CN109055253B

CN109055253B - 一种副鸡禽杆菌的血凝抑制抗原的制备方法及抗原的应用

Info

Publication number: CN109055253B
Application number: CN201810619345.3A
Authority: CN
Inventors: 孙惠玲; 陈小玲; 程晶; 徐福洲
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: CN109055253A

Abstract

本发明提供了一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原、抗原的制备方法及应用。所述抗原是将副鸡禽杆菌中加入有猪葡萄球菌过滤液处理后制备获得。所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原可用于在检测鸡副鸡禽杆菌抗体中的应用，具体可用于制备血凝试验或血凝抑制试验的试剂及试剂盒及其它免疫学检测方法及试剂。制备的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原稳定、血凝效价高，用于血凝试验和血凝抑制试验时，结果更加稳定、易判，可操作性强。

Description

一种副鸡禽杆菌的血凝抑制抗原的制备方法及抗原的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种副鸡禽杆菌的血凝抑制抗原的制备方法及抗原的应用。

背景技术

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，A.paragallinarum)是鸡传染性鼻炎的病原菌，能够引起鸡的急性上呼吸道传染病。鸡的急性上呼吸道传染病在世界上许多地方都有发生和流行，我国从1980年起就有许多疑似本病的病例出现，首先由冯文达于1987年在北京分离到细菌。该病发生后可引起蛋鸡产蛋量下降，育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，肉鸡肉质下降，造成很大的经济损失。

在现有的副鸡禽杆菌的血清学检测方法中，常采用KSCN/Nacl处理菌体作为抗原，菌体量相同情况下抗原效价低，而且抗原不稳定，存在失去血凝活性的现象，保存期非常短，不经济。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的制备方法，制备的抗原可用于制备检测副鸡禽杆菌血凝抑制抗体的血凝及血凝抑制检测试剂盒，并用于血凝试验和血凝抑制试验的检测。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的制备方法，其包括如下步骤：

S1、培养副鸡禽杆菌获得菌液，

S2、将副鸡禽杆菌菌液离心并用PBS洗涤沉淀，之后用PBS稀释获得副鸡禽杆菌PBS悬浮液，加入猪葡萄球菌滤液，混匀，经一定温度和时间处理；

S3、步骤S2处理后的溶液经离心取沉淀后，用PBS洗涤、稀释，然后冰浴中超声波裂解，之后用100目的金属过滤器过滤留滤液，获得副鸡禽杆菌血凝抑制抗原。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S1中，所述菌液的OD₆₀₀值≥0.9；在步骤S2中，所述离心的速率采用8000×g，离心10min，100mL菌液离心的沉淀用20～30mL PBS悬浮。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述猪葡萄球菌滤液为猪葡萄球菌在LB液体培养基中过夜培养后，待OD₆₀₀值≥1.0收获菌液，离心取上清液用0.22μm滤器过滤后的液体；所述猪葡萄球菌滤液的加入量为所述副鸡禽杆菌PBS悬浮液体积的10％～20％。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述一定温度和时间处理为在37℃震荡1.5～3小时，再4℃作用24～48小时。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述超声波裂解的功率为600W，作用1s，间隔2s，共裂解10min。

进一步，保证副鸡禽杆菌血凝抑制抗原可长期存放，防止污染其它霉菌或变质，优选在所述抗原中加入0.01％硫柳汞。

如上所述的制备方法，优选地，将所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原中加有抗原稳定剂，所述抗原稳定剂中按终浓度体积百分比为3.5％的甘油，按终浓度为质量百分比2.5％的多胨和1％的甘氨酸。本发明在制备好的血凝抑制抗原中添加了不同配方的抗原保护剂，比较了13种抗原保护剂配方，最终确定体积百分比3.5％甘油，质量百分比为2.5％多胨和质量百分比为1％的甘氨酸对抗原的保存效果最佳，4℃保存温度下抗原的保存期可长达24个月。

本发明还提供一种抗原稳定剂，所述抗原稳定剂中包括体积百分比为 3.5％的甘油、质量百分比为2.5％的多胨和1％的甘氨酸。

如上所述制备方法制备获得的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原用于检测鸡副鸡禽杆菌抗体中的应用。

如上所述的应用，包括用于制备检测鸡副鸡禽杆菌抗体的检测试剂及试剂盒，所述检测试剂及试剂盒包括血清学检测方法的试剂及试剂盒，进一步，优选血凝试验或血凝抑制试验的试剂及试剂盒。

如上所述的应用，所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原用于鸡副鸡禽杆菌抗体的血凝抑制试验时，所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原添加有牛血清白蛋白V，在醛化红血球PBS稀释液中添加有tween-20以及牛血清白蛋白V。

