CN110157823A

CN110157823A - Raa荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110157823A
Application number: CN201910438688.4A
Authority: CN
Inventors: 袁静; 赵向娜; 田常玉; 赵江涛; 张政
Original assignee: Chinese People's Liberation Army Center For Disease Control And Prevention
Current assignee: Chinese People's Liberation Army Center For Disease Control And Prevention
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2019-08-23

Abstract

本发明公开了一种RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。提供的引物探针组及试剂盒可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度检测生物组织样品中是否含有鼠疫耶尔森氏菌，不需要复杂仪器和专业人员，非常适合于临场快速检测，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Description

RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，具体涉及一种RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用。

背景技术

鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)是一种革兰氏阴性非芽孢杆菌，属于肠杆菌科耶尔森氏菌属。鼠疫耶尔森氏菌是人畜共患病-鼠疫的病原体，可导致腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫的发生。鼠疫耶尔森氏菌通常由蚤叮咬传播到啮齿动物和兔身上。肺鼠疫是一种严重的传染病，可通过呼吸道飞沫在人与人之间传播，并被认为在三次历史性大流行期间造成约2亿人死亡的病因。目前，亚洲、东欧、非洲和美洲都有自然鼠疫疫源地，世界卫生组织每年登记大约2000例人间鼠疫病例[Perry RD,Fetherston JD(1997)Yersiniapestis–etiologic agent of plague.Clin Microbiol Rev 10:35–66.]。鼠疫耶尔森氏菌由于易通过气溶胶在人与人之间传播、高致死性、以及作为可能造成大规模伤亡的生物战剂而被CDC归类为A类生物杀灭剂[Inglesby TV,Dennis DT,Henderson DA,Bartlett JG,Ascher MS,等(2000)Plague as a biological weapon:medical and public healthmanagement.Working Group on Civilian Biodefense.JAMA 283:2281–2290]。由于鼠疫多重耐药菌株已经从人类中分离出来，包括一株对目前用于鼠疫治疗和预防的所有药物都具有耐药性的菌株[Galimand M,Carniel E,Courvalin P(2006)Resistance of Yersiniapestis to antimicrobial agents.Antimicrob Agents Chemother 50:3233–3236.]，使得这个问题更加严重。

鼠疫耶尔森氏菌的检测常采用细菌分离和显微镜观察[Gaval SR,ShrikhandeSN,Makhija SK,Tankhiwale NS,Pathak AA,Saoji AM.Study of suspected plaguecases for isolation and identification of Yersinia pestis.Indian J MedSci.1996；50:335–338.]、噬菌体裂解试验[Nunes MP,Suassuna I.Bacteriophagespecificity in the identification of Yersinia pestis as compared withotherenterobacteria.Rev Bras Pesqui Med Biol.1978；11:359–363.]、ELISA法检测F1抗原和抗体[Chanteau S,Rahalison L,Ratsitorahina M,等.Earlydiagnosis ofbubonic plague using F1antigen capture ELISAassay and rapid immunogolddipstick.Int J Med Microbiol.2000；290:279–283.]、常规PCR检测[Hinnebusch J,Schwan TG.New method for plaguesurveillance using polymerase chain reactionto detect Yersinia pestis in fleas.J Clin Microbiol.1993；31:1511–1514.17.]、实时定量PCR检测[Higgins JA,Ezzell J,Hinnebusch BJ,Shipley M,Henchal EA,IbrahimMS.5’nuclease PCR assay to detect Yersinia pestis.JClin Microbiol.1998；36:2284–2288.]、光纤或上转换荧光技术生物传感器[Anderson GP,King KD,Cao LK,JacobyM,Ligler FS,Ezzell J.Quantifying serum antiplague antibody with a fiber-opticbiosensor.Clin Diagn Lab Immunol.1998；5:609–612.30.]等，这些方法在检测鼠疫耶尔森氏菌方面固然起着重要作用，但是这些方法具有费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高、不适于临场快速检测等问题。然而，对位于贫困地区的鼠疫疫源地进行长期监测，以预测啮齿动物未来的流行病和人类的接触风险，或对现场怀疑有生物恐怖行为的样本进行调查以及疫苗质量监控等，都需要一种简单、快速和有效的检测方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组，包括序列表中序列1所示的引物3a-F、序列2所示的引物3a-R和序列3所示的探针，其中所述探针为荧光报告基团和淬灭基团修饰的探针。

