CN102994633B

CN102994633B - 一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体、互补序列及非诊断检测方法

Info

Publication number: CN102994633B
Application number: CN201210408827.7A
Authority: CN
Inventors: 彭新凯; 李乐; 聂静苑; 钟菲菲; 刘子音; 黄亮; 杨丽霞; 夏立新
Original assignee: HUNAN FOOD SAFETY PRODUCTION ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Current assignee: HUNAN FOOD SAFETY PRODUCTION ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-10-12
Also published as: CN102994633A

Abstract

本发明涉及一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体、互补序列及非诊断检测方法，本发明属于临床检验领域及食品检测领域，本发明设计了连接有FAM荧光信号的与溶血性链球菌特异性结合的核酸适体，及与其互补的寡核苷酸序列，建立了用于检测溶血性链球菌的以胶体金淬灭荧光为基础的核酸适体生物传感器非诊断检测方法，本发明主要用于溶血性链球菌的快速检测，具有特异性强、灵敏度高、检测效率高、操作简单且安全性高的优点。

Description

一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体、互补序列及非诊断检测方法

技术领域

本发明属于临床检验领域、食品检测领域，具体涉及一种以胶体金的荧光淬灭为基础的核酸适体、互补序列及溶血性链球菌的非诊断检测方法。

背景技术

溶血性链球菌呈球形或椭圆形，直径0.6-1.0μm，呈链状排列，长短不一，从4-8个至20-30个菌细胞组成不等，链的长短与细菌的种类及生长环境有关。该菌不形成芽胞，无鞭毛，易被普通的碱性染料着色，革兰氏阳性，老龄培养或被中性粒细胞吞噬后，转为革兰氏阴性。

该菌为需氧或兼性厌氧菌，营养要求较高，普通培养基上生长不良，需补充血清、血液、腹水，大多数菌株需核黄素、维生素B6、烟酸等生长因子。最适生长温度为37℃，在20-42℃能生长，最适pH为7.4-7.6。在血清肉汤中易成长链，管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径0.5-0.75mm的细小菌落，不同菌株溶血程度不一。

溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。

溶血性链球菌是一种常见的病原微生物，可引起食物中毒与临床感染，感染人体可导致新生儿败血症、脑膜炎、肺炎等多种严重感染性疾病，甚至死亡。溶血性链球菌感染具有传染源广，危害大等特点，同时该菌的自然来源较广。其相关检测技术较繁琐，检测周期长，按照国家食品微生物检测标准GB4789程序培养检测需要3天时间，同时仪器设备硬件要求高。随着分子生物学的发展，现在已建立了以PCR为基础的多项检测技术如免疫PCR、实时定量PCR、多重PCR，及以抗原检测为主的免疫学检测法。针对溶血性链球菌scpA基因设计特异性LAMP扩增引物，进行等温扩增，能有效地检出致病性溶血性链球菌。这些检测方法快捷、灵敏，准确度较高。但是，这些针对单一族溶血性链球菌的现代检测方法均需一定的设备和技术要求，且试剂费用较贵，难以推广普及。因此，建立溶血性链球菌特别是致病性菌株的准确快速检测对于控制该类细菌引起的食物中毒具有重要意义因此进一步探索该菌的快速、灵敏的检测方法对食品中该菌的污染监测、该菌的疾病诊断和流行病学调查显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供以胶体金淬灭荧光为基础的一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体、互补序列及非诊断检测方法，本发明的方法能快速、特异、灵敏地检测溶血性链球菌。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体及其互补序列，核酸适体的序列命名为序列A，互补序列命名为序列B，具体序列如下：

序列A：5’-CAGATGCACACGCTGAAGAAA

CTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG-3’；

序列B：5’-CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA-SH3’；

其中序列A的5’端有荧光报告基团。

进一步的，所述的荧光报告基团为FAM。

本发明还提供了一种用于检测溶血性链球菌的非诊断检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)采用常规方法制备纳米金颗粒；

