CN108103214A - Raa荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒 - Google Patents

Raa荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。本发明提供的RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组包括上游引物、下游引物和探针，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。本发明提供的试剂盒检测快速、灵敏、操作简便，对未来检测溶血性链球菌传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。

Description

RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒。
背景技术
溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。α-溶血性链球菌：菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血，这类链球菌多为条件致病菌。β-溶血性链球菌：菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，因而这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。溶血性链球菌的致病性与其产生的毒素及其侵袭性酶有关。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。
传统通用检测方法为：
样品处理:取25g固体(或25mL液体)检样加入225mL灭菌生理盐水，制成混悬液。
分离培养：吸取5mL混悬液接种至50mL葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线于血平板(如检溶血性链球菌样污染严重，可同时接种5mL至匹克氏肉汤)，36℃培养24h，接种血平板，36℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，观察在液体和固体中的培养特征、溶血情况及革兰氏染色、形态，并进行链激酶试验和杆菌肽敏感试验。
链激酶试验：吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入链球菌18-24h36℃肉浸液肉汤培养物0.5mL及0.25％氯化钙0.25mL，混匀，置于36℃水浴10min，血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。
杆菌肽敏感试验：取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片置于上述平板上，36℃培养18-24h，如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照。
虽然传统溶血性链球菌检测方法是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。
因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感且适用的溶血性链球菌检测方法，其中许多可以在48h内检出溶血性链球菌，这些方法通称为快速检测。
分子生物学方法具有灵敏度高、特异性强等优点，主要的技术有聚合酶链式反应(简称PCR)和环介导等温扩增技术。
聚合酶链式反应(简称PCR)创立于1985年，目前已成为病原微生物检测的常规技术，具有特异性强、灵敏度高等特点，但该方法对仪器要求及人员的专业素养要求高，且需要一定的硬件支持，检测时间1.5～2小时，对提取的DNA纯度要求高。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本学者Notomi T等人针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟其扩增效率可达到109～1010个数量级。但此方法设计复杂，假阳性出现高。
发明内容
本发明的目的在于提供RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒。本发明提供的试剂盒检测快速、灵敏、操作简便，对未来检测溶血性链球菌传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。
本发明提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。
优选的是，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；
优选的是，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
本发明还提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物探针组。
优选的是，所述的探针使用浓度为0.02～0.05mM。
优选的是，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立地为0.05～0.1mM。
优选的是，还包括RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。
优选的是，所述反应缓冲液包括：使用浓度为450mM的Tris-HCl Buffer、260mM的MgAc和20％W/V的PEG 10000。
优选的是，还包括：阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品；
所述阴性质控品为不含有溶血性链球菌的基因组片段的试剂；
所述阳性质控品含为溶血性链球菌的基因组DNA片段，使用浓度至少为1.0×104IU/mL；
所述临界阳性质控品为含溶血性链球菌的基因组DNA片段，使用浓度至少为1.0×103IU/mL。
本发明提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组。本发明提供的引物探针组能够实现溶血性链球菌的高特异性检测，灵敏度高且检测快速、重复性好。试验结果表明，本发明提供的引物探针组只需在39℃下反应5～20min即可分析结果，检测快速、灵敏，操作简单，通过实例验证检测准确率100％，假阳性率为0；对未来检测溶血性链球菌传播具有非常重要的意义，具有很大的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的荧光检测结果；
