2404251C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- dna
- cds39
- isrev216
- pcr
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Описан способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Ycrsinia pestis, включающий выделение ДНК из культуры клеток и проведение тестирования с использованием набора праймеров в реакции ПЦР, отличающийся тем, что тестирование проводят в два этапа: на первом для идентификации используют набор праймеров, состоящий из праймеров «3а», «vlm12for/ISrev216», «JS», «CDS39», которые взаимодействуют с ДНК пробы, при этом синтез специфических ДНК, направляемый праймерами «3а» и «vlm12for/ISrev216» подтверждает наличие в пробе ДНК штамма возбудителя чумы, а положительный результат с праймерами «CDS39» свидетельствует о наличии в пробе ДНК штамма Y.pestis одного из дополнительных подвидов, внутривидовую дифференциацию которых осуществляют вторым этапом, путем постановки ПЦР с праймерами «traA» и «YP02258», причем полученные с каждой парой праймеров результаты оценивают как положительные при наличии амплификатов известной длины, а именно: «3а» - 276 п.н., «JS» - 223 п.н., «vlm12for/ISrev216» - 390 п.н., «traA» - 472 п.н., «CDS39» - 418 п.н., «YP02258» - 130 п.н., при этом отрицательными считают результаты при отсутствии амплификатов или при их наличии, но с нехарактерным числом пар нуклеотидов. Изобретение может быть использовано при экспресс-диагностике возбудителя чумы, а именно при идентификации всех штаммов, принадлежащих к виду Y.pestis. 6 з.п. ф-лы, 11 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано при экспресс-диагностике возбудителя чумы, а именно при идентификации всех штаммов, принадлежащих к виду Y.pestis.
В настоящее время существует проблема ускоренной идентификации и быстрой внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы, выделенных от животных и из объектов внешней среды. Выделенные штаммы необходимо четко разграничивать на две группы: штаммы основного подвида - типичные (эпидемически опасные и вирулентные для людей) и штаммы дополнительных подвидов (caucasica, hissarica, ulegeica, altaica, talassica) - атипичные, со сниженной эпидемической опасностью и с избирательной вирулентностью. Ускоренная идентификация с одновременной внутривидовой дифференциацией необходимы для правильной оценки эпидемической ситуации, а также для проведения своевременного начала противоэпидемических мероприятий в необходимом объеме с целью предотвращения распространения инфекции.
Известен способ экспресс-диагностики чумы с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) на всех этапах этого исследования. Этот способ предусматривает использование зарегестрированных тест-систем, состоящих из набора праймеров, которые выявляют фрагменты генов cafl и рlа, расположенные на плазмидах чумного микроба, отвечающие за синтез фракции I и пестицина («Ген Пест» ТУ8895-005-0189).
Применяемые тест-системы предназначены исключительно для детекции типичных штаммов со специфическими плазмидами, и не способны выявлять атипичные штаммы возбудителя чумы, с атипичной структурой генома, что сужает диагностические возможности представленных тест-систем для возбудителя чумы плазмиды.
Известен способ идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica (Стенкова A.M., Исаеева М.П., Рассказов В.А. «Разработка многопраймерной ПЦР для идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов (Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica. // Мол генетика, микробиол и вирусол. 2008, №3, с.18-23), заключающийся в том, что для мульттилокусного анализа используют шесть праймеров, выявляющих последовательности генов ompF - поринов Yersinia, при этом видоспецифичность выбранных для тестирования последовательностей позволяет с помощью предложенных авторами праймеров выявлять среди штаммов рода Yersinia штаммы, принадлежащие к трем видам, патогенным для человека.
Однако в предложенном способе отсутствуют данные проверки набора праймеров на различных штаммах внутривидовых групп Y.pestis, в том числе атипичных. Кроме того, предложенные пары праймеров не позволяют отличить и локализовать по очагам разные таксономические внутривидовые группы штаммов возбудителя чумы с различной эпидемиологической опасностью. Эти обстоятельства сужают диагностические возможности известного способа.