一种快速、特异性强、敏感性高的鸡副鸡禽杆菌抗体的血凝抑制抗体检测方法：

S1、将健康非免疫公鸡的红细胞进行醛化，获得10％醛化红细胞和1％醛化红细胞；

S2、被检血清、阳性血清和阴性血清用10％醛化红细胞做1：5稀释，室温下作用4h然后4℃过夜，中间充分振荡，然后1500×g离心5min，取上清即为5倍稀释的被检血清、阳性血清和阴性血清；

S3、5倍稀释的被检血清、阳性血清和阴性血清加入96孔V型微量板的孔中，做2倍系列稀释。

S4、向孔中加入上述制备的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原，充分振荡后静置 40分钟；

S5、继续向所述V型微量板孔中加入步骤S1中所述1％醛化红细胞；混匀后，静置40～60分钟或者37℃静置40分钟，至醛化红细胞对照孔红细胞完全下沉为准；

S6、判断结果：在阳性血清的红细胞平铺于孔底为红细胞完全凝集和阴性血清的红细胞集中在孔底中央呈圆点状的前提下：

阴性：红细胞平铺于孔底为红细胞完全凝集，则被检血清中不含有鸡副鸡禽杆菌抗体；说明被检血清的鸡只没有被鸡副鸡禽杆菌免疫或感染；

阳性：红细胞集中在孔底中央呈圆点状为红细胞凝集被抑制，则被检血清中含有鸡副鸡禽杆菌抗体；说明被检血清的鸡只被鸡副鸡禽杆菌免疫或感染过。

只有在阳性血清会发生红细胞集中在孔底中央呈圆点状为红细胞凝集被抑制和阴性血清的红细胞平铺于孔底为红细胞完全凝集的前提下：说明本发明检测方法准确可靠，如果不符合说明检测试剂有污染或操作不当，检测结果是不可信的，应重新实验检测。

如上所述的方法，所述制备10％醛化红细胞的具体操作为：

S101、采集健康非免疫公鸡的抗凝全血，用生理盐水洗涤沉淀5遍，之后加入磷酸缓冲液配成体积比为10％的红细胞悬液；

S102、取红细胞悬液体积比的5％的戊二醛(50％)，将其用PBS稀释至5％的浓度，在搅拌状态下向10％的红细胞悬液加入5％戊二醛的PBS溶液，在2～8℃持续搅拌2小时；

S103、以1000×g离心10分钟，弃上清，沉淀用PBS清洗3次，然后用PBS将沉淀配成体积比为10％的红细胞悬液，制成10％的醛化红细胞；

S104、用含tween-20和牛血清白蛋白V的PBS缓冲液将10％醛化红细胞稀释为1％醛化红细胞。

本发明在进行血凝试验和血凝抑制试验时，采用的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原PBS稀释液中添加牛血清白蛋白V，在醛化红血球PBS稀释液中添加 tween-20以及牛血清白蛋白V，从试验结果的稳定性方面和结果的易判角度出发，添加这两种成分后血凝试验和血凝抑制试验的结果更加稳定、易判，可操作性强。

本发明的有益效果在于：

与以往检测技术相比，本发明有以下优点：

(1)本发明制备的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原采用猪葡萄球菌滤液处理，这种处理方法可以将副鸡禽杆菌表面的荚膜处理掉，使它的血凝抗原表位充分的暴露于菌体表面，从而表现优异的血凝活性。与现有技术报导的 KSCN/NaCl溶液处理的方法相比，血凝抑制抗原血凝效价高，而且处理后的抗原更稳定。本发明的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原具有血凝活性，能够使鸡醛化红血球发生凝集。在鸡体存在副鸡禽杆菌抗体的情况下，该抗原的凝集鸡醛化红血球的特性可以被抑制。

(2)本发明在进行血凝试验和血凝抑制试验时，采用的血凝抗原PBS 稀释液中添加牛血清白蛋白V，在醛化红血球PBS稀释液中添加tween-20 以及牛血清白蛋白V，使血凝试验和血凝抑制试验中的醛化红血球的沉淀和聚集性更好，从而使血凝抑制试验的结果更加稳定、易判，可操作性强。

(3)本发明制备好的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原添加了独特的抗原稳定剂，使得抗原的保存期从原来的8个月延长至24个月。

附图说明

图1为用KSCN/Nacl、猪葡萄球菌滤液两种方法处理的血凝抑制抗原的 HA试验结果。

图2为在醛化红血球稀释液中添加了tween-20和不添加的HA试验比较结果。

图3为血凝抑制抗原稀释液中添加牛血清白蛋白V与不添加的HA试验结果。

具体实施方式

在实验过程中发现如果只采用超声波裂解的条件进行控制后，菌体破裂的少，超声波作用的目的是使血凝抗原表位充分的暴露于菌体表面，但是这种方法处理的抗原不稳定，随着时间的延长，抗原本身的HA效价会降低，而且有时候很快就失去血凝活性。经大量实验研究发现猪葡萄球菌滤液中处理时因含有的透明质酸酶等有生物活性的酶，可以处理掉副鸡禽杆菌表面遮挡血凝抗原表位的物质，使血凝抗原表位充分的暴露于菌体表面，而且因为是生物因素，这种处理的效果不会发生逆转，因而得到的血凝抗原稳定。