图2为本发明实施例2提供的荧光检测结果；
图3为本发明实施例3提供的荧光检测结果。
具体实施方式
本发明提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。
在本发明中，所述上游引物的核苷酸序列SEQ ID NO.1为5’-CAACAGTAGCAGCAGATGAGCTAACCACAACG-3’；所述下游引物的核苷酸序列SEQ ID NO.2为5’-CAACCTTGCCTTGTCCTTTGTATCCCTTGTC-3’；本发明对所述上游引物和下游引物的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行人工合成即可，如生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明所述探针为在SEQ ID No.3所示序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。在本发明中，所述探针在修饰前，即SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为5’-CTAGCTGACACAGATGCAGCACCAATGGCTAATACAGGTCCTGATGCG-3’。在本发明中，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL；本发明对不同的荧光报告基因和淬灭基团的组合没有特殊的限定，上述荧光报告基团和猝灭基团进行组合都可以达到相同的效果，本发明对荧光检测的仪器没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的相应荧光检测用仪器即可。
在本发明中，所述荧光报告基团采用FAM，且所述猝灭基团为BHQ1时，优选采用的检测仪器为检测FAM荧光的仪器，所述修饰后得到探针的序列为：
5’-CTAGCTGACACAGATGCAGCACCAATGGC/i6FAMdT//ATHF//iBHQ1dTACAGGTCCTGATGCG-3’，其中，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团，THF为四氢呋喃残基。
在本发明中，所述探针的5’端未修饰序列如SEQ ID NO.4所示：CTAGCTGACACAGATGCAGCACCAATGGCT；所述探针的3’端未修饰序列如SEQ ID NO.5所示：TACAGGTCCTGATGCG。
本发明还提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物探针组。本发明对所述引物和探针在试剂盒中的储存浓度没有特殊的限定。在本发明中，所述的探针使用浓度为0.02～0.05mM，更优选为0.04mM。在本发明中，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立地为0.05～0.1mM，更优选独立地为0.08mM。
在本发明中，所述试剂盒还包括RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。在本发明中，所述RAA基础荧光通用反应试剂优选为经过低温冷冻干燥的冻干粉；在本发明的实施例中，所述RAA基础荧光通用反应试剂的来源可以为江苏奇天基因生物科技有限公司、商品货号为F00001的市售商品。在本发明中，所述RAA基础荧光通用反应试剂也可根据RAA荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为RAA基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。本发明对所述反应缓冲液在试剂盒中的储存浓度没有特殊的限定；所述反应缓冲液包括：使用浓度为450mM的Tris-HCl Buffer、260mM的MgAc和20％W/V的PEG 10000。
在本发明中，所述试剂盒还包括：阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品；
所述阴性质控品为不含有溶血性链球菌的基因组片段的试剂或ddH2O；
所述阳性质控品含为溶血性链球菌的基因组DNA片段，使用浓度至少为1.0×104IU/mL；
所述临界阳性质控品为含溶血性链球菌的基因组DNA片段，使用浓度至少为1.0×103IU/mL。
在本发明中，所述阴性质控品为ddH2O。
本发明对所述临界阳性质控品和阳性质控品在试剂盒中的储存浓度没有特殊的限定。在本发明中，所述阳性质控品的使用浓度更优选为1.0×104～1.0×108IU/mL，最优选为1.0×105IU/mL。在本发明中，所述临界阳性质控品的使用浓度优选为1.0×102～1.0×104IU/mL，最优选为1.0×103IU/mL。
本发明对所述引物和探针的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行合成即可。
本发明所述试剂盒用于检测溶血性链球菌，所述检测的方法优选包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均，得到混合溶液；将配制好的49μL混合溶液加入到RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉中，使其充分溶解并混均；再加入已提取的1μL样品DNA为模板，总体积为50μL；
(3)将步骤(2)得到的检测体系放入检测FAM荧光检测仪器中进行实时RAA荧光法反应；
(4)在20min之内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增加，显示有扩增判定为阳性；在20min之内FAM荧光仪器信号无增加，判定为阴性。
在本发明中，所述待测样品为有可能被溶血性链球菌污染的食品或者其他介质；本发明按常规方法提取DNA，如采用市面上有销售的正品提取试剂盒提取待测样品的DNA，具体为西安天隆、QIAGEN试剂盒、天根试剂盒等，也可采用自动核酸提取仪进行DNA提取。
在本发明中，所述实时RAA荧光法反应条件优选为：30～42℃反应5～20min，更优选39℃反应20min。
下面结合具体实施例对本发明所述的RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
选择溶血性链球菌的特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得溶血性链球菌蛋白酶A基因的序列，并进行多序列比对，并从中选出一段保守序列，该序列如序列表中SEQ ID NO.6所示：