За прототип выбран способ применения мультилокусной ПЦР для ускоренной идентификации Y.pestis (Куклев В.Е., Сухоносов И.Ю., Осина Н.А., с соавт. Применение мультилокусной ПЦР для ускоренной идентификации Y.pestis. // Сборник трудов, VI всероссийской науч.-практ. конф. с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней», Москва, - 2007. Т.1. С.376-377), заключающийся в том, что разработана тест-система на основании нуклеотидных последовательностей видоспецифичного хромосомного локуса «3а», а также генов irp2 островка высокой патогенности и lcrV плазмиды pCad, позволяющая одновременно с определением принадлежности возбудителя к виду Y.pestis дифференцировать авирулентные штаммы чумного микроба от вирулентных.
Однако предложенный набор праймеров имеет ряд недостатков:
- праймеры «3а» не выявляют все штаммы чумного микроба, так в некоторых очагах чумы в Африке от людей выделены штаммы, в хромосоме которых отсутствуют фрагменты ДНК, комплементарные этой паре праймеров, и отрицательный результат не гарантирует отсутствие возбудителя чумы в пробе;
- праймеры «IcrV» определяют репликацию ампликонов в присутствие плазмиды pCad, которая имеется не только у вирулентных, но и у авирулентных и вакцинных штаммов;
- праймеры «irp2», свидетельствуя о возможности проявления «общей» вирулентности штаммов для грызунов-носителей и людей, не позволяют, также как и праймеры «3а» и «IcrV», отличить и локализовать по очагам разные таксономические группы штаммов Y.pestis с «избирательной вирулентностью» и особым геномом, для одних из которых характерно отсутствие эпидемической опасности, а для других - полное отсутствие вирулентности для людей.
Таким образом, представленные праймеры ни поодиночке, ни в комплексе не дают возможность идентификацировать все, в том числе и с измененным генотипом штаммы Y.pestis, и не позволяют проводить внутривидовую дифференциацию, что снижает эффективность диагностических возможностей известного способа.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового эффективного способа, позволяющего проводить идентификацию и внутривидовую дифференциацию всех штаммов вида Yersinia pestis.
Поставленная цель достигается тем, что в известном способе идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Yersinia pestis, включающем выделение ДНК из культуры клеток и проведение с использованием набора праймеров в реакции ПЦР тестирования, последнее проводят в два этапа, в первом для идентификации используют набор праймеров, состоящий из праймеров «3а», «vlm12for/ISrev216», «JS» и «CDS39», которые взаимодействуют с ДНК пробы, при этом синтез специфических ДНК, направляемый праймерами «3а» и «vlm12for/ISrev216», подтверждаем наличием в пробе ДНК штамма возбудителя чумы, а положительный результат с праймерами «CDS39» свидетельствует о наличии в пробе ДНК штамма Y.pestis одного из дополнительных подвидов, внутривидовую дифференциацию которых осуществляют вторым этапом, путем постановки ПЦР с праймерами «traA» и «YP02258», причем полученные с каждой парой праймеров результаты оценивают как положительные при наличии амплификатов известной длины, а именно: «3а» - 276 п.н., «JS» - 223 п.н., «vlm12for/ISrev216» - 390 п.н., «traA» - 472 п.н., «CDS39» - 418 п.н., «YP02258» - 130 п.н., при этом отрицательными считают результаты при отсутствии амплификатов или при их наличии, но с нехарактерным числом пар нуклеотидов.
Кроме того, праймеры «CDS39» конструируют, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и они имеют прямую и обратную нуклеотидную последовательности: «CDS39for» 5'-ТТА AAG GTC TGC GAA СТG GСТ С-3' и «CDS39rev» 5'-ТСТ GСА ТТG CGA AGG TAC TGA AC-3'.
При этом праймеры «traA» конструируют, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и они имеют прямую и обратную нуклеотидную последовательности: «traAfor» 5'-ТGТ СТА ТТА ТТА АСG СТG ТАС CCG С-3' и «traArev» 5'-CAG СТG GСА GТА ТGG ААА ТАС СТG-3'.
Сущность изобретения заключается также в том, что выявленную культуру оценивают, как возбудитель атипичной чумы, относящейся к одному из дополнительных подвидов (hissarica, ulegeica, altaica, talassica), если в результате ПЦР появляются амплификаты, свидетельствующие о положительной реакции с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «CDS39», «YP02258» и отрицательным результатом с праймерами «traA» и «JS».
