CN116790451B - 鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测用抗原、试剂盒及其制备方法 - Google Patents

鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测用抗原、试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测用抗原、试剂盒及其制备方法，沙门氏菌菌株保藏编号为：CGMCC No.26462，抗原的制备方法为：将鸭源肠炎沙门氏菌制成种子菌液，再接种相应培养基扩大培养，离心沉淀，重悬，加入质量分数为3％的结晶紫溶液染色，配制成10亿CFU/mL，均质后分装获得微量凝集抗原。应用该抗原建立了检测鸭源肠炎沙门氏菌抗体的微量凝集实验方法，开发出中试产品“鸭源肠炎沙门氏菌微量凝集试验抗体检测试剂盒”，经相关单位试用，效果良好。本发明工艺方法简单合理，成本低，稳定性好，制备的抗原具有敏感性高，特异性好，检测样品温度兼容性强，凝集效果易于观察等优点，临床可用于鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测，适合基层兽医快速诊断。

Description

鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测用抗原、试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于兽医检测技术领域，具体为鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测用抗原、试剂盒及其制备方法。
背景技术
沙门氏菌（Salmonella)是一种较为常见的，能引起人和动物发病的人畜共患病原菌。沙门氏菌有多种血清型，其中对人和家禽危害较大的，主要包含鼠伤寒、鸡白痢、鸡伤寒、肠炎沙门菌等。肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis) 是引发人类食物中毒以及动物疾病的重要食源性病原菌之一，是全球禽类养殖过程中最常见的菌株，也是与人类沙门菌病相关的最常见血清型。有资料统计，我国70%−80%的细菌性食物中毒事件是由沙门菌引起的，而引起沙门菌中毒的食品中，禽类产品是最常见的传播媒介，养殖与生产中鸭的沙门菌污染率为29.9%远远高于鸡的5.6%或其他禽类的8.6%。
沙门氏菌的常规检测方法有病原形态学观察、培养特性鉴定、生化特性鉴定、血清学检测和核酸检测。核酸检测虽然具有灵敏度高、特异性强、可定量检查等优点，但其对设备和操作人员要求较高，并需要配套相关耗材和试剂，不利于在基层大规模推广应用。血清学检测最为常用，ELISA检测高效、灵敏、特异和直观，可用于大规模检测，但需要昂贵的仪器和试剂，检测成本高，对操作人员技术要求较高，不适合基层用；针对鸡白痢、鸡伤寒的多价染色平板凝集试验抗原，由于其操作简便，广泛应用于基层兽医快速诊断及种鸡场沙门氏菌净化检测，但由于该方法的结果判定与判读人员经验有关，容易受到人为因素干扰，同时当检测样本温度过低时，容易产生假阴性，不同批次间检测结果差异较大，造成检测结果的不稳定。
目前尚无适合养鸭场等临床一线快速批量检测用的肠炎沙门氏菌微量凝集抗原。微量凝集试验用于沙门氏菌的检测，具有操作简便，结果直观易于判读等特点，可以达到大规模检测血清的目的。通过文献检索尚未发现鸭源肠炎沙门氏菌微量凝集抗原制备及检测方法的相关研究报道，为了基层兽医工作人员或养鸭场能快速诊断本病，以便迅速制定防控措施，建立一种快速检测肠炎沙门菌的微量凝集抗原十分必要。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测用抗原、试剂盒及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一株鸭源肠炎沙门氏菌菌株，鸭源肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）菌株已于2023年01月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保护中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，菌株保藏编号为：CGMCCNo.26462。