TGACAACAACAGTAGCAGCAGATGAGCTAACCACAACGAGTGAACCAACAATCACGAATCACACTCAACAACAAGCGCAACATCTCACCAATACAGAGTTGAGCTCAGCTGAATCAAAACCTCAAGACACATCACAAATCACTCTCAAGACAAATCGTGAAAAAGAGCAACCACAAGGTCTAGTCTCTGAGCCAACCACAACTGAGCTAGCTGACACAGATGCAGCACCAATGGCTAATACAGGTCCTGATGCGACTCAAAAAAGCGCTTCTTTACCGCCAGTCAATACAGATGTTCACGATTGGGTAAAAACCAAAGGAGCTTGGGACAAGGGATACAAAGGACAAGGCAAGGTTGTCG；
根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小360bp；
根据RAA技术引物及探针设计原则进行的设计，通过筛选和评价，最终确定的：
上游引物序列5’-CAACAGTAGCAGCAGATGAGCTAACCACAACG-3’；
下游引物序列5’-CAACCTTGCCTTGTCCTTTGTATCCCTTGTC-3’；
探针为：
5’-CTAGCTGACACAGATGCAGCACCAATGGC/i6FAMdT//ATHF//iBHQ1dTACAGGTCCTGATGCG-3’。
其中，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团，THF为四氢呋喃残基。
表1为引物的相关信息表
引物名称 碱基 纯化方式 引物序列(5’-3’) 序列表
AD-F 32bp HPLC CAACAGTAGCAGCAGATGAGCTAACCACAACG SEQIDNO.1
AD-R 31bp HPLC CAACCTTGCCTTGTCCTTTGTATCCCTTGTC SEQIDNO.2
表2为探针的相关信息表
表3为实施例1试剂盒组成
将5uL 1010IU/mL溶血性链球菌DNA质粒制成不同梯度的的工作标准品，分别为：
工作标准品1，含有1.0×107IU/mL溶血性链球菌的bcsp31基因重组DNA质粒。
工作标准品2，含有1.0×106IU/mL溶血性链球菌的bcsp31基因重组DNA质粒。
工作标准品3，含有1.0×105IU/mL溶血性链球菌的bcsp31基因重组DNA质粒。
工作标准品4，采用试剂盒中的阳性质控品，含有1.0×104IU/mL溶血性链球菌的bcsp31基因重组DNA质粒。
工作标准品5，采用试剂盒中的临界阳性质控品，含有1.0×103IU/mL溶血性链球菌的bcsp31基因重组DNA质粒。
工作标准品6，含有1.0×102IU/mL溶血性链球菌的bcsp31基因重组DNA质粒。
按吸取376μL反应缓冲液，加入16μL探针与引物的混合物，充分混均；吸取混均后的缓冲液49μL试剂分别加入到8个RAA基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；
在8个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。
检测结果如附图1所示。结果显示最快2分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增，灵敏度高，可以检测到1.0×102IU/mL浓度。
实施例2
引物探针与实施例1相同。
表4为实施例2试剂盒组成
样本来源及DNA提取
样本由浙江出入境检验检疫局提供，为溶血性链球菌标准菌株、食品中分离的溶血性链球菌样本培养后提取的DNA，提取好的DNA在-80℃保存备用。
取4个反应管，分别按如下操作，吸取27μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到RAA基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；
在4个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好的溶血性链球菌标准菌株DNA、1μL提取好的溶血性链球菌样本DNA、1μL阳性质控品为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。
检测结果如附图2所示。结果显示3分钟明显有扩增。
实施例3
引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。
表5为实施例3试剂盒组成
样本来源及DNA提取：
溶血性链球菌样本DNA由浙江出入境检验检疫局提供，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌样本由浙江国际旅行保健中心提供，通过加热90℃10min提取DNA，提取好的DNA在-80℃保存备用，
取5个反应管，分别按如下操作，吸取27μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到RAA基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；
在5个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好溶血性链球菌样本DNA、1μL大肠杆菌样本DNA、1μL沙门氏菌样本DNA、1μL金黄色葡萄球菌DNA为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。
检测结果如附图3所示。结果显示只有溶血性链球菌样本DNA明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。
实施例3显示本发明的试剂盒特异性好。
以上实施例说明使用本发明的利用RAA技术能够快速检测溶血性链球菌，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。本发明所提供的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中华人民共和国浙江出入境检验检疫局
江苏奇天基因生物科技有限公司
浙江国际旅行卫生保健中心（浙江出入境检验检疫局口岸门诊部）
<120> RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacagtagc agcagatgag ctaaccacaa cg 32
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaccttgcc ttgtcctttg tatcccttgt c 31
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagctgaca cagatgcagc accaatggct aatacaggtc ctgatgcg 48