Кроме того, выявленную культуру оценивают, как возбудитель атипичной чумы, относящейся к дополнительному подвиду caucasica, если в результате ПЦР появляются амплификаты, свидетельствующие о положительной реакции с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «CDS39», «traA» и «YP02258» и отрицательной с праймерами «JS».
Причем при внутривидовой дифференциации в случае отсутствия амплификации фрагмента ДНК в 130 п.н., направляемого праймерами «YP02258» с одновременным положительным результатом с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216» и «CDS39», выявленную культуру оценивают, как культуру возбудителя чумы, характерную для биовара «microtus».
При этом выявленную культуру оценивают, как возбудитель псевдотуберкулеза, если в результате ПЦР с помощью праймеров «JS» синтезируется амплификат длиной 223 п.н.
Способ осуществляют следующим образом.
Алгоритм постановки ПЦР с предлагаемым набором праймеров предполагает постановку реакции в два этапа.
На первом этапе постановку проводят с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «JS» и «CDS39». Если результаты реакции свидетельствуют о наличии в материале ДНК штаммов штаммов возбудителя чумы дополнительных подвидов (caucasica, hissarica, ulegeica, altaica, talassica), то проводят второй этап, а именно постановку с праймерами «traA» и «YP02258».
Пары праймеров, используемые в способе характеризуют как:
- «vlm12for/ISrev216» - праймеры, специфические для вида Y.pestis, направляющие синтез специфической последовательности длиной 390 пар нуклеотидов (п.н.);
- «3а» - праймеры, специфические для вида Y.pestis, направляющие синтез специфической последовательности длиной 276 п.н.;
- «JS» - праймеры, специфически реагирующие с ДНК Y. pseudotuber-culosis, направляющие синтез специфической последовательности длиной 223 п.н.;
- «CDS39» - праймеры, специфические для всех штаммов дополнительных подвидов чумного микроба. Праймеры были сконструированы, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и имеют последовательности: «CDS39for» 5'-ТТА AAG GTC TGC GAA CTG GCT С-3' и «CDS39rev» 5'-ТСТ GCA TTG CGA AGG TAC TGA АС-3'. Праймеры направляют синтез специфической последовательности длиной 418 п.н.;
- «traA» - праймеры, специфические для штаммов дополнительного подвида чумного микроба «caucasica». Были сконструированы, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и имеют последовательность: «traAfor» 5'-TGT СТА ТТА ТТА ACG CTG TAC CCG С-3' и «traArev» 5'-CAG CTG GCA GTA TGG AAA TAC CTG-3'. Праймеры направляют синтез специфической последовательности длиной 472 п.н.;
- «YP02258» - праймеры, способные дифференцировать штаммы чумного микроба, относящиеся к вновь предложенному биовару «microtus». Штаммы биовара «microtus» в отличие от штаммов основного подвида и других штаммов дополнительных подвидов несут в гене araC, отвечающем за регуляцию арабинозного оперона, делецию 122 п.н. Присутствие упомянутой делеции приводит к невозможности синтезировать продукт амплификации в ПЦР при использовании праймеров «YP02258» и в этом случае реакция является отрицательной. При положительном результате праймеры направляют синтез специфической последовательности длиной 130 п.н.
Во время проведения этапов специфической индикации с целью определения штаммов возбудителя чумы можно применять набор праймеров в различных вариантах.
а) При идентификации по виду и внутривидовым группам бактерий из отдельных колоний в посевах проб, подозрительных на зараженность возбудителем чумы в ПЦР, используют полный набор праймеров.
