CN102226215A - 用于检测溶血性链球菌全族群的荧光pcr引物、探针及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物、探针及方法，属于检验检疫领域。本发明以A、C、G群溶血性链球菌的溶血素S为靶基因位点，设计荧光PCR引物及探针，建立了用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR检测方法。本发明主要应用于溶血性链球菌的检测。

Description

用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物、探针及方法

技术领域

本发明属于检验检疫领域，尤其涉及用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物、探针及方法。

背景技术

溶血性链球菌是重要的食源性致病菌，能导致化脓、败血等症状。在日常检验中的溶血性链球菌属于常规检验项目，检测任务繁重。在溶血性链球菌引起的食品安全事件中，大部分是由A群溶血性链球菌感染引起的，但是近年来C、G群溶血性链球菌所引起的感染案例呈递增趋势。

目前，溶血性链球菌的检测方法主要依据国家标准《GB/T 4789.11-2003食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验》，以下简称为国标方法。国标方法通过革兰氏染色、观察溶血、杆菌肽敏感试验及链激酶试验对溶血性链球菌进行微生物学检验。

国标方法进行溶血性链球菌的检测需经选择性增菌、分离纯化、生化鉴定等步骤，检测周期通常需要5~7天。对于污染严重的样品，混杂了大量环境细菌，而在培养过程中，由于目前的增菌液并非很好的选择性培养基，导致一些非目标菌的大量繁殖，增加了目标菌的分离纯化难度，若是检验人员没有足够丰富的工作经验则容易导致漏检。对于一些复杂样品（如食品），不同的加工工艺导致了其内在成分差异很大，例如含糖量、pH值、含盐量等，其自身的这些复杂情况可能会改变培养基的成分、pH值、盐分等，从而干扰细菌的培养，可能导致漏检。

因此，现有的国标方法存在检测周期长，检测步骤繁琐，对检验人员的经验要求较高，容易导致漏检的缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题（检测周期长，检测步骤繁琐，对检验人员的经验要求较高，容易导致漏检），本发明提供用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物、探针及方法。

本发明以A、C、G群溶血性链球菌的溶血素S为靶基因位点，通过在NCBI数据库中下载溶血素S的靶基因序列进行序列比对，找到了保守于A、C、G群溶血性链球菌中的序列，根据该序列设计荧光PCR引物和探针。

一个方面，本发明提供用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，引物和探针的核苷酸序列为：

正向引物P1：5’-GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3’（SEQ ID NO：1）；

反向引物P2：5’-AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA -3’（SEQ ID NO：2）；

探针：5’-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3’ （SEQ ID NO：3）；

该探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET或JOE；所述荧光淬灭基团为TAMRA。

作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、CY3、CY5、ROX、TAMRA或Texas Red；所述荧光淬灭基团为BHQ。

作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA或ROX；所述荧光淬灭基团为ECLIPSE。

另一方面，本发明提供一种用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

A）DNA模板的制备；

B）配制含有如权利要求1至4中任一项所述引物和探针的反应体系，对DNA模板进行PCR扩增，在ABI7500荧光定量PCR仪上的运行条件为：95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 34s，40个循环，每个循环结束后收集荧光信号；

C）反应结束后，读取并记录扩增循环数（Ct），根据扩增循环数进行检测结果的判断。

探针荧光基团标记在探针的 5’端，而淬灭基团则在 3’端。当完整的探针与目标序列配对时，5’端发光基团因与 3’端的淬灭基团接近，其发射的荧光被淬灭。当PCR反应到延伸步骤时，DNA聚合酶的 5’外切酶活性将探针酶切断裂，使发光基团与淬灭基团分离，从而使发光基团发出荧光信号。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

Ct值（cycle threshold，Ct）的定义为：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照和空白对照的荧光值处，因此可以很好的去除反应管荧光值即背景。

检测结果的判定标准为：Ct值≤35时，可判定检测结果为阳性；Ct值≥40时，可判定检测结果为阴性；35<Ct值<40时，需适当增加模板量重复扩增，如果得到Ct值≥40，则可判定检测结果为阴性，否则判定检测结果为阳性。

与现有技术相比，本发明的有益效果有：

1）特异性强：本发明摒弃了以往研究中采用的溶血素O、链激酶、M蛋白等常用靶基因位点，以A、C、G群溶血性链球菌的溶血素S为靶基因位点，通过在NCBI数据库中下载溶血素S的靶基因序列进行序列比对，找到了保守于A、C、G群溶血性链球菌中的序列，根据该序列设计荧光PCR引物及探针，因此能够对A、C、G群溶血性链球菌进行特异的检验；