上述探针的核苷酸序列5’至3’方向的第31位碱基被荧光报告基团修饰、第33位碱基被四氢呋喃残基修饰和第35位碱基被淬灭基团修饰。

上述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5中的任一种，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse、DABCYL中的任一种。

本发明另一方面提供一种RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂盒，包括上述的引物探针组。

上述试剂盒中探针的使用浓度为0.20pM/μL-0.30pM/μL；引物3a-F和引物3a-R的使用浓度独立地为0.30pM/μL-0.50pM/μL；

上述探针的使用浓度为0.24pM/μL；引物3a-F和引物3a-R的使用浓度独立地为0.42pM/μL。

上述试剂盒还包括反应缓冲液、RAA基础荧光反应试剂、阳性质控品和阴性质控品；其中所述反应缓冲液包括：使用浓度为450mM的pH为7.6的Tris-HCl Buffer，W/V为10％的PEG10000；所述阳性质控品包含鼠疫耶尔森氏菌的基因组DNA；所述阴性质控品不包含鼠疫耶尔森氏菌的基因组DNA，优选为ddH₂O或纯化水；所述RAA基础荧光反应试剂可以为RAA基础荧光通用反应试剂，其是经过低温冷冻干燥的冻干粉，例如由江苏奇天基因生物科技有限公司提供的商品货号为F00001的基础反应单元。本领域技术人员也可以根据RAA荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为RAA基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。

上述试剂盒还包括260mM的MgAc。

上述引物探针组在制备鼠疫耶尔森氏菌RAA荧光法检测试剂中的应用也属于本发明；该应用采用上述试剂盒检测鼠疫耶尔森氏菌，包括以下步骤：

S1：提取待测样品DNA；

S2：反应体系配制：首先取探针、引物3a-F和引物3a-R加入反应缓冲液中，使得探针使用浓度为0.20pM/μL-0.30pM/μL，引物3a-F和引物3a-R的使用浓度独立地为0.30pM/μL-0.50pM/μL；取46.5μL已加入探针引物的反应缓冲液加入到已分装RAA基础荧光反应试剂的试剂管中，使其充分溶解并混匀；再向所述试剂管中加入1μL待测样品DNA为模板，最后加入2.5μL 260mM的MgAc进行混合；

S3：将试剂管放入荧光检测仪器中进行实时RAA荧光反应，其中反应条件为：反应温度38～42℃，反应时间5～20min；和

S4：结果分析：在所述反应时间之内所述荧光检测仪器检测到信号，判定为阳性，所述阳性表示待测样品中存在鼠疫耶尔森氏菌；反之，则判定为阴性，所述阴性表示待测样品中不存在鼠疫耶尔森氏菌。

上述步骤S3中所述反应温度为39℃，反应时间为20min。

上述步骤S2中所述RAA基础荧光反应试剂为RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉，每50μL反应体系加入所述RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉2μg。

基于以上技术方案提供的RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂盒和检测方法能够实现快速、临场检测，且操作简单，特异性和灵敏度均较高，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明只需在37～42℃(较佳为39℃)下反应5～20min便可获得分析结果，相对于现有技术(至少为1h)所用时间大大缩减；

2)本发明具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点，且不需要大型仪器设备和专业人员，适用于大规模的筛选；

3)本发明尤其可用于检测DNA含量较低的样品，对检测材料质量要求低，且假阳性率低；

本发明提供的试剂盒和方法对检测鼠疫耶尔森氏菌具有非常重要的意义，可用于食品行业或基层医疗卫生单位筛查和检测鼠疫耶尔森氏菌，指导临床诊疗和预后，预防鼠疫的疫苗生产质量监控等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是根据本发明的一个实施例设计的三对引物的扩增结果凝胶电泳图；

图2是根据本发明的一个实施例设计的探针的RAA荧光扩增检测结果；

图3是根据本发明的一个实施例设计的探针的RAA荧光扩增检测结果；

图4是灵敏度检测结果，其中A幅表示RAA灵敏度检测结果，B幅表示PCR灵敏度检测结果；

图5是特异性检测结果，其中A幅表示RAA的特异性检测结果，B幅表示PCR的特异性检测结果；

图6是针对不同模拟组织样品的RAA荧光检测结果。

具体实施方式

为解决现有技术中存在的检测鼠疫耶尔森氏菌的方法费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高等问题，本发明旨在利用重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA技术)提供一种可实现快速检测、且特异性和灵敏度均较高的鼠疫耶尔森氏菌检测试剂盒及其应用。