б) При внутривидовой идентификации штаммов, ранее идентифицированных по микробиологическим и иммунохимическим тестам как принадлежащие к виду Y.pestis, в ПЦР используют сокращенный набор праймеров, включающих только «CDS39», «traA» и «YP02258». Анализ результатов ПЦР-тестирования проводят руководствуясь таблицей 1.
| Таблица 1 | ||||||
| Группы штаммов | Характер реакции с праймерами | |||||
| JS | vlm12for/ISrev216 | 3а | CDS39 | traA | YP02258 | |
| Все классические штаммы основного подвида (опасные для человека) | - | + | + | - | - | + |
| Группа штаммов основного подвида из Центральной Африки (опасные для человека) | - | + | - | - | - | + |
| Штаммы дополнительного подвида из высокогорных очагов Кавказа (опасность для человека подвергается сомнению) | - | + | + | + | + | + |
| Штаммы дополнительных подвидов из высокогорных очагов Центральной Азии (опасность для человека подвергается сомнению) | - | + | + | + | - | + |
| Штаммы дополнительных подвидов из высокогорных очагов Центральной Азии (авирулентны для человека) | - | + | + | + | - | - |
| Штаммы Yersinia pseudotuberculosis | + | - | - | |||
Перед постановкой ПЦР проводят предварительную подготовку материала. Массу бактерий, сформировавших колонию или газон, в каждой из проб стерильной стеклянной палочкой перемещают в бактериологическую стеклянную пробирку, содержащую 200 мкл физиологического раствора, после чего выделяют ДНК согласно (Методические указания МУ 1.3.1794-03. «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I и II группы патогенности». - М.: - 2003. - 38 с.). Полученную тотальную ДНК исследуют в ПЦР с помощью праймеров «JS», специфичных для возбудителя псевдотуберкулеза, и праймеров, специфических для вида и различных внутривидовых групп Y.pestis. Условия постановки ПЦР перечень праймеров соответствовали указанным в таблице 2.
| Таблица 2 | |||
| Праймеры | Условия реакции | ||
| Температура (°С) | Время реакции | Количество циклов | |
| 3а, JS, vlm12for/ISrev216, traA, CDS39, «YP02258» | 94 | 5 мин | 1 |
| 94 | 15 с | 30 | |
| 65 | 15 с | ||
| 72 | 30 с | ||
| 72 | 5 мин | 1 | |
Учет результатов проводят по каждой паре праймеров. Все результаты с используемыми праймерами оцениваются как положительные при наличии в ПЦР амплификатов известной длины, а именно: «3а» - 276 п.н., «JS» - 223 п.н., «vlm12for/ISrev216» - 390 п.н., «traA» - 472 п.н., «CDS39» - 418 п.н., «YP02258» - 130 п.н. Отрицательными считают результаты при отсутствии амплификатов или при их наличии, но с не характерным числом пар нуклеотидов. Суммарную оценку результатов проводят руководствуясь с таблицей 1.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется примерами проведения идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Yersinia pestis.
Пример 1
Культуру микробных клеток (отобранную с агаровой пластины питательной среды на одном из этапов экспресс-диагностики возбудителя чумы в материале), полученную из блох полевки, обозначается как проба №1, обеззараживают и выделяют ДНК, как описано ранее.
На первом этапе способа производят постановку ПЦР с праймерами: «3а»; «vlm12for/ISrev216»; «JS»; «CDS39». Для каждой пары праймеров применяют отдельную пробирку. Реакция проходит в объеме 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 mM Трис НСl, рН 8,5, 25 mM KCl, 1,5 mМ MgCl2, по 200 mkM каждого дНТФ, 0,1% ТритонХ-100, 10 mM 2-меркаптоэтанол, 1 ЕД Taq-полимеразы и по 5 рмоль каждого праймера. Реакцию амплификации проводят в программируемом термостате "Терцик". Условия амплификации включали стадии денатурации, отжига и элонгации, как описано в таблице 2. Продукты амплификации анализируют в 2% агарозном геле. В качестве контролей используют: а) отрицательный контроль - в пробирки с реакционной смесью вносят по 5 мкл дистиллированой воды; б) положительный контроль в виде ДНК штамма возбудителя чумы дополнительного подвида Yersinia pestis 1213- в пробирки с реакционной смесью вносят по 5 мкл выделенной ДНК; в) положительный контроль для праймеров «узнающих» только последовательности возбудителя псевдотуберкулеза - «JS». В пробирки с реакционной смесью вносят по 5 мкл выделенной ДНК штамма Yersinia pseudotuberculosis I. Результаты идентификации представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | ||||
| Материал | Праймеры | |||
| 3а | vlm12for/ISrev216 | JS | CDS39 | |
| Проба №1 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pestis 1213 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pseudotuberculosis | - | - | + | - |
| Отрицательный контроль | - | - | - | - |
Таким образом, на первом этапе ПЦР показала, Проба №1 содержит ДНК, взаимодействующую с праймерами «3а»; «vlm12for/ISrev216», итогом чего стала амплификация специфических фрагментов, характерных для возбудителя чумы и наличие специфического продукта амплификации, синтез которого направлялся праймерами «CDS39». Это свидетельствовало о том (см. таблицу 1), что выявленная ДНК принадлежит штамму одного из дополнительных подвидов, что потребовало проведения второго этапа ПЦР-тестирования для внутривидовой дифференциации. Производили постановку ПЦР с праймерами «traA» и «YP02258». В качестве контроля ДНК штамма возбудителя псевдотуберкулеза заменяем на ДНК штамма дополнительного подвида caucasica. Получаем результаты, представленные в таблице 4.