一种鸭源肠炎沙门氏菌抗原，由保藏编号为CGMCC No.26462的鸭源肠炎沙门氏菌制成。
一种鸭源肠炎沙门氏菌抗原的制备方法，包含以下步骤：
S1，取冻干保存的鸭源肠炎沙门氏菌菌种，画线接种于普通琼脂平板，37℃培养24h，选择典型的光滑型菌落，接种于马丁肉汤液体培养基，置37℃培养 24h，经肉眼及显微镜检，选取纯粹的菌液作为菌种，接种于硫代硫酸钠琼脂扁瓶固体培养基，每瓶5mL，摇晃均匀，置37℃培养24h，逐瓶用肉眼检查，弃去污染杂菌者；
S2，吸弃扁瓶中凝集水，每瓶加入缓冲液A 30mL，缓冲液A为：含0.5%石碳酸溶液的pH值为7.2的磷酸盐缓冲盐水，洗下培养物，收集于带玻璃珠的玻瓶中，经振荡打碎菌块，置37℃灭活24h，期间振荡数次，作无菌检验，获得菌液，用灭菌的4层纱布漏斗滤过菌液于大玻璃瓶中，加入2倍量体积分数为95%的乙醇沉淀3日以上，弃去上清，下沉物8000rpm/min离心10min后弃上清，离心沉淀物加缓冲液A重悬浮，然后吸取1mL过滤后的菌悬液进行稀释后，使用分光光度计测定其OD420值，范围为0.2～0.8；按照已知标准曲线及公式：Y=稀释倍数×2.85X1.24，其中：Y为细菌含量亿/mL，X为OD420值测定值，确定其菌液浓度，进行细菌含量计算，再8000rpm/min，离心10min，加入缓冲液A重悬浮后，调整菌液浓度至600亿/mL；将菌悬液与3%结晶紫乙醇溶液，以2:1的体积比进行混匀染色，使结晶紫终浓度为1%，在匀浆机中以7000rpm/min，均质3min后，室温震荡过夜，8000rpm/min，离心10min后弃上清，再加入缓冲液A重复清洗3次；最后用0.5%石碳酸磷酸盐缓冲溶液调整菌液浓度为10亿CFU/mL，均质4min，分装即得抗原。
一种鸭源肠炎沙门氏菌抗原在试剂盒中的应用。
试剂盒，包含以下组分：鸭源肠炎沙门氏菌抗原、鸭源肠炎沙门氏菌阳性血清、阴性血清、一次性96孔U型反应板和鸭血清抗体稀释液，抗体稀释液成分为：含0.5%石碳酸溶液的磷酸盐缓冲盐水。
试剂盒的使用方法，包含以下步骤：
（1）使用前所有试剂恢复至室温，试剂应轻轻旋转或震荡予以混合，取出96孔U型板，每孔加入25μL鸭血清抗体稀释液；
（2）每行第1孔加入待检血清25μL，倍比稀释至第5孔，弃最后25μL，第6孔为空白对照，同时设阳性和阴性血清对照；
（3）将鸭沙门氏菌微量凝集试验抗原按25μL/孔加入到全部孔中；
（4）置于湿盒中加盖后室温放置过夜或12h～24h，观察结果；
（5）结果判定：U型板孔中出现絮状沉淀或无明显沉淀物为阳性反应，孔中出现大而明显的纽扣状沉淀为阴性反应；记录样品阳性反应凝集孔数n，当 n≤1 时，判为阴性（-）样品；当n=2时，判定为可疑（±）样品；当n≥3时，判定为阳性（+）样品；可疑样品经再次检验后可疑或阳性，可判定为阳性，再次检验为阴性时则判断为阴性。
进一步的，所述阳性血清的制备方法为：
1）将30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，抽取血液样本进行鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测，采集肛拭子进行PCR核酸检测，检测结果均为阴性方为合格；
2）将实验室分离的鸭源肠炎沙门氏菌，使用LB液体培养基进行扩增纯培养后，使用0.2%甲醛溶液进行灭活，制备为细菌含量为20亿/mL油乳剂灭活苗；
3）将制备好的鸭源肠炎沙门氏菌油乳剂灭活苗进行免疫接种30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，0.5mL/羽，间隔2周后，再次免疫接种，免疫剂量为1 ml/羽，间隔2周后，抽取血液样本测定鸭源肠炎沙门氏菌抗体效价，大于等于26方为合格，宰杀对应试验鸭，收集血液分离血清，加入0.01%硫柳汞溶液，经检验合格后分装备用，即得阳性血清；
所述阴性血清的制备方法为：宰杀经抗体、核酸检验为阴性的30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，收集血液分离血清，加入0.01%硫柳汞溶液，分装备用，即得阴性血清。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的试剂盒具有灵敏、特异，操作简便，判定结果直观可量化，对检测样品温度要求兼容性强，仪器设备要求低，适合基层兽医实验室诊断。
附图说明
图1是本发明中鸭源肠炎沙门氏菌的细菌菌株形态特征；
图2是本发明中鸭源肠炎沙门氏菌的革兰染色镜检结果（1000×）；