RAA是一种在恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。RAA分析可以使用荧光探针系统实时检测DNA扩增子，其扩增子的检测依赖于使用具有DT荧光团两侧的内部碱基模拟物(四氢呋喃，THF)和相应的DT淬灭基团的寡核苷酸探针。只有当探针与其互补的靶序列结合时，THF位置才被核酸外切酶III识别和切割，从而分离荧光团和淬灭剂并积累荧光信号。

基于以上原理，经过探索，本发明人设计了适用于鼠疫耶尔森氏菌检测的专用引物和探针，并基于开发的引物和探针制备了适用于快速、特异性检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂盒和检测方法，该试剂盒和方法不需要专门的或昂贵的设备和专业人员，非常适合于临场快速检测，特别是在贫困地区。

以下结合具体实施例对本发明作进一步描述。

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

在本发明中，所述荧光报告基团可以为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5等中的任一种；所述淬灭基团可以为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse、DABCYL等中的任一种。本发明对不同的荧光报告基因和淬灭基团的组合没有特殊的限定，上述荧光报告基团和淬灭基团进行的组合均可以达到相同的效果，本发明对荧光检测的仪器也没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的相应荧光检测用仪器即可。

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：鼠疫耶尔森氏菌样品DNA提取

该实施例采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，中国)，根据提取试剂盒说明书按步骤提取鼠疫耶尔森氏菌EV76(减毒活疫苗株，Cui Y,Yang X,Xiao X,Anisimov AP,Li D,Yan Y,Zhou D,Rajerison M,Carniel E,Achtman M et al:Genetic variations of liveattenuated plague vaccine strains(Yersinia pestis EV76lineage)duringlaboratory passages in different countries.Infection,genetics and evolution:journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectiousdiseases 2014,26:172-179.)的基因组DNA，具体提取方法包括以下步骤：

1.取细菌培养液1-5ml，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，尽量吸净上清。

2.向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

3.向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。

4.加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5.加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

9.重复操作步骤8。

10.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，测DNA浓度备用。

实施例2：引物设计和筛选

选择鼠疫耶尔森氏菌的特异性保守3a基因作为目标检测基因(Tsukano H,ItohK,Suzuki S,Watanabe H.Detection and identification of Yersinia pestis bypolymerase chain reaction(PCR)using multiplex primers.Microbiol Immunol.1996；40:773–775.)，该基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

以序列4所示的核苷酸序列作为引物设计靶标序列，根据以下RAA引物设计原则，利用Oligo7设计得到多组引物对，选取其中3组引物对(如表1所示)进行对比评价：

1)引物大小一般在30-35个碱基，扩增产物大小为100-200bp之间；

2)5’端(3-5bp)避免出现重复G，最好为C或T；

3)3’端(后3个碱基)最好有G和C；

4)GC含量不要大于70％或小于30％；

5)引物间避免形成二级结构、引物二聚体等。

表1：设计的三组引物对信息

利用上表1中3组引物对，以实施例1提取获得的鼠疫耶尔森氏菌EV76 DNA为模板，做RAA基础扩增(39℃条件下反应20min)，所得PCR产物用1％琼脂糖跑电泳，电泳结果如图1所示。

根据图1结果，可见引物对1和引物对3的扩增产物均有二聚体产生，因此两者均不适于作为检测鼠疫耶尔森氏菌的引物。引物对2扩增结果为单条带，且条带清晰明亮，适于作为检测鼠疫耶尔森氏菌的RAA扩增引物，因此本发明采用引物对2作为检测鼠疫耶尔森氏菌的RAA扩增引物。

实施例3：探针的设计和筛选

根据实施例2获得的引物对2作为RAA扩增引物，所得扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列9所示。

以序列9作为探针设计靶标序列，根据以下探针设计原则，设计了多条探针，从设计的探针中选择两条探针(探针1和探针2)进行对比评价：

探针1：EV76T15'-CTTAACCGAGCCTTTCCGTCCGGCAGCCGA/i6FAMdT/G/THF/C/iBHQ1dTGTTTTTCCTGCTTTT-3'，其未修饰核苷酸序列为：5'-CTTAACCGAGCCTTTCCGTCCGGCAGCCGATGACTGTTTTTCCTGCTTTT-3'(序列10)。