本发明通过细菌培养时间的摸索、抗原稀释液、抗原处理等方法的创新以及抗原保存剂的摸索，研究出一套副鸡禽杆菌血凝抑制抗原制备并保存、血凝和血凝抑制试验中醛化红血球配制的方法，制备的抗原不与其他细菌和病毒诱导产生的抗体发生非特异反应，敏感性高，可实现批量样本的检测。

本发明方法制备的鸡禽杆菌血凝抑制抗原可用于副鸡禽杆菌的血清学的检测方法中，除可用于常规的血清平板凝集试验、琼脂双向扩散试验和间接 ELISA，本发明还建立了血凝抑制(HI)试验方法，与前面所述的方法相比，敏感性和特异性均较高。而且血凝抑制抗体水平和免疫后鸡群对副鸡禽杆菌攻毒的免疫保护率的相关性比较好，可以用来代替攻毒试验来评价免疫效果。

经研究和优化，本发明制备的血凝抑制抗原效价高、稳定性好，血凝和血凝抑制试验简单易判、可操作性强。适用于大规模的监测鸡传染性鼻炎灭活疫苗免疫以后的副鸡禽杆菌抗体。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂为常规试剂。

实施例1副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的制备及保存

1、取副鸡禽杆菌(由北京市农林科学院畜牧兽医实验室提供)，在TSA平皿上划线，置于蜡烛罐里37℃培养16h～28h，待菌落长出。从纯培养的平板上挑取菌落，接种100mL TSB培养基，37℃培养10h～16h，待 OD600≥0.9时收获培养物，将培养物8000×g离心10min，其沉淀用PBS 离心洗涤3次，再用20mL～30mL PBS溶液悬浮，获得副鸡禽杆菌PBS悬浮液。

2、取猪葡萄球菌(由北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供)，在普通肉汤琼脂培养基上划线培养，长出菌落后接种至LB液体培养基过夜培养，待OD600值≥1.0收获培养物，将培养物8000×g离心10min，取上清用0.22μ 滤器过滤，获得滤液即为猪葡萄球菌滤液。过滤的目的是除去猪葡萄球菌。

3、按照副鸡禽杆菌PBS悬浮液体积的15％加入猪葡萄球菌滤液，混匀， 37℃磁力搅拌器上作用3小时，再4℃磁力搅拌器上作用48小时的方法处理副鸡禽杆菌体。

4、处理后的菌液经离心取沉淀后，用PBS洗涤处理沉淀，并用PBS稀释，然后冰浴中超声波裂解，功率为600W，作用1s，间隔2s，共裂解10min。

5、在超声波裂解之后的溶液用100目的金属过滤器过滤获得滤液；以达到抗原的均匀性，之后加入0.01％的硫柳汞，4℃存放3天，即为血凝抑制试所需抗原，即副鸡禽杆菌血凝抑制抗原。该抗原可用于血凝试验、血凝抑制试验或者-20℃保存备用。

实施例2 10％醛化红细胞的制备

1)10％新鲜红细胞的制备采健康非免疫公鸡的红细胞与阿氏液按体积比为1∶1混合，500×g离心后，用生理盐水离心洗涤沉淀5次，每次加入生理盐水至少是红细胞10倍体积用量，每次离心×500g，离心10分钟，将沉淀的红细胞用磷酸缓冲液(PB溶液)配成体积比为10％的红细胞悬液。

2)按照上述红细胞悬液体积的5％的比例准备戊二醛溶液(50％)，首先，用PBS将戊二醛储存液由50％稀释至戊二醛的终浓度为5％，置磁力搅拌器上，边搅拌边加入红细胞悬液中(如红细胞悬液体积为100毫升，那么就取5毫升50％的戊二醛，将其稀释至5％即50毫升)，再置2～8℃持续搅拌2小时使其作用完全。以1000×g离心10分钟，弃上清，沉淀用PBS清洗3次，然后用PBS将沉淀配成体积比为10％的红细胞悬液，制成10％的醛化红细胞。用100目的金属过滤器过滤后分装，加入终浓度为体积比0.01％的叠氮钠防腐，置2～8℃保存。