图3是本发明中鸭源肠炎沙门氏菌的生化特性鉴定结果；
图4是本发明中鸭源肠炎沙门氏菌多重PCR检测结果；
图5是本发明中鸭源肠炎沙门氏菌16S rRNA基因系统进化树；
图6是本发明中鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测试剂盒结果判定示意图；
肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）菌株已于2023年01月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保护中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，菌株保藏编号为：CGMCC No.26462。
实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
鸭源肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis）菌株由云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所分离于云南某种鸭场，并于2023年01月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保护中心，保藏编号为：CGMCC No.26462。
1、细菌分离纯化
鸭源肠炎沙门菌于2019年9月从云南某种鸭场病死鸭肝脏中分离得到。
具体分离方式：无菌挑取病死鸭肝脏划线接种于鲜血琼脂培养基，于37℃培养过夜后，挑取同一典型菌落划线分别接种于LB固体培养基、SS培养基和麦康凯培养基，于37℃培养过夜，LB固体培养基和麦康凯培养基上生长为光滑、无色半透明的圆形菌落，SS培养基上生长为菌落边缘无色半透明，菌落中心带有黑色或全黑色的圆形菌落，培养形态见图1。挑取纯化后的单菌落接种于LB液体培养基扩大培养并保存。
2、染色镜检
在玻璃板上滴入20μL无菌水，挑取SS培养基上的纯培养物均匀涂布其中并在酒精灯上烘干。按革兰氏染色方法分别使用结晶紫、碘液、酒精和番红染色液分别染色1min，脱色30s和复染1min，烘干。在光学显微镜油镜下观察细菌形态，典型肠炎沙门菌形态为革兰阴性的短小杆菌，多单个存在，染色镜检结果见图2。
3、生化鉴定
取LB液体培养基纯培养物调整为0.5McFarland（约108 CFU/mL）菌悬液，使用沙门菌微量生化鉴定管进行生化鉴定。微量生化鉴定管购自广东环凯微生物科技有限公司，具体使用方法参考厂家说明书操作。鉴定结果见图3和表1。
表1生化鉴定结果
4、血清型鉴定
于洁净玻片上滴1～2滴血清，然后挑取少量SS培养基上的纯培养物均匀涂布其中与血清湿匀，轻轻摇动玻片，1分钟内肉眼判断结果，于1分钟内呈明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。试验以生理氯化钠溶液作阴性对照。沙门菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司，具体使用方法参考厂家说明书操作。该肠炎沙门氏菌的沙门氏菌种属鉴定结果显示，该菌株与沙门氏菌属O多价血清A～F、O9、O12发生凝集；与H多价血清、Hg、Hm发生凝集；与Vi因子血清不发生凝集，其抗原结构式为1，9，12，g，m。对照沙门氏菌诊断抗原表，显示该分离菌株为肠炎沙门氏菌。
5、PCR鉴定
根据农业行业标准NY/T 2838-2015“禽沙门氏菌病诊断技术” 合成多重PCR扩增引物，如图4所示，肠炎沙门菌菌株在495bp和304bp位置处各有一条带。
6、细菌16S rRNA基因鉴定
提取细菌DNA，采用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增测序，测序结果如SEQ ID No.1所示，测序结果（Genbank登录号：OQ026965）上传NCBI网站核酸数据库中进行比对分析，发现其与肠道沙门菌种参考菌株的16S rRNA基因(GenBank登录号：MT621365.1)相似性达99.87%以上，证实待测菌为沙门菌。采用MEGA7.0根据邻接法（Neighbor-Joining method）基于16S rRNA基因序列构建的遗传进化树见图5。由图5可知，本发明中待测菌与沙门菌属参考株聚于同一个分支，同源性最高。