2)纳米金颗粒与互补序列反应，形成互补寡核苷酸的纳米金颗粒覆盖体；

3))将步骤2制备的互补寡核苷酸的纳米金颗粒覆盖体，与权利要1或2所述的核酸适体反应，覆盖体上的纳米金颗粒猝灭核酸适体上的荧光报告基团发出的荧光信号；

4)在步骤3的反应体系中，加入溶血性链球菌，溶血性链球菌与核酸适体特异性结合，使其与覆盖有纳米金颗粒的互补寡核苷酸分离，释放出的核酸适体标记的荧光基团使荧光信号重新恢复。

用荧光分光光度计测量荧光信号强度以检测溶血性链球菌的量，其最低检测限为33CFU／ml。

本发明采用纳米金颗粒与核酸适体序列结合快速检测溶血性链球菌的原理：利用与溶血性链球菌特异性结合的单链DNA核酸适体既可以与靶蛋白特异结合又能与互补寡聚核苷酸形成双链的特点，利用纳米金颗粒猝灭荧光染料的特点，通过将溶血性链球菌引入到体系中后荧光信号的改变，用荧光分光光度计测量荧光信号强度来实现对溶血性链球菌的分析。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)特异性强：本发明寻找并合成了与溶血性链球菌特异性结合的带有荧光报告基团FAM的核酸适体。并用阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为对照菌株。此核酸适体仅与溶血性链球菌有高特异性结合，与其他对照菌株结合较弱。因此能对溶血性链球菌进行特异性检测。

2)灵敏度高：最低检测限为33cfu／ml。

3)检测效率高：检测周期由国标方法(GB4788.11-2003)的3天缩短为增菌24h后历经30min左右孵育反应，检测时间短，且可同时检测多个样品，检测量大。

4)操作简单：操作步骤简单，结果直接客观，对操作人员要求不高。

5)安全性高：不需用到有毒害的试剂，对操作人员有一定的保护性。

附图说明

图1纳米金颗粒的透射电镜照片。

图2溶血性链球菌和标记荧光的核酸适体结合激发荧光光谱。

图3不同浓度溶血性链球菌与标记荧光的核酸适体结合激发荧光光谱。

图4不同细菌与标记荧光的核酸适体结合激发荧光光谱。

图5以Log₁₀[溶血性链球菌浓度]为X轴，最大荧光强度为Y轴绘制的校正曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一

1、实验材料

1.1荧光分光光度计测量(日本日立公司F7000)；透射电子显微镜(JEM-1230，JEOL，Japan)；pH计(上海REX仪器厂)

1.2培养基：脑心浸液肉汤、血平板由广东环凯微生物科技有限公司生产。

1.3菌种：溶血性链球菌[CMCC(B)32210]、金黄色葡萄球菌[ATCC6538]、沙门氏菌[CMCC(B)50115]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、阪崎杆菌[ATCC29004]。

2、合成了一条能与溶血性链球菌特异性结合的标记了FAM的核酸适体序列；同时合成了一条DNA靶序列的互补序列。

3、样品处理：生物安全柜中按GB4789.11-2003要求进行样品稀释及增菌，样品增菌液于37℃培养箱中培养24h.

4、使用的阳性对照菌株为β-溶血溶血性链球菌，阴性对照菌株为阪崎杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。将上述菌种分别接于脑心浸液肉汤培养基中，36℃培养24h。取β-溶血溶血性链球菌培养液1ml，进行10倍比稀释，得到10⁰-10⁸系列稀释度的菌悬液，分别从不同稀释度的菌悬液中取1ml，涂布于血平板，计算菌液的密度。剩下的培养液10000rpm，离心10min。其他的阴性菌株也按上述方法培养，离心，但不做计数。

5、合成纳米金颗粒

柠檬酸钠(38.8mM；50毫升)迅速添加到沸腾的氯金酸(1毫米，250毫升)。不停地搅拌煮沸15分钟。在5分钟内溶液的颜色从浅黄色变成深红色，让其冷却至室温。制备的纳米金颗粒存放在4℃。通过透射电子显微镜检测纳米金颗粒的浓度。透射电镜拍摄纳米金颗粒，纳米金颗粒的平均直径为17.94±0.1nm，结果见图1。