| Таблица 4 | ||
| Материал | Праймеры | |
| traA | YP02258 | |
| Проба №1 | + | + |
| ДНК Y.pestis 1213 | - | - |
| ДНК Y.pestis 1709 | + | + |
| Отрицательный контроль | - | - |
В пробе выявлена последовательность гена «traA», а праймеры «сканирующие» структуру araC-гена не выявили в нем каких-либо делеций. Согласно таблице 1 это свидетельствует о наличии в пробе №1 ДНК штамма возбудителя чумы из высокогорных очагов Кавказа, относящегося к подвиду caucasica, эпидемическая значимость которого подвергается сомнению.
Пример 2
На исследование поступила культура возбудителя, полученная после высева из органов белой мышки, зараженной материалом, подозрительным на наличие возбудителя чумы (проба №2).
Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 5.
| Таблица 5 | ||||
| Материал | Праймеры | |||
| 3а | vlm12for/ISrev216 | JS | CDS39 | |
| Проба №2 | + | + | - | - |
| ДНК Y.pestis 1213 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pseudotuberculosis | - | - | + | - |
| Отрицательный контроль | - | - | - | - |
На этом этапе исследование останавливаем, так как полученные результаты, синтез специфических фрагментов ДНК, направляемый только праймерами «3а» и «vlm12for/ISrev216», свидетельствуют о том (см. таблицу 1), что в пробе №2 выявлена ДНК штамма возбудителя чумы основного подвида, представляющего опасность для человека.
Пример 3
На исследование поступила культура неизвестного возбудителя, выделенная из органов лесной мыши, труп которой обнаружен в одном из сельских районов (проба №3).
Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1, за исключением того, что материалом для исследования была Проба №3. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 6.
| Таблица 6 | ||||
| Материал | Праймеры | |||
| 3а | vlm12for/ISrev216 | JS | CDS39 | |
| Проба №3 | - | - | + | - |
| ДНК Y.pestis 1213 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pseudotuberculosis | - | - | + | - |
| Отрицательный контроль | - | - | - | - |
Полученные результаты показывают, что в Пробе №3 обнаружена ДНК, характерная для возбудителя псевдотуберкулеза. Это доказывается амплификацией специфического фрагмента, синтез которого направляли праймеры «JS» (см. таблицу 1). Дальнейшие исследования в ПЦР не проводим.
Пример 4
На исследование поступила культура возбудителя, полученная из музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института, идентифицированная ранее как возбудитель чумы, выделенный в одном из Африканских очагов (проба №4).
Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1, за исключением того, что материалом для исследования была Проба №4. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 7.
| Таблица 7 | ||||
| Материал | Праймеры | |||
| 3а | vlm12for/ISrev216 | JS | CDS39 | |
| Проба №4 | - | + | - | - |
| ДНК Y.pestis 1213 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pseudotuberculosis | - | - | + | - |
| Отрицательный контроль | - | - | - | - |
Из всех пар праймеров, используемых на первом этапе исследования с Пробой №4, только праймеры «vlm12for/ISrev216» дали положительный результат. Это свидетельствовало о наличии в пробе штамма возбудителя чумы основного подвида (см. таблицу 1), ДНК которого не реагирует с праймерами «3а». Наши исследования показывают, что только группа штаммов из Центральной Африки обладает подобными свойствами.