7、鸭源肠炎沙门氏菌，经试验在1:500吖啶黄的盐水溶液在玻板上不发生凝集，说明该菌不会发生自凝，但用于检测鸭源肠炎沙门氏菌阳性血清，凝集效果很明显，可检测的抗体滴度达到1：64，对阴性血清不出现凝集，说明该抗原的抗原性良好，检测灵敏，可用于鸭源肠炎沙门氏菌的抗体检测。
S1，取冻干保存的鸭源肠炎沙门氏菌菌种，画线接种于普通琼脂平板，37℃培养24h，选择典型的光滑型菌落，接种于马丁肉汤液体培养基，置37℃培养24h，经肉眼及显微镜检，选取纯粹的菌液作为菌种，接种于硫代硫酸钠琼脂扁瓶固体培养基（固体培养基含：牛肉汤1000mL，蛋白胨20g、甘油20 g、氯化铵5g、氯化钠5g、硫代硫酸钠5g、琼脂30g），每瓶5mL，摇晃均匀，置 37℃培养24h，逐瓶用肉眼检查，弃去污染杂菌者；
S2，吸弃扁瓶中凝集水，每瓶加入缓冲液A 30mL，缓冲液A为：含0.5%石碳酸溶液的pH值为7.2的磷酸盐缓冲盐水，洗下培养物，收集于带玻璃珠的玻瓶中，经振荡打碎菌块，置37℃灭活24h，期间振荡数次，作无菌检验，获得菌液，用灭菌的4层纱布漏斗滤过菌液于大玻璃瓶中，加入2倍量体积分数为95%的乙醇沉淀3日以上，弃去上清，下沉物8000rpm/min离心10min后弃上清，离心沉淀物加含缓冲A重悬浮，然后吸取1mL过滤后的菌悬液进行稀释后，使用分光光度计测定其OD420值，范围为0.2～0.8；按照已知标准曲线及公式：Y=稀释倍数×2.85X1.24，其中：Y为细菌含量亿/mL，X为OD420值测定值，确定其菌液浓度，进行细菌含量计算，再8000rpm/min，离心10min，加入缓冲液A重悬浮后，调整菌液浓度至600亿/mL；将菌悬液与3%结晶紫乙醇溶液，以2:1的体积比进行混匀染色，使结晶紫终浓度为1%，在匀浆机中以7000rpm/min，均质3min后，室温震荡过夜，8000rpm/min，离心10min后弃上清，再加入缓冲液A重复清洗3次；最后用0.5%石碳酸磷酸盐缓冲溶液调整菌液浓度为10亿CFU/mL，均质4min，分装即得抗原。
（1）试剂盒组分：鸭源肠炎沙门氏菌抗原、鸭血清抗体稀释液（抗体稀释液成分为：含0.5%石碳酸溶液的磷酸盐缓冲盐水）、鸭源肠炎沙门氏菌阳性血清、阴性血清、一次性96孔U型反应板。
样品处理：翅下静脉采集鸭血，分离血清，56℃灭活30 min备用。
（3）检测方法：
1.使用前所有试剂恢复至室温（20℃～25℃），试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。取出96孔U型反应板，每孔加入25μL鸭血清抗体稀释液。
2. 每行第1孔加入待检血清25μL，倍比稀释至第5孔，弃最后25μL，第6孔为空白对照，同时设阳性和阴性血清对照。
3. 将鸭源肠炎沙门氏菌抗原按25μL/孔加入到全部孔中。
4. 置于湿盒中加盖后室温（20℃～25℃）放置过夜或12h～24h，观察结果。
（5）结果判定：U型板孔中出现絮状沉淀或无明显沉淀物为阳性反应，孔中出现大而明显的纽扣状沉淀为阴性反应；
记录样品阳性反应凝集孔数n，当 n≤1 时，判为阴性（-）样品；当n =2时，判定为可疑（±）样品；当n≥3时，判定为阳性（+）样品；可疑样品经再次检验后可疑或阳性，可判定为阳性，再次检验为阴性时则判断为阴性。结果判定示意图见图6。
（6）所述阳性血清的制备方法为：
1）将30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，抽取血液样本进行鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测，采集肛拭子进行PCR核酸检测，检测结果均为阴性方为合格；
2）将实验室分离的鸭源肠炎沙门氏菌，使用LB液体培养基进行扩增纯培养后，使用0.2%甲醛溶液进行灭活，制备为细菌含量为20亿/mL油乳剂灭活苗；
3）将制备好的鸭源肠炎沙门氏菌油乳剂灭活苗进行免疫接种30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，0.5mL/羽，间隔2周后，再次免疫接种，免疫剂量为1ml/羽，间隔2周后，抽取血液样本测定鸭源肠炎沙门氏菌抗体效价，大于等于26方为合格，宰杀对应试验鸭，收集血液分离血清，加入0.01%硫柳汞溶液，经检验合格后分装备用，即得阳性血清；
（7）阴性血清的制备方法为：宰杀经抗体、核酸检验为阴性的30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，收集血液分离血清，加入0.01%硫柳汞溶液，分装备用，即得阴性血清。