2）检测范围广：可同时对A、C、G群溶血性链球菌进行检验，可防止漏检；

3）灵敏度高：增菌18h，可在含有初始浓度为3 CFU/mL的样品增菌液检出A群溶血性链球菌，可在含有初始浓度为2 CFU/mL的样品增菌液检出G群溶血性链球菌，可在含有初始浓度为50 CFU/mL的样品增菌液检出C群溶血性链球菌；

4）检测效率高：检测周期由国标方法的5~7天缩短为增菌18h后经历1h左右的PCR反应程序，检测时间短，且可同时检测96个样品，检测量大；

5）操作简单且结果直接客观：操作步骤简单，自动化程度高，Ct值为仪器自动生成，结果直接客观，对操作人员的经验要求不高；

6）安全性好：由于操作时所处理的菌需经过水煮法制备DNA，因此操作人员可避免直接接触高浓度的活菌，对操作人员有一定的保护性。

附图说明

图1 荧光PCR检测溶血性链球菌的特异性。

图2 荧光PCR检测样品的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1 引物和探针的设计和合成。

具有乙型溶血特征的链球菌主要为A、B、C、G群链球菌，而具有链激酶阳性特征的链球菌为A、C、G群链球菌，对于具有杆菌肽阳性特征的链球菌为哪几群则未在文献中发现相关报道，因此开展杆菌肽敏感实验。

结果如表1所示，杆菌肽纸片抑菌圈直径大于10mm判定为杆菌肽敏感即杆菌肽敏感实验阳性，用+表示；杆菌肽纸片抑菌圈小于等于10mm判定为杆菌肽耐药即杆菌肽敏感实验阴性，用-表示。结果表明同时具有杆菌肽实验阳性和乙型溶血特征的菌株为A、C、G群溶血性链球菌。

因此，我们可以认为国家标准《GB/T 4789.11-2003食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验》中定义的溶血性链球菌包括A、C、G群链球菌。乙型溶血是链球菌致病的重要因素，在链球菌中存在三种溶血素，即溶血素O、溶血素S和溶血素β-h/c。其中，溶血素O具有抗原性，但对氧不稳定；溶血素β-h/c是导致B群溶血性链球菌乙型溶血特征的主要因素；而溶血素S（Streptolysin S，SLS）不具有抗原性，但对氧稳定，是导致A、C、G群溶血性链球菌乙型溶血特征的主要因素，特异存在于A、C、G群溶血性链球菌中。溶血素S（Streptolysin S，SLS）由30个氨基酸组成，其分子量为2.8KDa，由SagA、SagB、SagC、SagD、SagE、SagF、SagG、SagH、SagI共9个基因协同表达的，其中SagA为结构基因，而SagB~SagI为调控基因。

本发明通过在NCBI数据库中下载A、C、G群溶血性链球菌全基因组序列，并在全基因组序列中找到了溶血素S的靶基因序列，采用CLUSTAL X软件对溶血素S的靶基因序列进行序列比对，在SagA基因中找到了一段仅保守于A、C、G群溶血性链球菌的特异性序列，共71bp。全基因组序列在GenBank中的编号为 A群：NC_004070.1；C群：NC_011134.1；G群：NC_012891.1。A群的靶基因序列为：AGCTACTAGTGTAGCTGAAA

CAACTCAAGTTGCTCCTGGAGGCTGCTGTTGCTGCTGTACTACTTGTTGCT（SEQ ID NO：4）；C群的靶基因序列为：AGCTACTAGCGTAGCAGAAACAACTCAAGTCGCTCCT

GGTGGTTGCTGTTGTTGCTGTTCTAGTTGTTGCT（SEQ ID NO：5）；G群的靶基因序列为：AGCTACTAGTGTAGCTGAAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGGCTGCTGCTGCTGCT

GTACTACATGTTGCT（SEQ ID NO：6）；若用兼并碱基代替序列突变点则可将序列归结为：AGCTACTAGYGTAGCWGAAACAACTCAAGTTGCTCCTGGWGGYTGCTGTTGYTGC

