CN109633183B - 一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用 - Google Patents

一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用。所述试剂盒中包括：(1)溶酪大球菌间接血凝抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液。本发明提供的一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用，其有益效果包括以下方面：试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用；本发明中的试剂盒在检测样品时只需要使用几种简单耗材以及温箱，即使在条件比较简陋的养殖场也可以使用；结果判定直观，眼观即可；操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；成本低廉，经济实惠，使用者均可接受。

Description

一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用
技术领域
本发明属于检测试剂盒领域，具体涉及一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用。
背景技术
溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus，MCSD)属于巨球菌属，该属包括7个菌种，溶酪大球菌是其中的代表菌种。该菌可特异性的从动物皮和动物类食品中分离到，比如牛乳、生牛肉、鸡肉、火腿等，我国传统肉制品广式腊肠中也能分离到。该菌可引起鱼发病，已从牙鲆、鲭鱼、加州鲈等鱼体内分离到，给水产养殖带来了危害。另外，溶酪大球菌还可以使犬发病，表现鼻炎的症状。该菌还携带耐甲氧西林的SCCmec原件(mecB-carrying SCCmecelement)，表现对青霉素类药物高度耐药。本研究团队首次从鸭体内分离到多株溶酪大球菌，并且所分离到的菌株均对环丙沙星高度耐药，提示在对溶酪大球菌导致的临床动物的治疗中环丙沙星无效。
目前国内外对溶酪大球菌的研究报道甚少，GenBank基因库中仅有一株溶酪大球菌的全序列，对于溶酪大球菌的分子生物学检测技术报道的非常少，对于溶酪大球菌的血清抗体检测技术在国内外均未见报道。鉴于此，有必要开发一种可检测溶酪大球菌血清抗体的免疫学技术，用来对溶酪大球菌的感染状况进行调查。
发明内容
针对上述问题和现有技术的不足，本发明提供一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测技术，用来对溶酪大球菌的感染状况进行检测，另外可对鸭体内溶酪大球菌开展流行病学调查。
为了实现上述目的，本发明提供了一种溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒，所述的试剂盒包括：
(1)溶酪大球菌间接血凝抗原；
(2)标准阳性血清；
(3)标准阴性血清；
(4)稀释液。
进一步地，上述用来制备溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus，MCSD)间接血凝抗原的溶酪大球菌菌株为来源于鸭的田间分离株，于2018年03月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO:M2018116，保藏名称：溶酪大球菌MCSD(Macrococcus caseolyticus，MCSD)。
进一步地，上述的溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus，MCSD)间接血凝抗原是将溶酪大球菌CCTCC M 2018116株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。
进一步地，上述的溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus，MCSD)间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)静脉采集绵羊红细胞，与灭菌阿氏液混匀并保存，在4℃静置3～5天，使红细胞充分沉淀，然后对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和质量体积百分比为1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液，最后将制备好的绵羊红细胞用浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至体积百分比为5％的浓度，得到绵羊红细胞悬液；
(2)将溶酪大球菌CCTCC M 2018116株的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；
(3)以步骤(2)得到的用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(1)得到的绵羊红细胞悬液，得到溶酪大球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为100μg/ml～200μg/ml。
进一步地，上述的标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的溶酪大球菌CCTCCM 2018116株的甘油菌，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃，5％CO2箱中培养15～20h，再挑取单菌落接种于5ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18h，然后取2ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养8～10h，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml磷酸盐缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用的溶酪大球菌菌液；再将其置于碎冰中，放在超声破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液以6000r/min的速率离心15min，取上清与弗氏完全佐剂等体积混匀，对鸭进行第一次免疫，然后取上清与弗氏不完全佐剂等体积混匀，对鸭进行第二次或二次以上的免疫，得到分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为标准阳性血清。