将中试产品的“鸭源肠炎沙门氏菌检测试剂盒”提供给江苏省家禽科学研究所（中国农业科学院家禽研究所）、山东和康源生物育种股份有限公司临邑分公司、山东泰安市宁阳正和生物育种有限公司、建水县瑞源农业开发有限公司（建水黄褐鸭保种场）和弥勒市瑞南禽业养殖有限公司用于种鸭沙门氏菌抗体实验监测和疫病净化。该试剂盒与常规检测方法相比，具有灵敏、特异，操作简便，判定结果直观可量化，对检测样品温度兼容性强，仪器设备要求低，适合基层兽医快速诊断。该试剂盒填补了国内目前针对鸭沙门氏菌抗体监测和疫病净化的检测试剂盒的空白。
同时本发明使用的鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测用抗原，与鸡新城疫、鸡传染性鼻炎、鸡传染性法氏囊病、鸡支原体、鸡传染性支气管炎、禽流感、鸡大肠杆菌、鸡传染性喉气管炎、鸡传染性贫血等阳性血清和鸭源肠炎沙门氏菌阳性血清、阴性血清等进行凝集试验，仅与鸭源肠炎沙门氏菌阳性血清发生凝集反应，说明该抗原特异性高。
本发明采用鸭源肠炎沙门氏菌建立的微量凝集检测试剂盒，配备了检测所需的鸭源肠炎沙门氏菌微量凝集试验抗原、专用鸭血清抗体稀释液、阳性血清、阴性血清和一次性96孔U型反应板。试验所需的设备为常规的微量移液器、配套滴头及反应用湿盒，无需其他大型仪器及专用设备。试剂盒操作步骤简单，按照说明书进行样品稀释和抗原添加后，置于湿盒内即可，结果判定时，只需记录样品阳性反应凝集孔数n，并依据说明书的判定结果，即可确定样品的阴阳性，结果直观可量化，避免了平板凝集试验中，因判读人员经验的影响导致结果有偏差的情况出现。试剂盒对于检测样品温度要求兼容性强，不会出现因检测样本温度过低时，产生的假阴性情况。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一株鸭源肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）菌株，其特征是，鸭源肠炎沙门氏菌菌株已于2023年01月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保护中心，保藏编号为：CGMCC No.26462。
2.一种鸭源肠炎沙门氏菌抗原，其特征在于：由保藏编号为CGMCC No.26462的鸭源肠炎沙门氏菌制成；制备方法包含以下步骤：
S1，取冻干保存的鸭源肠炎沙门氏菌菌种，划线接种于普通琼脂平板，37℃培养24h，选择典型的光滑型菌落，接种于马丁肉汤液体培养基，置37℃培养24h，经肉眼及显微镜检，选取纯粹的菌液作为菌种，接种于硫代硫酸钠琼脂扁瓶固体培养基，每瓶5mL，摇晃均匀，置37℃培养24h，逐瓶用肉眼检查，弃去污染杂菌者；
S2，吸弃扁瓶中凝集水，每瓶加入缓冲液A 30mL，缓冲液A为：含0.5%石碳酸溶液的pH值为7.2的磷酸盐缓冲盐水，洗下培养物，收集于带玻璃珠的玻瓶中，经振荡打碎菌块，置37℃灭活24h，期间振荡数次，作无菌检验，获得菌液，用灭菌的4层纱布漏斗滤过菌液于大玻璃瓶中，加入2倍量体积分数为95%的乙醇沉淀3日以上，弃去上清，下沉物8000rpm/min离心10min后弃上清，离心沉淀物加缓冲液A重悬浮，然后吸取1mL过滤后的菌悬液进行稀释后，使用分光光度计测定其OD 420值，范围为0.2～0.8；按照已知标准曲线及公式：Y=稀释倍数×2.85X 1.24，其中：Y为细菌含量亿/mL，X为OD 420值测定值，确定其菌液浓度，进行细菌含量计算，再8000rpm/min，离心10min，加入缓冲液A重悬浮后，调整菌液浓度至600亿/mL；将菌悬液与3%结晶紫乙醇溶液，以2:1的体积比进行混匀染色，使结晶紫终浓度为1%，在匀浆机中以7000rpm/min，均质3min后，室温震荡过夜，8000rpm/min，离心10min后弃上清，再加入缓冲液A重复清洗3次；最后用0.5%石碳酸磷酸盐缓冲溶液调整菌液浓度为10亿CFU/mL，均质4min，分装即得抗原。
3.如权利要求2所述的一种鸭源肠炎沙门氏菌抗原在制备为检测鸭源肠炎沙门氏菌试剂盒中的应用。
4.如权利要求3中所述的试剂盒，其特征在于，包含以下组分：鸭源肠炎沙门氏菌抗原、鸭源肠炎沙门氏菌阳性血清、阴性血清、一次性96孔U型反应板和鸭血清抗体稀释液，抗体稀释液成分为：含0.5%石碳酸溶液的磷酸盐缓冲盐水。
5.根据权利要求4中所述的试剂盒，其特征在于：
所述阳性血清的制备方法为：