TGTWCTASWTGTTGCT，其中，Y代表T或C；W代表A或T；S代表C或G。

根据上述特异性序列设计荧光PCR引物及探针，正向引物P1的核苷酸序列为：5’-GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3’（SEQ ID NO：1）；反向引物P2的核苷酸序列为：5’-AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA-3’（SEQ ID NO：2）；探针的核苷酸序列为：5’-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3’（SEQ ID NO：3），该探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。将引物和探针的序列输入NCBI 数据库进行特异性搜索，搜索结果高度保守于A、C、G群溶血性链球菌。引物和探针为手动设计，采用Primer Premier 5.0软件对引物和探针是否产生发夹结构和二聚体以及错配率进行评估，并将引物和探针序列发往上海生工生物工程有限公司合成。

本发明的荧光报告基团可以选自FAM、HEX、TET或JOE，对应的荧光淬灭基团为TAMRA。本发明的荧光报告基团可以选自FAM、HEX、TET、JOE、CY3、CY5、ROX、TAMRA或Texas Red，对应的荧光淬灭基团为BHQ。本发明的荧光报告基团可以选自FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA或ROX，对应的荧光淬灭基团为ECLIPSE。

实施例2 荧光PCR检测方法。

生物安全柜中进行无菌操作。

样品处理：于P2级洁净室中按GB/T 4789.11-2003要求进行样品稀释及增菌，样品增菌液置于37℃培养箱中培养18h。

DNA模板：取1mL增菌液于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，去除上清液，收集菌体。加入100μL灭菌超纯水，混匀，100℃沸水中水浴10min。12000rpm离心10min，取上清液作为反应模板。

反应体系：正向引物（20μmol/L），0.4μL；反向引物（20μmol/L），0.4μL；探针（20μmol/L），0.2μL；Premix Ex Taq（2×），10μL；DNA模板，5uL；加灭菌超纯水补足反应体系至20μL。探针的5’端标记有荧光报告基团JOE，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ。Premix Ex Taq购自TaKaRa公司，产品编号为DRR039A。

反应条件：将样品管放入ABI7500荧光定量PCR仪中，运行条件为：95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 34s，40个循环，每个循环结束后收集荧光信号。

检测结果：反应结束后，仪器自动给出Ct值，根据Ct值进行检测结果的判定。检测结果的判定标准为：Ct值≤35时，可判定检测结果为阳性；Ct值≥40时，可判定检测结果为阴性；35<Ct值<40时，需适当增加模板量重复扩增，如果得到Ct值≥40，则可判定检测结果为阴性，否则判定检测结果为阳性。

实施例3 荧光PCR检测溶血性链球菌的特异性。

根据本发明提供的荧光PCR引物、探针及方法，对35种常见食源性致病菌（表2）进行扩增，以分析荧光PCR检测方法的特异性。酿脓链球菌（序号1）、马链球菌兽瘟亚种（序号4）、停乳链球菌似马亚种（序号5）及马腺疫链球菌（序号6）按GB/T 4789.11-2003验证为溶血性链球菌。以酿脓链球菌（序号1）、马链球菌兽瘟亚种（序号4）、停乳链球菌似马亚种（序号5）及马腺疫链球菌（序号6）为阳性对照；以粪链球菌（序号2）、乳房链球菌（序号3）及牛链球菌兰氏D群（序号7）等为阴性对照，灭菌超纯水为空白对照，各试验组均设置两个平行。

CMCC是中国医学微生物菌种保藏管理中心的缩写，ATCC是美国典型菌种保藏中心的缩写，CGMCC是中国普通微生物菌种保藏中心的缩写，CICC是中国工业微生物菌种保藏管理中心的缩写。

实验结果如图1所示，横坐标为Cycle Number，纵坐标为Delta Rn。除标注序号为1（酿浓链球菌）、4（马链球菌兽瘟亚种）、5（停乳链球菌似马亚种）、6（马腺疫链球菌）的阳性对照外，其余菌种未出现典型的扩增曲线，说明本发明提供的荧光PCR检测方法具有良好的特异性。

实施例4 荧光PCR检测溶血性链球菌的灵敏度。

菌悬液制备：使用5mL 0.85%生理盐水，调至0.5个麦氏单位，与标准0.5个麦氏单位比浊管对比，分别制成约有10⁸ CFU/mL的A、C、G群原菌液；吸取1mL上述原菌液至

9mL 0.85%生理盐水中，稀释10倍，混匀，依此类推，通过梯度稀释，制备为原菌液的10^-1~10^-8稀释梯度的菌悬液；分别取10^-4、10^-5、10^-6稀释梯度的菌悬液100μL涂布血平板各两个，37℃培养24h，进行菌落计数，结果按照GB4789.2-2010进行计算，并得出原菌液中实际含菌量。CFU为菌落形成单位的英文缩写。