进一步地，上述的标准阴性血清的制备方法为：收集体重2～2.5公斤未感染溶酪大球菌的健康樱桃谷鸭的颈动脉血，室温过夜，然后以3000r/min的速率离心15min，取血清即得标准阴性血清。
进一步地，上述一种溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒中稀释液的制备方法为：配制浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1％的兔血清和质量体积百分比为0.01％的叠氮钠，即为稀释液。
另外本发明还提供了上述一种溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒在检测溶酪大球菌血清抗体效价中的应用。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法和应用，其优越性包括以下方面：
a.试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医相关单位以及养殖场广泛推广使用。本发明中的试剂盒在检测样品时只需要110°血凝板、移液器、移液器枪头和玻璃板等简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养殖场也可以使用；
b.检测快速，结果判定直观，眼观即可；
c.操作简单，操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；
d.成本低廉，经济实惠，使用者均可接受。
附图说明
图1为溶酪大球菌间接血凝抗原检测标准阳性血清、标准阴性血清以及腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的阳性血清；
其中“+”表示检测标准阳性血清，“-”表示检测标准阴性血清，“空白”表示不加血清的空白对照，“腐生”表示检测腐生葡萄球菌的阳性血清，“松鼠”表示检测松鼠葡萄球菌的阳性血清，“金黄”表示检测金黄色葡萄球菌的阳性血清；“粪肠”表示检测粪肠球菌的阳性血清；“屎肠”表示检测屎肠球菌的阳性血清，1:2～1:512表示血清的稀释倍数。溶酪大球菌间接血凝抗原检测对应的标准阳性血清，检测到的血清抗体效价为1:512；检测标准阴性血清、空白对照均成立；检测腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的阳性血清，结果均为阴性。
图2为琼脂扩散试验检测溶酪大球菌标准阳性血清和标准阴性血清，其中1:2～1:32表示血清的稀释倍数。该试验检测到的标准阳性血清抗体效价为1:32，标准阴性血清无琼扩条带出现。
具体实施方式
下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒的制备
一、溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒的组成
试剂盒中包括溶酪大球菌间接血凝抗原1瓶(10ml)，4℃保存；标准阳性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；标准阴性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；稀释液3瓶(10ml/瓶)，4℃保存。试剂盒可检测40～50份血清，保存期为6个月。
其中用来制备抗原的溶酪大球菌菌株为来源于鸭的田间分离株，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保存时间为2018年3月11日，名称为溶酪大球菌MCSD，(Macrococcus caseolyticus，MCSD)菌株编号为CCTCC M 2018116。
二、溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒的制备
1.标准阳性血清的制备
首先取出-80℃冻存的溶酪大球菌CCTCC M 2018116株的甘油菌，用接种环蘸取少量菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板上，置于37℃，5％CO2温箱中培养15～20h，再挑取单菌落接种于5ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min震荡培养15～18h，然后取2ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min震荡培养8～10h。培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3次，最后用10ml磷酸盐缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，作为超声破碎用菌体。
将上述制备的溶酪大球菌菌液置于碎冰中，再放到超声波细胞破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次。将破碎后的菌液以4℃，12000r/min离心15min，收集上清。
测定上述制备的上清中的蛋白浓度。经紫外分光光度计检测，菌液上清中的蛋白浓度为11.56mg/ml。这些上清液作为制备溶酪大球菌阳性血清用抗原，以及后续致敏绵羊红细胞的抗原，冻存于-40℃以下备用。
将上述制备的CCTCC M 2018116抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2～2.5公斤的健康鸭，接种抗原量200μg/只。2周后用同等剂量的抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合，加强免疫1次，间隔2周后再加强免疫1次。第3次免疫后2周，鸭翅静脉采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为合格阳性血清。若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准。
经琼脂扩散试验检测，所制备的CCTCC M 2018116菌株的标准阳性血清的抗体效价达到1:32，符合标准。
2.标准阴性血清的制备
选取体重2～2.5公斤、未感染溶酪大球菌的健康樱桃谷鸭，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，收集血清，经琼脂扩散试验检测，结果为阴性，即为标准阴性血清。
3.稀释液的制备
配制浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1％的兔血清和质量体积百分比为0.01％的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。
4.溶酪大球菌间接血凝抗原制备