1）将30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，抽取血液样本进行鸭源肠炎沙门氏菌抗体检测，采集肛拭子进行PCR核酸检测，检测结果均为阴性方为合格；
2）将实验室分离的鸭源肠炎沙门氏菌，使用LB液体培养基进行扩增纯培养后，使用0.2%甲醛溶液进行灭活，制备为细菌含量为20亿/mL油乳剂灭活苗；
3）将制备好的鸭源肠炎沙门氏菌油乳剂灭活苗进行免疫接种30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，0.5mL/羽，间隔2周后，再次免疫接种，免疫剂量为1ml/羽，间隔2周后，抽取血液样本测定鸭源肠炎沙门氏菌抗体效价，大于等于2 6方为合格，宰杀对应试验鸭，收集血液分离血清，加入0.01%硫柳汞溶液，经检验合格后分装备用，即得阳性血清；所述阴性血清的制备方法为：宰杀经抗体、核酸检验为阴性的30日龄无特定病原体清洁级试验鸭，收集血液分离血清，加入0.01%硫柳汞溶液，分装备用，即得阴性血清。
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Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5510241A (en) * 1990-10-01 1996-04-23 The Minister Of Agriculture, Fisheries And Food In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britian And Northern Ireland Method of testing for the presence of Salmonella serotypes expressing Salmonella enteritidis fimbrial antigen (SEFA) and reagents therefore
SG93209A1 (en) * 1999-07-05 2002-12-17 Inst Of Molecular Agrobiology A novel immuno-diagnostic test method for veterinary disease
KR20090016236A (ko) * 2007-08-10 2009-02-13 (주)양성 소 질병의 항원 제조방법 및 면역항체(난황, 초유) 생산과전해질을 첨가한 송아지설사 방제용 조성물
CN104789500A (zh) * 2015-04-03 2015-07-22 江苏省家禽科学研究所 一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用
CN107384830A (zh) * 2017-08-20 2017-11-24 云南省畜牧兽医科学院 一种鸭疫里默氏杆菌的培养方法及其培养基
CN107446851A (zh) * 2017-08-25 2017-12-08 扬州大学 一种鸡白痢凝集抗原及其制备方法
CN110218668A (zh) * 2019-05-21 2019-09-10 扬州大学 一种惰性载体沙门氏菌及其潜在应用
CN111500504A (zh) * 2020-05-19 2020-08-07 扬州大学 一种泛性型惰性载体沙门氏菌及其潜在应用
CN113061549A (zh) * 2021-03-31 2021-07-02 江苏省家禽科学研究所 一种禽霍乱凝集抗原及其制备方法
CN113265358A (zh) * 2021-05-25 2021-08-17 山东省滨州畜牧兽医研究院 鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原及其制备方法和应用
WO2021232800A1 (zh) * 2020-05-19 2021-11-25 扬州大学 一种泛性型惰性载体大肠杆菌及其潜在应用
CN114042152A (zh) * 2021-11-30 2022-02-15 山东滨州博莱威生物技术有限公司 一种鸭肠炎沙门氏菌病灭活疫苗及其制备方法
CN115851771A (zh) * 2022-08-03 2023-03-28 扬州大学 一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040137525A1 (en) * 2002-10-16 2004-07-15 Jolley Michael E. Detection of salmonella cells by fluorescence polarization
