CN107446851B

CN107446851B - 一种鸡白痢凝集抗原及其制备方法

Info

Publication number: CN107446851B
Application number: CN201710740267.8A
Authority: CN
Inventors: 陈素娟; 彭大新; 秦涛; 张伟伟
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2037-08-25
Also published as: CN107446851A

Abstract

本发明涉及一种鸡白痢凝集抗原及其制备方法，主要涉及的细菌菌株为鸡白痢沙门氏菌标准株C79‑1和经筛选的野生分离株S44。所述鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44，分类命名为：肠道沙门氏菌肠道亚种鸡白痢沙门菌，拉丁名：Salmonella enterica subsp.enterica pullorum，从鸡中分离的鸡白痢沙门氏菌中筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.14258。本发明方法科学合理、生产稳定，成本低廉，选用的鸡白痢染色凝集抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的鸡白痢染色凝集抗原产品具有敏感性高、特异性强、诊断快速、凝集效果易于观察等优点。

Description

一种鸡白痢凝集抗原及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸡白痢凝集抗原及其制备方法，主要涉及的细菌菌株为鸡白痢沙门氏菌标准株C79-1和经分离与筛选得来的野生分离株S44。

背景技术

鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起，各种日龄鸡均可感染的一种急性或慢性传染病，该病既可水平传播又可垂直传播，对家禽养殖业的发展存在巨大威胁。患病雏鸡的发病率和致死率高，也能造成成年鸡生产性能下降。在我国及其他发展中国家，鸡白痢沙门菌的污染颇为严重。《国家中长期动物疫病防治规划(2012～2020年)》对鸡白痢的净化提出了考核要求，2020年全国所有种鸡场的鸡白痢沙门氏菌病达到净化标准。在没有可靠疫苗使用的情况下，开展鸡白痢的净化工作是防控该病的重要措施。养殖场往往使用玻板凝集试验进行检疫，淘汰阳性鸡，而鸡白痢染色抗原是该检疫方法的关键。

我国现有的商品化“鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集抗原”是用早年分离的鸡白痢沙门菌标准株C79-1和变异株C79-7制备而成，但近几年在实际应用中发现，该染色抗原存在敏感度低、诊断速度慢等缺陷，导致检测后的种鸡群不能达到彻底净化的目标。因此，筛选出适宜的抗原制备菌株，制备一种新型、高效鸡白痢诊断抗原，有利于提高鸡白痢的检疫质量，对于减少养殖场经济损失具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于前人研究的基础上，提供一种新型、更为高效的鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法，该抗原由鸡白痢沙门氏菌标准株C79-1和经筛选的野生分离株S44制成，用于鸡白痢的检测。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44，分类命名为：肠道沙门氏菌肠道亚种，拉丁名：Salmonella enterica subsp.enterica pullorum，是从鸡中分离的鸡白痢沙门氏菌中筛选得来，，已于2017年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14258。

一种鸡白痢凝集抗原，含有的细菌浓度为2.0×10¹⁰CFU/ml。其中含有鸡白痢沙门氏菌标准株C79-1和经筛选的鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44的细菌比例各为50％。

所述鸡白痢沙门氏菌C79-1由国家兽医微生物菌种保藏中心提供的；所述鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44(肠道沙门氏菌肠道亚种，Salmonella entericasubsp.enterica)为权利要求1所述鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44。

本发明还提供所述鸡白痢凝集抗原的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)配制培养基:

TG培养基：加入马丁肉汤粉、甘油、硫代硫酸钠和琼脂粉，加超纯水适量，调pH值至7.2-7.4；

0.4％福尔马林生理盐水：加入氯化钠、甲醛溶液、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄·7H₂O、Na₃PO₄·12H₂O，调pH值至6.5；

3％结晶紫酒精溶液：称取结晶紫30g，充分搅拌，使其溶解于1L无水乙醇中，过滤后使用；

步骤2)制备鸡白痢凝集抗原：

分别配制标准株C79-1和野生分离株S44抗原溶液，将抗原溶液按照50％标准株C79-1抗原溶液和50％野生分离株S44抗原溶液的比例混合，充分摇匀后，无菌分装，将制备好的染色抗原置于4℃冰箱保存。

进一步的，步骤1)中每1L TG培养基中加入53.5g马丁肉汤粉、10ml甘油、3g硫代硫酸钠和18g琼脂粉；每1L福尔马林生理盐水中加入8.5g氯化钠、10ml甲醛溶液、0.04gNaH₂PO₄、0.12g Na₂HPO₄·7H₂O和0.76g Na₃PO₄·12H₂O。