(1)配制阿氏液：柠檬酸钠0.8克，柠檬酸0.055克，葡萄糖2.05克，氯化钠0.42克，双蒸水100ml。混匀后113℃高压10min，冷却至室温后4℃保存；
(2)配制浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液：称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后121℃高压20min，冷却至室温保存；
(3)配制稀释液：在步骤(2)得到的0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液中加入体积百分比为1％的兔血清，质量体积百分比为0.01％的叠氮钠，即为稀释液。
(4)静脉采集绵羊红细胞100ml，与100ml灭菌阿氏液混匀，在4℃静置3～5天，使红细胞充分沉淀。将沉淀好的红细胞摇匀，用灭菌纱布过滤，滤出液收集至大离心管中，以4000r/min离心15min，弃去上清。用磷酸盐缓冲液洗涤红细胞4遍；
(5)用磷酸盐缓冲液将红细胞悬浮至体积百分比为5％的浓度，与体积百分比为2.5％的戊二醛按照体积百分比5:1的比例慢慢混匀，置磁力搅拌器上搅拌2.5～3h，然后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍；
(6)用磷酸盐缓冲液将上述红细胞悬浮至体积百分比为5％的浓度，再与等量质量体积百分比为1/20000的鞣酸溶液混匀，即鞣酸溶液的终浓度为质量体积百分比1/40000，所用的溶液均为磷酸盐缓冲液。将上述红细胞悬液置于37℃水浴中，静置30min，然后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍，最后用磷酸盐缓冲液重悬至体积百分比为5％的浓度；
(7)将溶酪大球菌CCTCC M 2018116株的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，用紫外分光光度计测定其浓度，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；
(8)以步骤(7)得到的用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(6)得到的绵羊红细胞悬液，得到溶酪大球菌间接血凝抗原。
首先确定致敏绵羊红细胞的最佳抗原量。取制备好的体积百分比为5％的红细胞5份，每份5ml。取制备好的CCTCC M 2018116菌株致敏用抗原，以终浓度25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml分别致敏红细胞。致敏时放于37℃水浴中，致敏时间为30min，期间每隔5min摇匀一次，以防细胞沉淀。致敏后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍，再用稀释液洗涤1遍，最后用稀释液将红细胞悬浮至50ml，细胞终浓度为体积百分比1％。
检测抗原质量：取2块110°血凝板，在第1块板的第1～5排的1～12孔、第2块板的第1～5排的1～8孔，分别加入稀释液，50μl/孔。然后在第1块板的第1～5排的第1孔，分别加入50μl标准阳性血清，用排枪依次往后作2倍倍比稀释，直至第12孔。在第2块板的第1～5排的第1孔，分别加入50μl标准阴性血清，用排枪依次往后作2倍倍比稀释，直至第4孔，第5～8孔为空白对照。最后加入充分摇匀的间接血凝抗原，25μl/孔，将血凝板置于微量振荡器上振荡1～2min，充分混匀，盖上玻璃板，室温或37℃静置1.5～2h。
结果判定：红细胞全部凝集(++++)；75％红细胞凝集(+++)；50％红细胞凝集(++)；25％红细胞凝集(+)；无凝集(-)。
血清稀释倍数1:8出现++以上者判为阳性，并可确定抗体效价；血清稀释倍数1:8出现+以下者判为阴性；以出现++红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
5种不同浓度的抗原致敏红细胞，得到的间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清的结果如表1。
表1不同浓度的抗原制备的间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清
Figure GDA0001803454410000061
由表1可知，CCTCC M 2018116抗原以25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml的终浓度致敏绵羊红细胞，制备的间接血凝抗原检测其对应的标准阳性血清，检出的血清效价分别为1:64、1:256、1:512、1:512和1:512。因此，确定CCTCC M 2018116菌株抗原致敏红细胞的最佳终浓度为100μg/ml～200μg/ml。
根据确定的最佳致敏红细胞抗原量大批量制备间接血凝抗原，致敏、洗涤、最后用稀释液将红细胞悬浮至体积百分比为1％的终浓度，分装至10ml规格的玻璃瓶中，10ml/瓶，保存于4℃。
实施例2实施例1所制备的一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法
1.取出4℃保存的间接血凝抗原，彻底悬浮、混匀，恢复至室温。
2.在110°血凝板1～6排的1～8孔，第7排的1～12孔，第8排的1～8孔各加稀释液50μl。
3.在血凝板1～6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl。用排枪从血凝板1～6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔。在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔。在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次往后作2倍倍比稀释至第4孔，第5～8孔为空白对照。
4.每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μl。
5.血凝板置于微量振荡器上振荡1～2min，充分混匀，盖上玻璃板，室温或37℃静置1.5～
2h。
6.结果判定：红细胞全部凝集(++++)；75％红细胞凝集(+++)；50％红细胞凝集(+
+)；25％红细胞凝集(+)；无凝集(-)。
阳性血清对照1～9孔应呈现++++～++；阴性血清和空白对照应呈现-。
在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔。
血清稀释倍数1:8出现++及以上者判为阳性，并可确定抗体效价；血清稀释倍数1:8出现+及以下者判为阴性。以呈现++的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