原菌液实际含菌量：酿脓链球菌（A群）为3.05×10⁷ CFU/mL；马腺疫链球菌（C群）为4.95×10⁸ CFU/mL；停乳链球菌似马亚种（G群）为2.38×10⁷ CFU/mL。

样品设置：按照GB/T4789.11-2003中的方法对牛奶样品进行检验，确认无致病菌检出后作为模拟污染源。

污染实验设置：

1．取25mL牛奶样品至225mL灭菌超纯水中，混匀；

2．分别从10^-1~10^-8稀释梯度的A、C、G群菌悬液中，取 1mL该菌悬液和9mL稀释后的牛奶样品混匀，得样品稀释液，设置两个平行；

3．取1mL上述样品稀释液于9mL单料葡萄糖肉浸液肉汤培养基中，37℃培养增菌；

4．分别在0h、4h、8h、18h时取出并吸取1mL增菌液，12000rpm离心10min，用灭菌去离子水100μL洗涤两次；

5．加入100μL灭菌去离子水，于100℃沸水中水浴10min；

6．冷却至室温后12000rpm离心10min；

7．取5μL离心后的上清液作为PCR模板；

8．进行荧光PCR反应，若结果Ct值大于等于40则为阴性，视为未检出（-）。

实验结果：如表3所示。

从表3可以看出：增菌18h，可在含有3 CFU/mL的样品增菌液检出A群溶血性链球菌，可在含有2 CFU/mL的样品增菌液检出G群溶血性链球菌，可在含有50 CFU/mL的样品增菌液检出C群溶血性链球菌。因此，本发明提供的荧光PCR检测方法检测范围广，灵敏度高。

实施例5 荧光PCR法进行样品的检测。

采集食品样品37份和餐具样品40份，每个样品设置两个平行，如实施例2所示进行样品的处理，DNA模板的制备，反应体系的建立，进行荧光PCR检测。以 A群溶血性链球菌（酿脓链球菌）为阳性对照，以大肠杆菌为阴性对照，以灭菌超纯水为空白对照，根据Ct值进行检测结果的判断。

检测结果如表4所示，未检测出阳性样品，与国标方法检测结果一致。因此，本发明提供的荧光PCR检测方法具有很好的适用性。

图2为40份餐具样品的扩增曲线图，除阳性对照外，未出现典型的扩增曲线。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  深圳市计量质量检测研究院

 

<120>  用于检测溶血性链球菌的PCR引物、探针及方法

 

<130>  2011

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gctactagtg tagctgaaac aa                                              22

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

agcaacaagt agtacagcag ca                                              22

 

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

aaacaactca agttgctcct ggagg                                           25

 

 

<210>  4

<211>  71

<212>  DNA

<213>  酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）

 

<400>  4

agctactagt gtagctgaaa caactcaagt tgctcctgga ggctgctgtt gctgctgtac     60

 

tacttgttgc t                                                          71

 

 

<210>  5

<211>  71

<212>  DNA

<213>  马链球菌亚种（Streptococcus equi subsp）

 

<400>  5

agctactagc gtagcagaaa caactcaagt cgctcctggt ggttgctgtt gttgctgttc     60

 

tagttgttgc t                                                          71

 

 

<210>  6

<211>  71

<212>  DNA

<213>  停乳链球菌亚种（Streptococcus dysgalactiae subsp）

 

<400>  6

agctactagt gtagctgaaa caactcaagt tgctcctgga ggctgctgct gctgctgtac     60

 

tacatgttgc t                                                          71

Claims (5)

1.用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，其特征在于：引物和探针的核苷酸序列为：

      引物P1：5’-GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3’；

      引物P2：5’-AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA-3’；

      探针：5’-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3’；

      该探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，其特征在于：所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET或JOE；所述荧光淬灭基团为TAMRA。

3.根据权利要求1所述的用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，其特征在于：所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、CY3、CY5、ROX、TAMRA或Texas Red；所述荧光淬灭基团为BHQ。

4.根据权利要求1所述的用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，其特征在于：所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA或ROX；所述荧光淬灭基团为ECLIPSE。

5.一种用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

A）DNA模板的制备；

B）配制含有如权利要求1至4中任一项所述引物和探针的反应体系，对DNA模板进行PCR扩增，运行条件为：95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 34s，40个循环，每个循环结束后收集荧光信号；

C）反应结束后，读取并记录扩增循环数（Ct），根据扩增循环数进行检测结果的判断。

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