探针2：EV76T

5'-ACAGACACTCAAGGCGCTTAACCGAGCCTT/i6FAMdT/C/THF/G/iBHQ1dTCCGGCAGCCGATGAC-3'，其未修饰核苷酸序列为5'-ACAGACACTCAAGGCGCTTAACCGAGCCTTTCCGTCCGGCAGCCGATGAC-3'(序列3)。

分别利用上述设计的两条探针，以鼠疫耶尔森氏菌EV76 DNA(阳性)和ddH₂O(作为阴性对照)为模板做RAA荧光扩增检测，以检验探针的效果，检测结果如图2和图3所示。其中图2结果显示：探针1的阳性结果和阴性对照结果均有荧光产生；图3结果显示：探针2的阳性结果有荧光产生，而阴性对照结果没有荧光产生，对比效果明显。因此，本发明选择探针2作为检测鼠疫耶尔森氏菌的RAA荧光检测探针。

实施例4：灵敏度

该实施例以实施例1获得的鼠疫耶尔森氏菌EV76 DNA作为待测样品DNA；

将5uL 10⁵IU/uL鼠疫耶尔森氏菌DNA制成不同浓度梯度的的工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有1.0×10⁵IU/μL鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA；

工作标准品2，含有1.0×10⁴IU/μL鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA；

工作标准品3，含有1.0×10³IU/μL鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA；

工作标准品4，含有1.0×10²IU/μL鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA；

工作标准品5，含有1.0×10¹IU/μL鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA。

取46.5μL反应缓冲液(事先已将实施例2的引物对2和实施例3的探针EV76 T溶解入反应缓冲液中，其包括使用浓度为450mM的pH为7.6的Tris-HCl Buffer，W/V为10％的PEG10000，使用浓度为0.24pM/μL的探针EV76T，使用浓度分别为0.42pM/μL的上游引物3a-F和下游引物3a-R)加入到已分装冻干的RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司提供F00001，每管2μg冻干粉)的试剂管中，使其充分溶解并混匀；再分别加入已配制好的1μL工作标准品1、2、3、4、5为DNA模板，ddH₂O作为对照，最后加入2.5μL 260mM的醋酸镁，总体积为50μL。

将试剂管放入荧光检测仪器(江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪)中进行实时RAA荧光法反应，其中所述实时RAA荧光法反应条件为：反应温度为39℃，反应时间为20min。分别检测各工作标准品不同时间的荧光值。

结果分析：在所述反应时间之内所述荧光检测仪器检测是否有信号产生，显示有信号产生则判定为阳性，阳性结果代表检测到存在鼠疫耶尔森氏菌EV76 DNA；反之，则判定为阴性，阴性结果代表未检测到存在鼠疫耶尔森氏菌EV76 DNA。

同时利用工作标准品1、2、3、4、5和ddH₂O作为模板，采用现有技术中存在的鼠疫耶尔森氏菌RT-PCR检测方法(鼠疫耶尔森氏菌RT-PCR检测试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司，PCR所使用的引物如序列表中序列11和序列12所示的引物对)作为对照方法，对各标准品的PCR结果进行相对荧光强度分析。

检测结果如图4所示，其中A幅表示RAA荧光检测结果，B幅表示PCR荧光检测结果，其中1、2、3、4、5分别代表浓度为1.0×10⁵IU/μL、1.0×10⁴IU/μL、1.0×10³IU/μL、1.0×10²IU/μL、1.0×10¹IU/μL的鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA，6是阴性对照(ddH₂O)。

图4中A幅结果显示：1.0×10⁵IU/μL工作标准品和1.0×10¹IU/μL工作标准品最快2min开始有扩增，4min时所有工作标准品均有扩增，20min内就可以得到检测结果；随着检测时间的延长，所有工作标准品的荧光强度不断增强，到16min时，荧光强度开始表现出与DNA模板浓度的正比关系，DNA模板浓度越高，检测到的荧光信号越强，并且可以检测到1.0×10¹IU/μL浓度的模板，检测灵敏度高。图4中B幅结果显示：PCR检测方法只能到试验进行到一半的时候(40个循环的第20个循环，大约耗时1小时)看到浓度为1.0×10⁵IU/μL的工作标准品开始有扩增，随着时间的延长，其他工作标准品也开始有扩增，表现出DNA模板浓度越高，越早开始有扩增，但直至2个小时才能得到检测结果，检测灵敏度不高，耗时较长。