进一步的，步骤2)中配制标准株C79-1和野生分离株S44抗原溶液的方法为：

(1)培养细菌：将复苏后的标准株C79-1或野生分离株S44在TG琼脂连续传2～3代，挑取足量菌落在TG琼脂均匀涂全板，37℃培养18～24h；

(2)收集细菌：用足量0.2％福尔马林生理盐水洗下菌体，4000rpm离心40min，收集细菌沉淀，重悬；

(3)灭活：加入足量0.4％福尔马林生理盐水，重悬后，4℃静置24h。然后用接种环蘸取菌液在麦康凯平板划线，进行无菌检验；

(4)酒精沉淀：无菌检验合格后，4000rpm离心40min，弃上清，加入两倍体积的无水乙醇，重悬，4℃静置24～36h，直到细菌沉淀完全，用吸管去除上层酒精及絮状物；

(5)调整抗原浓度：将酒精处理过的抗原用含10％甘油的PBS洗两遍，按比浊法调节菌液浓度至2.0×10¹⁰CFU/ml；

(6)抗原染色：将含3％结晶紫的酒精溶液按1％体积，分3次加入抗原中，每隔3h加一次，充分混匀，期间于37℃摇震。加毕，置于37℃温箱中，48h后取出。

本发明还提供所述的鸡白痢凝集抗原在鸡白痢检测试剂中的用途。

有益效果：

本发明提供了一种的鸡白痢染色凝集抗原，该抗原由鸡白痢沙门氏菌C79-1和S44制成。鸡白痢沙门氏菌C79-1由国家兽医微生物菌种保藏中心提供，分离自北京双桥农场的鸡。S44是从本实验室2012-2016年68株自然病例分离、保存的鸡白痢沙门菌菌种中，经反复筛选验证后获得的抗原性好、生长速度快、变异率低的鸡白痢沙门氏菌菌种。

本发明工艺方法科学合理、生产稳定，成本低廉，选用的鸡白痢染色凝集抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的鸡白痢染色凝集抗原产品具有敏感性高、特异性强、诊断快速、凝集效果易于观察等优点。

附图说明

图1：各候选抗原对鸡体内抗体水平的动态监测结果(nlog2)。

图2：候选抗原制备菌株的生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

(1)分离纯化与染色镜检

鸡白痢沙门氏菌S44于2012年5月29日从江苏省扬州市邗江区某鸡场的草鸡肝脏中分离获得。其具体分离方法为：以常规无菌操作方法，对疑似病料进行表面消毒后，作一切口，用接种环沾取病料，三区划线接种于麦康凯培养基，于37℃温箱中静置培养18～24h，挑取疑似菌落纯化培养。鸡白痢沙门菌在麦康凯培养基上生长为无色、透明或半透明的圆形、光滑菌落。挑取纯化培养后的疑似单个菌落，进行革兰氏染色，镜检，呈两端稍圆、细长的革兰氏阴性杆菌。

(2)细菌的鉴定

参照中华人民共和国农业行业标准《禽沙门菌病诊断技术》鉴定野生分离株为鸡白痢沙门菌。

(3)使用高免血清初筛

制备鸡白痢标准株C79-1、变异株C79-7和野生株S2、S4、S5、S8(从不同时间和地点分离得到，在麦康凯琼脂上生长为光滑型菌落，且在1：500吖啶黄溶液中不发生凝集反应)的高免血清，同时制备含类属抗原菌株的高免血清。利用高免血清对2012-2016年分离到的68株鸡白痢沙门菌进行交叉玻板凝集价测定。结果显示，野生株S35、S44和S50效价较高(表1)，且特异性良好(表2)，确定为候选抗原制备菌株。

表1.各候选抗原制备菌株检测高免血清的效价

表2.各候选抗原制备菌株的特异性比较

(4)候选抗原对鸡体内抗体水平的动态监测

将7周龄SPF鸡随机分为6组，每组10只。用鸡白痢沙门菌野生株S35、S44、S50和S6702分别进行人工感染，口服1ml(约2.0×107CFU)。同时设有1组阴性对照，口服等量10％甘油PBS。用各候选抗原分别检测攻毒后第7天，第14天，第21天和第28天血清样品的玻板凝集效价，取每组鸡只效价均值作图，比较各候选抗原检测效果。结果显示，各候选抗原检测效价均明显高于C79-1抗原，而S6702和C79-7抗原检测效价均较低。在候选抗原中，S44检测效果最佳(图1)。