实施例3实施例1所制备的一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒的特异性和敏感性检测
用本发明中的试剂盒检测腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的阳性血清，结果均为阴性，表明特异性较好。CCTCC M 2018116菌株间接血凝抗原检测对应的标准阳性血清，如图1所示，检测到的血清效价为1:512，而用琼脂扩散试验检测，如图2所示，检测到的血清效价仅为1:32，说明该试剂盒的敏感性更高。
实施例4实施例1所制备的一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒检测田间样品试验
对采自规模化鸭场的200份鸭血清，用本发明的试剂盒和琼脂扩散试验分别进行检测。结果表明，试剂盒检测到的溶酪大球菌阳性率为48.5％(97/200)，血清效价均在1:16以上；琼脂扩散试验检测到的阳性率为38％(76/200)，两种方法检测结果的符合率为89.5％(179/200)，结果如表2所示。鉴于琼脂扩散试验的敏感性较低，没有进行血清效价检测。
表2本发明的试剂盒与琼脂扩散试验的检测结果
Figure GDA0001803454410000081
以上结果表明，本发明中涉及的溶酪大球菌间接血凝抗原及配套的试剂盒比琼脂扩散试验具有更高的敏感性，能有效检测鸭体内的溶酪大球菌血清抗体，且能判定血清抗体效价。另外，该方法操作简单方便，结果判定直观，可在实际生产中推广应用，开展溶酪大球菌流行病学调查。

Claims (6)

1.一种溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus，MCSD）间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
（1）溶酪大球菌间接血凝抗原；
（2）标准阳性血清；
（3）标准阴性血清；
（4）稀释液；
溶酪大球菌间接血凝抗原是将溶酪大球菌CCTCC M 2018116株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的；所述的用来制备溶酪大球菌间接血凝抗原的溶酪大球菌菌株保存于中国典型培养物保藏中心，菌株编号CCTCC M 2018116。
2.如权利要求1所述的一种溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus，MCSD）间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的溶酪大球菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）静脉采集绵羊红细胞，与灭菌阿氏液混匀并保存，在4℃静置3～5天，使红细胞充分沉淀，然后对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和质量体积百分比为1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液，最后将制备好的绵羊红细胞用磷酸盐缓冲液悬浮至体积百分比为5%的浓度，得到绵羊红细胞悬液；
（2）将溶酪大球菌CCTCC M 2018116株的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；
（3）以步骤（2）得到的用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤（1）得到的绵羊红细胞悬液，得到溶酪大球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为100μg/ml～200μg/ml。
3. 如权利要求1所述的一种溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus，MCSD）间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的标准阳性血清的制备方法为：取−80℃冻存的溶酪大球菌CCTCC M 2018116株的甘油菌，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃，5% CO2箱中培养15～20h，再挑取单菌落接种于5ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18h，然后取2ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养8～10小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml磷酸盐缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用的溶酪大球菌菌液；再将其置于碎冰中，放在超声破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液以6000r/min的速率离心15min，取上清与弗氏完全佐剂等体积混匀，对鸭进行第一次免疫，然后取上清与弗氏不完全佐剂等体积混匀，对鸭进行第二次、第三次免疫，得到分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为标准阳性血清。
4. 如权利要求1所述的一种溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus，MCSD）间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的标准阴性血清的制备方法为：收集体重2～2.5公斤未感染溶酪大球菌的健康樱桃谷鸭的颈动脉血，室温过夜，然后以3000r/min的速率离心15min，取血清即得标准阴性血清。
5. 如权利要求1所述的一种溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus，MCSD）间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液的制备方法为：配制浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1%的兔血清和质量体积百分比为0.01%的叠氮钠，即为稀释液。
6. 如权利要求1～5任意一项所述的一种溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus，MCSD）间接血凝抗体检测试剂盒在检测溶酪大球菌血清抗体效价中的应用。
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