Пример 5
На исследование поступила полевка с признаками инфекционного заражения. Из полевки высеяна чистая культура неизвестного возбудителя, обозначенная как проба №5.
Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1, за исключением того, что материалом для исследования была Проба №5. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 8.
| Таблица 8 | ||||
| Материал | Праймеры | |||
| 3а | vlm12for/ISrev216 | JS | CDS39 | |
| Проба №5 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pestis 1213 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pseudotuberculosis | - | - | + | - |
| Отрицательный контроль | - | - | - | - |
Аналогичные данные были получены в Примере 1. Проводим второй этап исследования с праймерами «traA» и «YP02258». На втором этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 9.
| Таблица 9 | ||
| Материал | Праймеры | |
| traA | YP02258 | |
| Проба №5 | - | - |
| ДНК Y.pestis 1213 | - | - |
| ДНК Y.pestis 1709 | + | + |
| Отрицательный контроль | - | - |
На втором этапе постановке ПЦР в Пробе №5 обнаружена ДНК с делецией в гене, отвечающем за синтез арабинозы (согласно таблицы 1). Полученные результаты свидетельствовали о наличии в исследуемом материале ДНК возбудителя чумы дополнительного подвида, характерной для штаммов, которые предложены относить к биовару «Microtus». Установлено, что эти штаммы авирулентны для человека и не представляют какой-либо эпидемической опасности.
Пример 6
На исследование поступила чистая культура неизвестного возбудителя, выделенного из трупа песчанки, найденного в одном из очагов Монголии (проба №6).
Все шаги по проведению ПЦР-анализа с предложенным набором праймеров совпадали с тем, что проводили в Примере 1, за исключением того, что материалом для исследования была Проба №6. На первом этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 10.
| Таблица 10 | ||||
| Материал | Праймеры | |||
| 3а | vlm12for/ISrev216 | JS | CDS39 | |
| Проба №6 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pestis 1213 | + | + | - | + |
| ДНК Y.pseudotuberculosis | - | - | + | - |
| Отрицательный контроль | - | - | - | - |
Такие же данные получены в Примере 1. Проводим второй этап исследования с праймерами «traA» и «YP02258». На втором этапе ПЦР-анализа были получены результаты, представленные в таблице 11.
| Таблица 11 | ||
| Материал | Праймеры | |
| traA | YP02258 | |
| Проба №6 | - | + |
| ДНК Y.pestis 1213 | - | - |
| ДНК Y.pestis 1709 | + | + |
| Отрицательный контроль | - | - |
В пробе №6 обнаружена ДНК, характеризующаяся тем, что на 1 и 2 этапах исследования давала положительный результат с праймерами:
«3а», «vlm12for/ISrev216» - это свидетельствовало о том, что ДНК принадлежит штамму возбудителя чумы (см. таблицу 1);
«CDS39» позволило отнести выделенную культуру к дополнительному подвиду (см. таблицу 1);
«YP02258» - выявленный полноценный ген, отвечающий за способность усваивать арабинозу (положительный результат) привело к пониманию того, что культура не может быть отнесена к биовару «microtus» (см. таблицу 1).
Отрицательный результат с праймерами «traA» исключил возможность определить культуру, как выделенную из из высокогорных очагов Кавказа и относящуюся к дополнительному подвиду caucasica.
В итоге в пробе №6 выявлена культура возбудителя чумы одного из 4 дополнительных подвидов hissarica, ulegeica, altaica, talassica, но не имеющая отношения к биовару «microtus».
Следовательно, путем идентификации и внутривидовой дифференциации предложенный способ дает возможность четко разграничивать все штаммы, принадлежащие к виду Y.pestis на две группы:
1. Штаммы основного подвида эпидемически опасные и вирулентные для людей (типичные).
2. Штаммы дополнительных подвидов со сниженной эпидемической опасностью и с избирательной вирулентностью (атипичные).