实施例5：特异性

根据实施例1中的样品DNA提取方法分别提取下表2中所示细菌的DNA(以下细菌均为申请人实验室菌库保存，本领域技术人员通过以下菌株信息均可以通过常规途径获得各菌株)：

表2.菌株及其来源

其中鼠疫耶尔森氏菌201在文献“Zhang Q,Wang Q,Tian G,Qi Z,Zhang X,Wu X,Qiu Y,Bi Y,Yang X,Xin Y et al:Yersinia pestis biovar Microtus strain 201,anavirulent strain to humans,provides protection against bubonic plague inrhesus macaques.Human vaccines&immunotherapeutics 2014,10(2):368-377.”中描述；小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC9610在文献“Kot B,Blaszczyk M:The application of PCRfingerprinting to the differentiation of Yersinia enterocolitica strainsisolated from humans and pigs.Acta microbiologica Polonica 2003,52(4):355-359.”中描述；假结核耶尔森氏菌Pa3606在文献“Zhou Y,Zhou J,Ji Y,Li L,Tan Y,TianG,Yang R,Wang X:Bioluminescent tracing of a Yersinia pestis pCD1(+)-mutantand Yersinia pseudotuberculosis in subcutaneously infected mice.MicrobesInfect 2018,20(3):166-175.”中描述；产气肠杆菌3-SP在文献“Chen Z,Li H,Feng J,LiY,Chen X,Guo X,Chen W,Wang L,Lin L,Yang H et al:NDM-1encoded by a pNDM-BJ01-like plasmid p3SP-NDM in clinical Enterobacter aerogenes.Frontiers inmicrobiology 2015,6:294.”中描述。

在每个反应体系中，取46.5μL反应缓冲液(同实施例4)加入到已分装冻干的RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉(同实施例4)的试剂管中，使其充分溶解并混匀；再分别加入已配制好的1μL上述提取的各细菌DNA、实施例1获得的鼠疫耶尔森氏菌EV76 DNA和ddH₂O为模板，再分别加入2.5μL 260mM的MgAc，总体积为50μL。

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；仪器反应条件设置为：反应温度39℃，反应时间20min。分别检测各细菌不同时间的荧光强度。

同时利用上述提取得到的各细菌DNA、实施例1获得鼠疫耶尔森氏菌EV76 DNA和ddH₂O作为模板，采用现有技术中存在的鼠疫耶尔森氏菌PCR检测方法(鼠疫耶尔森氏菌RT-PCR检测试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司，PCR所使用的引物如序列表中序列11和序列12所示的引物对)作为对照方法，对各细菌DNA的PCR结果进行相对荧光强度分析。

检测结果如图5所示，A幅表示RAA荧光检测结果，B幅表示PCR检测结果，其中1代表表鼠疫耶尔森氏菌EV76，2-30分别代表上表2中编号为2-30的细菌，31代表ddH₂O。

图5中A幅结果显示：鼠疫耶尔森氏菌EV76最快2min开始有扩增，8min内鼠疫耶尔森氏菌EV76和鼠疫耶尔森氏菌201两者均有扩增，20min内就可以得到结果，并且除了鼠疫耶尔森氏菌EV76和201有荧光信号外，其余类型细菌均没有荧光信号，说明本发明试剂盒特异性良好。图5中B幅结果显示：PCR检测方法的进程进行到一半时(40个循环的第20个循环，大约1个小时)，鼠疫耶尔森氏菌EV76开始有扩增。进行到第25个循环时，鼠疫耶尔森氏菌201开始有扩增。虽然PCR检测方法也表现出较好的特异性，但同实施例4的灵敏度试验结果一致，2个小时内才有结果，相对于本发明的试剂盒和方法耗时较长。

实施例6：不同模拟组织样品的RAA荧光检测

6.1.模拟组织样品的制作

1、将3只C57BL/6J小鼠(8周，雄性，22g)用0.2mL的10％水合氯醛麻醉后，引颈处死，取出肝脏、脾脏、肺组织和血液，每个样品分别随机分为三组，分别做如下处理：加入1mL的1.38×10⁷CFU/mL鼠疫耶尔森氏菌EV76，加入1mL的1.38×10⁵CFU/mL鼠疫耶尔森氏菌EV76，加入1mL的PBS缓冲液。