6、将纳米金颗粒与互补的寡核苷酸反应

0.5OD巯基化的DNA适体加入1ml10nM的的纳米金颗粒。16小时后，将2M NaCl溶液慢慢加入混合物，放置8h；随后加入0.2M NaCl，放置8h；再加入0.1M NaCl，放置8h；最后，用0.3M NaCl对混合液进行处理。将经过上述的盐化处理过程的溶液12000rpm离心15min，用0.3M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)将红色沉淀洗三遍。最后用0.3M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)将胶体重悬，将固定好的覆盖了纳米金颗粒的寡核苷酸放在4℃备用。

将1μM靶DNA加到上述溶液中。混合物杂交过夜后12000rpm离心15分钟。最后红色沉淀重悬于在0.3M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH值7.0)缓冲液中。

7、溶血性链球菌的测定

PBS缓冲液(2M NaCl和10mM磷酸盐(pH：7.0)；0.3M NaCl和10mM磷酸盐(pH值7.0)；10mM磷酸盐(pH值7.0))将60μL的核酸适体覆盖的纳米探针与不同浓度溶血性链球菌混合。然后在25℃室温下孵育30分钟，最后，用荧光分光光度计测量。本发明采用的方法检测周期由国标方法(GB4788.11-2003)的3天缩短为增菌24h后历经30min左右孵育反应，检测时间短，检测效率高，且可同时检测多个样品，检测量大。

8、荧光测定

在FAM的最大吸收波长(490nm)下，当FAM标记的核酸适体存在时，能观察到显著的荧光发射强度(图2)。与纳米金反应后，荧光信号被猝灭。然而，在515nm下存在10⁸CFU／ml溶血性链球菌的荧光强度是不含溶血性链球菌荧光强度的2.5倍，因此本发明提供的方法特异性强。观察到的荧光猝灭现象很大程度取决于纳米金颗粒的超高的猝灭荧光的能力。当溶血性链球菌的浓度从10²CFU／mL到10⁷CFU／mL，在515nm波长下，荧光信号逐渐增加。

9、检测限

以Log₁₀[溶血性链球菌浓度]为X轴，最大荧光强度为Y轴绘制校正曲线。检测溶血性链球菌线性范围在4.9×10⁴-4.9×10⁷CFU／mL，以最低值计算检出限33CFU／mL(根据IUPAC定义(CDL=3Sb／m))，因此本发明提供的的方法灵敏度高。

本发明适用于医疗、生物技术、环保、食品饮料、奶制品、酿酒、水务处理等各领域，广泛应用于医疗保健食品工业、制药、生物研究等领域的溶血性链球菌的检测。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体及其互补序列，其特征在于：核酸适体的序列命名为序列A，互补序列命名为序列B，具体序列如下：

序列A：5’-CAGATGCACACGCTGAAGAAA

CTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG-3’；

序列B：5’-CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA-SH3’；

其中序列A的5’端标记有荧光报告基团。

2.根据权利要求1所述的核酸适体及其互补序列，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM。

3.一种用于检测溶血性链球菌的非诊断检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)采用常规方法制备纳米金颗粒；

2)纳米金颗粒与权利要求1或2所述的互补序列反应，形成互补寡核苷酸的纳米金颗粒覆盖体；

3)将步骤2制备的互补寡核苷酸的纳米金颗粒覆盖体，与权利要1或2所述的核酸适体反应，覆盖体上的纳米金颗粒猝灭核酸适体上的荧光报告基团发出的荧光信号；

4)在步骤3的反应体系中，加入溶血性链球菌，溶血性链球菌与核酸适体特异性结合，使其与覆盖有纳米金颗粒的互补寡核苷酸分离，释放出的核酸适体标记的荧光报告基团使荧光信号重新恢复。

4.根据权利要求3所述的一种用于检测溶血性链球菌的非诊断检测方法，其特征在于所述的荧光信号是用荧光分光光度计测量的，其最低检测限为33CFU／ml。

5.根据权利要求3或4所述的一种用于检测溶血性链球菌的非诊断检测方法，其特征在于：所述的溶血性链球菌为β-溶血性链球菌。