Использование нового эффективного способа идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Y.pestis за счет применения комплекса более специфических праймеров («3а», «JS», «vlm12for/ISrev216») в сочетании с праймерами, тестирующими ранее не использованные последовательности («CDS39», «traA», «YP02258»), позволяет:
- идентифицировать принадлежность штаммов к видам Y.pestis и Y.pseudotuberculosis;
- выявлять штаммы с необычным устройством генома из очагов Африки, Центральной Азии, Закавказья;
- правильно оценивать эпидемическую опасность штаммов и соответственно ситуацию в природных очагах чумы для принятия мер контроля над чумой;
- корректно осуществлять выбор модельных штаммов при выяснении механизмов вирулентности для людей и при разработке способов определения этого свойства без обращения к модели людей - добровольцев;
- получать важные данные для решения актуальных вопросов таксономии и эволюции Y.pestis.
Claims (7)
1. Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Ycrsinia pestis, включающий выделение ДНК из культуры клеток и проведение тестирования с использованием набора праймеров в реакции ПЦР, отличающийся тем, что тестирование проводят в два этапа: на первом для идентификации используют набор праймеров, состоящий из праймеров «3а», «vlm12for/ISrev216», «JS», «CDS39», которые взаимодействуют с ДНК пробы, при этом синтез специфических ДНК, направляемый праймерами «3а» и «vlm12for/ISrev216» подтверждает наличие в пробе ДНК штамма возбудителя чумы, а положительный результат с праймерами «CDS39» свидетельствует о наличии в пробе ДНК штамма Y. pestis одного из дополнительных подвидов, внутривидовую дифференциацию которых осуществляют вторым этапом, путем постановки ПЦР с праймерами «traA» и «YP02258», причем полученные с каждой парой праймеров результаты оценивают как положительные при наличии амплификатов известной длины, а именно: «3а» 276 п.н., «JS» 223 п.н., «vlm12for/ISrev216» 390 п.н., «traA» 472 п.н., «CDS39» 418 п.н., «YP02258» 130 п.н., при этом отрицательными считают результаты при отсутствии амплификатов или при их наличии, но с нехарактерным числом пар нуклеотидов.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймеры «CDS39» конструируют, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и они имеют прямую и обратную нуклеотидную последовательности: «CDS39for» 5'-TTA AAG GTC TGC GAA CTG GCT C-3' и «CDS39rev» 5'-TCT GCA TTG CGA AGG TAC TGA AC-3'.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймеры «traA» конструируют, основываясь на структуре участка ДНК Fra-плазмиды из штамма Pestoides G8786, и они имеют прямую и обратную нуклеотидные последовательности: «traAfor» 5'-TGT СТА ТТА ТТА ACG CTG TAC CCG C-3' и «traArev» 5'-CAG CTG GCA GTA TGG AAA TAC CTG-3'.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявленную культуру оценивают как возбудитель атипичной чумы, относящейся к одному из дополнительных подвидов (hissarica, ulegeica, altaica, talassica), если в результате ПЦР появляются амплификаты, свидетельствующие о положительной реакции с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «CDS39», «YP02258» и отрицательным результатом с праймерами «traA» и «JS».
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявленную культуру оценивают как возбудитель атипичной чумы, относящейся к дополнительному подвиду caucasica, если в результате ПЦР появляются амплификаты, свидетельствующие о положительной реакции с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216», «CDS39», «traA» и «YP02258» и отрицательной с праймерами «JS».
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что при внутривидовой дифференциации в случае отсутствия амплификации фрагмента ДНК в 130 п.н., направляемого праймерами «YP02258» с одновременным положительным результатом с праймерами «3а», «vlm12for/ISrev216» и «CDS39», выявленную культуру оценивают как культуру возбудителя чумы, характерную для биовара «microtus».