2、用组织匀浆器混匀。

6.2.提取组织样品DNA

根据实施例1中所述的样品DNA提取方法提取上述混匀的组织样品DNA。

6.3.对不同模拟组织样品进行RAA荧光检测

在每个反应体系中，取46.5μL反应缓冲液(同实施例4)加入到已分装冻干的RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉(同实施例4)的试剂管中，使其充分溶解并混匀；再分别加入1μL上述6.2提取的组织样品DNA为模板，再加入2.5μL 260mM的MgAc，总体积为50μL。随同进行阳性对照(鼠疫耶尔森氏菌EV76 DNA，1.74×10³copies)和阴性对照(ddH₂O)处理。

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；仪器反应条件设置为：反应温度39℃，反应时间20min。分别检测各组织样品以及对照在不同时间的荧光强度。

检测结果如图6所示，其中A幅表示模拟血液样品的RAA荧光检测结果，B幅表示模拟肝脏组织样品的RAA荧光检测结果，C幅表示模拟脾脏组织样品的RAA荧光检测结果，D幅表示模拟肺脏组织样品的RAA荧光检测结果。其中1代表阳性对照、2代表加入1.38×10⁷CFU鼠疫耶尔森氏菌EV76的模拟组织样品，3代表加入1.38×10⁵CFU鼠疫耶尔森氏菌EV76的模拟组织样品、4代表加入PBS的组织样品、5代表阴性对照(ddH₂O)。

图6中A幅结果显示：在阴性对照组和加入1mL PBS缓冲液的模拟血液样品组中均未检测到荧光信号，阳性对照组和加入鼠疫耶尔森氏菌EV76的模拟血液样品组中均检测到荧光信号，并且加入的鼠疫耶尔森氏菌EV76的量越多，组织样品中检测到的荧光信号越强，在20min内能得到检测结果。图6中B、C、D幅分别表示的模拟肝脏、脾脏和肺脏组织样品也均得到与图6中A幅表示的模拟血液组织样品相同的结果，表明本发明的RAA荧光检测方法可用于对多种生物样品中的鼠疫耶尔森氏菌进行检测。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心

<120> RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagatatgtg atgattaagt tcatgctgct tta 33

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacaacacgg atatgtacaa cgacattctt a 31

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acagacactc aaggcgctta accgagcctt tccgtccggc agccgatgac 50

<210> 4

<211> 2052

<212> DNA

<213> 鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)