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctagctgaca cagatgcagc accaatggct 30
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacaggtcct gatgcg 16
<210> 6
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgacaacaac agtagcagca gatgagctaa ccacaacgag tgaaccaaca atcacgaatc 60
acactcaaca acaagcgcaa catctcacca atacagagtt gagctcagct gaatcaaaac 120
ctcaagacac atcacaaatc actctcaaga caaatcgtga aaaagagcaa ccacaaggtc 180
tagtctctga gccaaccaca actgagctag ctgacacaga tgcagcacca atggctaata 240
caggtcctga tgcgactcaa aaaagcgctt ctttaccgcc agtcaataca gatgttcacg 300
attgggtaaa aaccaaagga gcttgggaca agggatacaa aggacaaggc aaggttgtcg 360

Claims (9)

1.RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。
3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
4.RAA荧光法检测溶血性链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任意一项所述的引物探针组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针使用浓度为0.02～0.05mM。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立地为0.05～0.1mM。
7.根据权利要求4～6任意一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括：使用浓度为450mM的Tris-HCl Buffer、260mM的MgAc和20％W/V的PEG 10000。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品；
所述阴性质控品为不含有溶血性链球菌的基因组片段的试剂；
所述阳性质控品含为溶血性链球菌的基因组DNA片段，使用浓度至少为1.0×104IU/mL；
所述临界阳性质控品为含溶血性链球菌的基因组DNA片段，使用浓度至少为1.0×103IU/mL。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109694913A (zh) * 2018-12-03 2019-04-30 江苏省血吸虫病防治研究所 一种raa荧光法检测华支睾吸虫的引物探针和试剂盒
CN110157823A (zh) * 2019-05-24 2019-08-23 中国人民解放军疾病预防控制中心 Raa荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226215A (zh) * 2011-05-20 2011-10-26 深圳市计量质量检测研究院 用于检测溶血性链球菌全族群的荧光pcr引物、探针及方法
CN106434986A (zh) * 2016-11-29 2017-02-22 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 一种溶血性链球菌含量检测方法
US20170183714A1 (en) * 2015-12-28 2017-06-29 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction (near) of streptococcus species
CN107641643A (zh) * 2017-10-27 2018-01-30 郭会清 一种快速检测纺织品中β‑溶血性链球菌的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226215A (zh) * 2011-05-20 2011-10-26 深圳市计量质量检测研究院 用于检测溶血性链球菌全族群的荧光pcr引物、探针及方法
US20170183714A1 (en) * 2015-12-28 2017-06-29 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction (near) of streptococcus species
CN106434986A (zh) * 2016-11-29 2017-02-22 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 一种溶血性链球菌含量检测方法
CN107641643A (zh) * 2017-10-27 2018-01-30 郭会清 一种快速检测纺织品中β‑溶血性链球菌的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTINA CLARKE等: "Development and performance evaluation of a recombinase polymerase amplification assay for the rapid detection of group B streptococcus", 《BMC TECHNOLOGY》 *
温加登等: "《西氏内科学 第3卷第19版》", 31 March 1995 *
王大洲等: "核酸等温扩增技术在微生物快速检测中的研究进展", 《生物技术通报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109694913A (zh) * 2018-12-03 2019-04-30 江苏省血吸虫病防治研究所 一种raa荧光法检测华支睾吸虫的引物探针和试剂盒
CN110157823A (zh) * 2019-05-24 2019-08-23 中国人民解放军疾病预防控制中心 Raa荧光法检测鼠疫耶尔森氏菌的引物探针组、试剂盒及其应用

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