CN112618706B (zh) * 2020-11-21 2021-09-14 青岛博霖生物科技有限公司 沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5510241A (en) * 1990-10-01 1996-04-23 The Minister Of Agriculture, Fisheries And Food In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britian And Northern Ireland Method of testing for the presence of Salmonella serotypes expressing Salmonella enteritidis fimbrial antigen (SEFA) and reagents therefore
SG93209A1 (en) * 1999-07-05 2002-12-17 Inst Of Molecular Agrobiology A novel immuno-diagnostic test method for veterinary disease
KR20090016236A (ko) * 2007-08-10 2009-02-13 (주)양성 소 질병의 항원 제조방법 및 면역항체(난황, 초유) 생산과전해질을 첨가한 송아지설사 방제용 조성물
CN104789500A (zh) * 2015-04-03 2015-07-22 江苏省家禽科学研究所 一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用
CN107384830A (zh) * 2017-08-20 2017-11-24 云南省畜牧兽医科学院 一种鸭疫里默氏杆菌的培养方法及其培养基
CN107446851A (zh) * 2017-08-25 2017-12-08 扬州大学 一种鸡白痢凝集抗原及其制备方法
CN110218668A (zh) * 2019-05-21 2019-09-10 扬州大学 一种惰性载体沙门氏菌及其潜在应用
CN111500504A (zh) * 2020-05-19 2020-08-07 扬州大学 一种泛性型惰性载体沙门氏菌及其潜在应用
WO2021232800A1 (zh) * 2020-05-19 2021-11-25 扬州大学 一种泛性型惰性载体大肠杆菌及其潜在应用
CN113061549A (zh) * 2021-03-31 2021-07-02 江苏省家禽科学研究所 一种禽霍乱凝集抗原及其制备方法
CN113265358A (zh) * 2021-05-25 2021-08-17 山东省滨州畜牧兽医研究院 鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原及其制备方法和应用
CN114042152A (zh) * 2021-11-30 2022-02-15 山东滨州博莱威生物技术有限公司 一种鸭肠炎沙门氏菌病灭活疫苗及其制备方法
CN115851771A (zh) * 2022-08-03 2023-03-28 扬州大学 一种不表达Peg菌毛的鸡伤寒沙门菌弱毒分离株及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sef fimbria operon construction, expression, and function for direct rapid detection of Salmonella Enteritidis;Xuanqiang Gu等;Appl Microbiol Biotechnol.;第5631-5641页 *
肠炎沙门氏菌快速检测方法的建立;张艳红, 杜元钊, 吴延功;中国动物检疫(第07期);第25-28页 *
鸡源性肠炎沙门氏菌的流行病学调查;王亮;张元鹏;张荣武;徐彪;朱来华;肖西志;罗欣;常维山;;中国人兽共患病学报(第05期);第455-458页 *
鸭沙门氏菌的分离与鉴定;张则斌;王芳;徐为中;范志宇;高成华;王平生;;中国家禽(第23期);第45-46页 *

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