<400> 4

gagatgcgta tttgtcgagt agctgacgta gggctgattt gttgtcttta ctgcggagtt 60

cggagagtag tttattagct attgagcgta ctgcgttgtt ggcctcagga gtcacacatt 120

cactccttcc agcaatacag ccaccagtgc gccgcacagc cgccgattcc aagcaggatc 180

cagtcaagat atgtgatgat taagttcatg ctgctttact cccagacaaa acattaggac 240

tcagccacag acactcaagg cgcttaaccg agcctttccg tccggcagcc gatgactgtt 300

tttcctgctt ttgccagcct gtaagaatgt cgttgtacat atccgtgttg tagccgctaa 360

gcactaccat cccctcaagg ttattgacgg tatcgagtag ggttaggtgg gcatcattgt 420

ccatttcatg gcggtaatat cgggatgaga taacgcgggt gtcatggacg tatggcgggt 480

caacaaaatg aagcgttgaa actgtgtcat ggtctaacat gcattggacg gcatcacgat 540

tctctaccaa aacgccctcg aatcgctggc caactgctgc caagttttca ggcatccttg 600

cccaaaggtg ttgagctgtt gccgaaccgc gtttggtatc cagccgaaaa ccagttgttc 660

ccttggtcgc gccagcagaa ccaaatccca ttgttgccct gatgactaat ttccgcgccc 720

tctcgaccat cgtttccgct tcgccgtatg catcggtaaa ttcatcgcga gagtaggggg 780

ttaaaattaa tgcctcgata aggcattcac gcagtgtcat atcgcgcaga acgaaaaaga 840

gattaaccac gtcgccatct aaatcgttat aaatctccgc gtagcttcgc tcttttctca 900

gcaatacaga cgccgcgccg gagaaagaaa atggataaaa aggtcttcgt gttatgcggt 960

gatcaataca agcgaaatgc catccagttt ataagtcaac tacctgttaa tcctgataaa 1020

ccactcctga tcacaatcca agagcgaacc cgcacattag accagaatgc gcgtctatgg 1080

gccacgcttg gcgatatcgc taaacaggtt gtatggcacg gacagaaact tagcagtgag 1140

gactggaagc acatattcac tgcatcactg aaagggcaga ggtcagcgcc agggcttgaa 1200

ggtggctttg ttgtactggg gcaatcaaca agccgcatga ccgttggcga gctgcgcgac 1260

ctgatagagc tgatcaatgc tttcggcgct acgcatggcg ttaagttcag cgatgaatca 1320

cggcttgcaa ttgagtgggc caaccggttc ggtgacaagg gaaaggtggc agcatgagtg 1380

aatctgactg gctaataatt tgcgcgttca tctgctctgt aatttatgca gggataagag 1440

ggagacgaag atgaacaagt taccaaaaaa tcgtaactgc aaagtatgca aaacgaggtt 1500

caagccagag accgtatatc agtggtggtg tgatgaagag cacaaagagg aatacataaa 1560

gcagttggca ctaaaagccc gtcaaaatag gatacagaaa acagaacagc gacggcgaga 1620

ggaaacccaa gccgaaagac gtagccttaa gatccgcaag ttagcagtaa aacccctcag 1680

ttacttcgcc aaacaagccc agcaagcttt taatgaatac atccgcactc gtgacgcggg 1740

agacgcttgc gttagctgtg gtcgattcca tgagggccag tatcacgctg ggcattacct 1800

cacggtagga gcaaatccag aattacggtt caacgaagat aattgccatc gccagtgcgc 1860

cccctgtaat aaccacctgt ctggaaacat tgaaaaatac actcccaacc tgattgcgaa 1920

aatcgggcag gttcgtttcg atattttgat ggggccgcat gaaatgacga actaccggcg 1980

tgatgactat atccgaatcc gggatgagta ccgggcaaaa accaaagcac ttaaaaaact 2040

tcgagaggct gc 2052

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgatttgttg tctttactgc ggagttcgga gag 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaagcagca tgaacttaat catcacatat ctt 33

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcatgagtga atctgactgg ctaataattt 30

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctttatgtat tcctctttgt gctcttcatc ac 32

<210> 9

<211> 167

<212> DNA

<213> 鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)

<400> 9

aagatatgtg atgattaagt tcatgctgct ttactcccag acaaaacatt aggactcagc 60

cacagacact caaggcgctt aaccgagcct ttccgtccgg cagccgatga ctgtttttcc 120

tgcttttgcc agcctgtaag aatgtcgttg tacatatccg tgttgta 167

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttaaccgag cctttccgtc cggcagccga tgactgtttt tcctgctttt 50

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actaccatcc cctcaaggtt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagggcgttt tggtagagaa 20

Claims

1.一种RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组，其特征在于，包括序列表中序列1所示的引物3a-F、序列2所示的引物3a-R和序列3所示的探针，其中所述探针为荧光报告基团和淬灭基团修饰的探针。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针的核苷酸序列5’至3’方向的第31位碱基被荧光报告基团修饰、第33位碱基被四氢呋喃残基修饰和第35位碱基被淬灭基团修饰。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5中的任一种，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse、DABCYL中的任一种。

4.一种RAA荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的引物探针组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的使用浓度为0.20pM/μL-0.30pM/μL；所述引物3a-F和引物3a-R的使用浓度独立地为0.30pM/μL-0.50pM/μL；

优选地，所述探针的使用浓度为0.24pM/μL；所述引物3a-F和引物3a-R的使用浓度独立地为0.42pM/μL。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液、RAA基础荧光反应试剂、阳性质控品和阴性质控品；其中所述反应缓冲液包括：使用浓度为450mM的pH为7.6的Tris-HCl Buffer，W/V为10％的PEG 10000；所述阳性质控品包含鼠疫耶尔森氏菌的基因组DNA；所述阴性质控品不包含鼠疫耶尔森氏菌的基因组DNA，优选为ddH₂O或纯化水。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括260mM的MgAc。

8.权利要求1至3任一所述的引物探针组在制备鼠疫耶尔森氏菌RAA荧光法检测试剂中的应用；该应用采用权利要求4-7中任一项所述的试剂盒检测鼠疫耶尔森氏菌，包括以下步骤：

S1：提取待测样品DNA；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤S3中所述反应温度为39℃，反应时间为20min。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，步骤S2中所述RAA基础荧光反应试剂为RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉，每50μL反应体系加入所述RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉2μg。