(5)候选抗原的生长曲线测定

分别挑取鸡白痢沙门菌标准株C79-1、变异株C79-7，及野生株S35、S44、S50的单个菌落接种于TG培养基中，37℃220rpm震荡培养。将培养后的细菌母液接种到20mL TG培养基中(调节OD600＝0.1)，37℃，220rpm振荡培养，每隔1h检测一次培养物的OD600值，连续测定10次，重复3次试验，绘制出细菌的生长曲线。生长曲线显示，S44生长速度最快，S35、S50、C79-7次之，而C79-1生长速度最慢(图2)。

(6)候选抗原制备菌株的菌落性质和稳定性检查

将各候选抗原制备菌株在TG琼脂连续传代，每隔五代使用野生株S2免疫血清进行效价稳定性检测。传代过程中每代次应挑取若干单菌落与1：500吖啶黄溶液进行玻板凝集检查，发生凝集的菌株不可使用。检测结果显示，各野生株及标准株抗原检测血清效价保持稳定，只有变异株抗原效价稍有波动(表3)。传代过程挑取各菌株的菌落在1：500吖啶黄溶液中均未出现凝集反应。

表3.候选抗原制备菌株的稳定性检查

(7)使用自然感染鸡血清进行广谱性比较

将选取的侯选株制备成为染色抗原，检测A公司100份自然感染鸡的血清玻板凝集反应效价，“++++、+++、++”为强阳性，“+”为弱阳性，“－”为阴性，比较各抗原的总阳性率和强阳性率。结果显示S35，S44，S50，标准株C79-1及变异株C79-7的总阳性检出率分别为13％，40％，15％，57％，5％，强阳性检出率分别为5％，14％，8％，15％和1％。因此在3个候选抗原中，S44广谱性最佳(表4)。因此，S44为制备鸡白痢平板凝集抗原的适宜菌株。

表4.不同候选抗原检测100份自然感染鸡血清的结果

(8)结合具体实施例说明上述鸡白痢染色凝集抗原制备及其应用效果。

A:培养基配制

TG培养基(1L)：马丁肉汤粉53.5g(青岛海博生物技术有限公司)，甘油10ml，硫代硫酸钠3g，琼脂粉18g，加超纯水适量，调pH值至7.2-7.4；

0.4％福尔马林生理盐水(1L)：氯化钠8.5g，甲醛溶液10ml，NaH2PO4 0.04g，Na2HPO4·7H2O 0.12g，Na3PO4·12H2O 0.76g，调pH值至6.5；

3％结晶紫酒精溶液(1L)：称取结晶紫30g，充分搅拌，使其溶解于1L无水乙醇中，过滤后使用。

B:鸡白痢凝集抗原的制备方法

(1)培养细菌：将复苏后的菌株在TG琼脂连续传2～3代，挑取足量菌落在TG琼脂均匀涂全板，37℃培养18～24h。

(2)收集细菌：用足量0.2％福尔马林生理盐水洗下菌体，4000rpm离心40min，收集细菌沉淀，重悬。

(3)灭活：加入足量0.4％福尔马林生理盐水，重悬后，4℃静置24h。然后用接种环蘸取菌液在麦康凯平板划线，进行无菌检验。

(4)酒精沉淀：无菌检验合格后，4000rpm离心40min，弃上清，加入两倍体积的无水乙醇，重悬，4℃静置24～36h，直到细菌沉淀完全，用吸管去除上层酒精及絮状物。

(5)调整抗原浓度：将酒精处理过的抗原用含10％甘油的PBS洗两遍，按比浊法调节菌液浓度至2.0×10¹⁰CFU/ml。

(7)抗原配制：将抗原按照50％C79-1和50％S44的比例混合，充分摇匀后，无菌分装。

(8)抗原保存：将制备好的染色抗原置于4℃冰箱保存。

C:玻板凝集试验判定标准

将抗原充分混合后，吸取20μl滴加在清洁的玻板上，再吸取等量血清与其充分混合，涂成直径约1cm的圆形。在室温下，2min内判定反应结果，结果判定标准如下：

－:液体均匀混浊，无凝集现象；

+:仅仅可以看见少量细小颗粒，液体混浊，即25％凝集；

++:有明显的蓝紫色凝集颗粒，液体较为浑浊，即50％凝集；

+++:有明显蓝紫色凝集片和颗粒，液体轻度浑浊，即75％凝集；

++++:出现大片蓝紫色凝集，液体完全透明，即100％凝集。

结果判断时，2min内不出现凝集或仅出现均匀一致的极微小颗粒时判为阴性，操作时应以PBS作为对照。

实施例1

用自制抗原检测A公司提供100份自然感染鸡血清，同时以商品化鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集抗原(购自中国兽医药品监查所，批号为201402,简称CVCC抗原)为对照抗原。按照玻板凝集试验判定标准进行结果判定。结果显示，自制抗原和中监所抗原的强阳性数分别为47，40；总阳性数分别为90，88。自制抗原的总阳性率比CVCC抗原提高了2％，强阳性率比CVCC抗原提高了7％(表5、表6)。