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявленную культуру оценивают как возбудитель псевдотуберкулеза, если в результате ПЦР с помощью праймеров «JS» синтезируется амплификат длиной 223 п.н.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009116579/10A RU2404251C1 (ru) | 2009-04-29 | 2009-04-29 | Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида yersinia pestis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009116579/10A RU2404251C1 (ru) | 2009-04-29 | 2009-04-29 | Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида yersinia pestis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2404251C1 true RU2404251C1 (ru) | 2010-11-20 |
Family
ID=44058444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009116579/10A RU2404251C1 (ru) | 2009-04-29 | 2009-04-29 | Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида yersinia pestis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2404251C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496882C2 (ru) * | 2012-09-17 | 2013-10-27 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров методом полимеразной цепной реакции |
| RU2621869C1 (ru) * | 2016-11-17 | 2017-06-07 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени |
| CN110157823A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-23 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | Raa荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用 |
-
2009
- 2009-04-29 RU RU2009116579/10A patent/RU2404251C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ТРУХАЧЕВ А.Л., ЛЕБЕДЕВА С.А. Способы диагностики и дифференциации возбудителя чумы: детекция атипичных штаммов YERSINIA PESTIS молекулярно-биологическими методами (ч. 1) Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №1, 2006, с.3-6. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496882C2 (ru) * | 2012-09-17 | 2013-10-27 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров методом полимеразной цепной реакции |
| RU2621869C1 (ru) * | 2016-11-17 | 2017-06-07 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени |
| CN110157823A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-23 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | Raa荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112522429B (zh) | Rpa联合crispr技术检测炭疽杆菌的方法及成套试剂 | |
| Lee et al. | A multiplex real-time PCR for differential detection and quantification of Salmonella spp., Salmonella enterica serovar Typhimurium and Enteritidis in meats | |
| Ramisse et al. | The Ba813 chromosomal DNA sequence effectively traces the whole Bacillus anthracis community | |
| Calleros et al. | Assessing the intra-species genetic variability in the clonal pathogen Campylobacter fetus: CRISPRs are highly polymorphic DNA markers | |
| Zang et al. | Can a visual loop-mediated isothermal amplification assay stand out in different detection methods when monitoring Campylobacter jejuni from diverse sources of samples? | |
| RU2404251C1 (ru) | Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида yersinia pestis | |
| Hadjinicolaou et al. | Use of molecular beacons and multi-allelic real-time PCR for detection of and discrimination between virulent Bacillus anthracis and other Bacillus isolates | |
| JP5522820B2 (ja) | イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー | |
| US20170088882A1 (en) | Carrier for detecting foodborne-illness-causing bacteria, kit for detecting foodborne-illness-causing bacteria, method for detecting foodborne-illness-causing bacteria, and pcr reaction solution for foodborne-illness-causing bacteria | |
| CN106434935A (zh) | 鉴定猪多杀性巴氏杆菌和/或副猪嗜血杆菌组合物和方法 | |
| Afroj et al. | Simultaneous detection of multiple Salmonella serovars from milk and chicken meat by real-time PCR using unique genomic target regions | |
| CN108950043B (zh) | 一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒 | |
| RU2332464C1 (ru) | Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба | |
| RU2319962C1 (ru) | Способ диагностики онихомикоза кистей и стоп | |
| KR101846182B1 (ko) | 바실러스 세레우스, 황색포도상구균, 살모넬라균의 동시 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 | |
| Feberwee et al. | Genotyping of Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae by Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) analysis and digitalized Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) analysis | |
| RU2736649C1 (ru) | Способ генетической дифференциации штаммов Yersinia pseudotuberculosis путем молекулярно-генетического типирования | |
| Lee | Genotyping Escherichia coli isolates from duck, goose, and gull fecal samples with phylogenetic markers using multiplex polymerase chain reaction for application in microbial source tracking | |
| RU2496882C2 (ru) | Способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров методом полимеразной цепной реакции | |
| Sadiq et al. | Molecular epidemiology of zoonotic Salmonella enteritidis isolated from poultry and human sources by multi locus sequence typing | |
| KR20160069235A (ko) | 고위험 병원체 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| RU2425891C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции | |
| Kędrak-Jabłońska et al. | Evaluation of real-time PCR based on SYBR Green I fluorescent dye for detection of strains in biological samples | |
| RU2552611C2 (ru) | Способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции | |
| Berdimuratova et al. | THE USE OF MOLECULAR GENETIC METHODS BASED ON MLVA ANALYSIS TO CONFIRM THE UNIQUENESS OF COLLECTION STRAINS OF BRUCELLA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140430 |