表5.自制抗原和中监所抗原检测A公司自然感染鸡血清的结果

实施例2

用自制抗原检测B公司和C公司提供的两组自然感染鸡血清，同时以商品化鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集抗原(购自中国兽医药品监查所，批号为201402)为对照抗原。按照玻板凝集试验判定标准进行结果判定。结果显示,在总阳性率方面，自制抗原比中监所抗原分别高出8.43％和33.33％。而在强阳性率方面，自制抗原分别比中监所抗原提高7.36％和19.29％(表6)。上述结果表明，用本发明方法制备的抗原检测效果明显优于商品化抗原，有利于提高鸡白痢的检疫质量。

表6自制抗原和中监所抗原检测自然感染鸡的阳性率情况

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims

1.一种鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44，其特征在于：所述鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44，分类命名为：肠道沙门氏菌肠道亚种鸡白痢沙门菌，拉丁名：Salmonella enterica subsp.enterica pullorum，是从鸡中分离的鸡白痢沙门氏菌中筛选得来，已于2017年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏编号为 CGMCCNo. 14258。

2.一种鸡白痢凝集抗原，其特征在于：含有的细菌浓度为2.0×10¹⁰CFU/ml；

其中含有鸡白痢沙门氏菌标准株C79-1和经筛选的鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44的细菌比例各为50%；所述鸡白痢沙门氏菌C79-1由国家兽医微生物菌种保藏中心提供的；所述鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44为权利要求1所述鸡白痢沙门氏菌野生分离株S44。

3.权利要求2所述的鸡白痢凝集抗原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1) 配制培养基:

TG培养基：加入马丁肉汤粉、甘油、硫代硫酸钠和琼脂粉，加超纯水适量，调pH值至7.2-7.4 ；

0.4%福尔马林生理盐水：加入氯化钠、甲醛溶液、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄·7H₂O 、Na₃PO₄·12H₂O，调pH值至6.5 ;

3%结晶紫酒精溶液：称取结晶紫30 g，充分搅拌，使其溶解于1 L无水乙醇中，过滤后使用；

步骤2) 制备鸡白痢凝集抗原：

分别配制标准株C79-1和野生分离株S44抗原溶液，将抗原溶液按照50% 标准株C79-1抗原溶液和50% 野生分离株S44抗原溶液的比例混合，充分摇匀后，无菌分装，将制备好的染色抗原置于4℃冰箱保存。

4.根据权利要求2所述的鸡白痢凝集抗原的制备方法，其特征在于：步骤1)中每1 L TG培养基中加入53.5 g马丁肉汤粉、10 ml甘油、3 g硫代硫酸钠和18 g琼脂粉；每1 L福尔马林生理盐水中加入8.5 g氯化钠、10 ml甲醛溶液、0.04 g NaH₂PO₄、0.12 g Na₂HPO₄·7H₂O和0.76 g Na₃PO₄·12H₂O。

5.根据权利要求3所述的鸡白痢凝集抗原的制备方法，其特征在于：步骤2)中配制标准株C79-1和野生分离株S44抗原溶液的方法为：

（1）培养细菌：将复苏后的标准株C79-1或野生分离株S44在TG琼脂连续传2~3代，挑取足量菌落在TG琼脂均匀涂全板，37℃培养18~24 h；

（2）收集细菌：用足量0.2%福尔马林生理盐水洗下菌体，4000 rpm离心40 min，收集细菌沉淀，重悬；

（3）灭活：加入足量0.4%福尔马林生理盐水，重悬后，4℃静置24 h；

然后用接种环蘸取菌液在麦康凯平板划线，进行无菌检验；

（4）酒精沉淀：无菌检验合格后，4000 rpm离心40 min，弃上清，加入两倍体积的无水乙醇，重悬，4℃静置24~36 h，直到细菌沉淀完全，用吸管去除上层酒精及絮状物；

（5）调整抗原浓度：将酒精处理过的抗原用含10%甘油的PBS洗两遍，按比浊法调节菌液浓度至2.0×10¹⁰CFU/ml；

（6）抗原染色：将含3%结晶紫的酒精溶液按1%体积，分3次加入抗原中，每隔3 h加一次，充分混匀，期间于37℃摇震；

加毕，置于37℃温箱中，48 h后取出。

6.权利要求2所述的鸡白痢凝集抗原在制备鸡白痢检测试剂中的用途。