3)1％醛化红细胞的制备用含tween-20和牛血清白蛋白V的PBS缓冲液将10％醛化红细胞稀释为1％醛化红细胞，现用现配。

其中：阿氏液的配制方法为：

称取20.50g葡萄糖，8.00g柠檬酸钠，0.55g柠檬酸，4.20g氯化钠，溶于900ml去离子水中，搅拌至完全溶解，加去离子水定容至1000ml，115℃ 高压蒸汽灭菌30分钟后，置2～8℃保存。

含tween-20和牛血清白蛋白V的PBS缓冲液的配制方法为：

称取0.1g牛血清白蛋白V，2ml tween-20，溶于100ml PBS缓冲液中，过滤除菌，现用现配。

实施例3副鸡禽杆菌血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验

1、血凝(HA)试验

操作最好在室温20℃～25℃范围内进行，如室温不在此范围内也可以置于37℃温箱中。注意加盖盖子或者封口膜以防止液体蒸发。

1)HA试验操作方法：采用96孔V型微量板进行试验，反应总体积为 75μl。按表1用牛血清白蛋白PBS(缩写为PBSS，其配置方法为：称取0.1g 牛血清白蛋白V，溶于100mlPBS中，过滤除菌，置2～8℃保存。)将实施例1中制备的抗原先进行5倍稀释，然后进行2倍系列稀释，然后加入1％的醛化红细胞，轻轻混匀后，室温(15～25℃)静置40～60分钟或者37℃静置40分钟，至醛化红细胞对照孔红细胞完全下沉为准。具体操作方法见表1。

表1副鸡禽杆菌的HA试验操作术式

2)HA效价判定红细胞平铺于孔底即为红细胞完全凝集；红细胞集中在孔底中央呈圆点状即为红细胞完全不凝集；在孔底中央有红细胞集中呈圆点状，周围有红细胞平铺于孔底即为部分红细胞凝集。使红细胞完全凝集的抗原最大稀释倍数即为该抗原的HA效价。

3)4个HA单位工作抗原液的配制将抗原用牛血清白蛋白PBS稀释至4个HA效价单位(如HA效价为1∶160，则抗原稀释为1∶40)，即为 4个HAU的工作抗原液。

2、HI试验

1)HI试验的血清处理将被检血清、阳性血清和阴性血清用10％醛化红细胞做1：5稀释，室温下作用4h然后4℃过夜，中间充分振荡不少于5 次，然后1500×g离心5min，取上清即为5倍稀释的被检血清、阳性血清和阴性血清。

2)HI试验的操作方法：应用96孔V型微量板进行试验，血凝试验的反应总体积为75μl，利用牛血清白蛋白PBS(PBSS)将上述步骤1)5倍稀释的被检血清、阳性血清和阴性血清进行2倍系列稀释后，加入4HAU的工作抗原液，在室温静置20～30分钟或37℃静置20分钟。再加入1％的醛化红血球，充分振荡混合后，在室温(15～25℃)静置40～60分钟或者37℃静置 40分钟，至红细胞对照孔中红细胞完全下沉为准。试验设抗原对照及醛化红细胞对照，具体操作方法见表2。

表2副鸡禽杆菌型)的HI试验操作术式

3)HI试验成立的条件当抗原对照孔(第11孔)中红细胞完全凝集、醛化红细胞对照孔(第12孔)中红细胞完全下沉，且阳性血清(副鸡禽杆菌免疫血清)的HI效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性血清效价低于1∶ 5时，试验方可成立。

4)HI效价判定若红细胞集中在孔底中央呈圆点状(红细胞完全凝集抑制)时，判为HI阳性；若红细胞平铺于孔底(红细胞完全凝集)或在孔底中央呈圆点状但周围有红细胞平铺于孔底(部分红细胞凝集)时，判为HI 阴性。以完全抑制4HAU抗原血凝活性的最高血清稀释倍数判为该血清的 HI效价。

实施例4用KSCN/Nacl、猪葡萄球菌滤液两种方法处理的血凝抑制抗原的 HA试验

采用实施例1制备的抗原，即猪葡萄球菌滤液处理的血凝抑制抗原，按照实施例3中1所述的步骤进行血凝抑制抗原的HA试验。

作为对比：用KSCN/Nacl处理血凝抑制抗原，具体步骤如下：

(1)、取副鸡禽杆菌HB株，在TSA平皿上划线，置于蜡烛罐里37℃ 培养16h～28h，待菌落长出。从纯培养的平板上挑取菌落，接种100mL TSB 培养基，37℃培养10h～16h，待OD600≥0.9时收获培养物，将培养物8000×g 离心10min，其沉淀用PBS离心洗涤3次，再用硫氰酸钾/氯化钠溶液悬浮，获得副鸡禽杆菌悬浮液。置2～8℃搅拌2～4小时。收集菌体以8000g离心10 分钟，收集菌体沉淀。

(2)、处理后的菌液经离心取沉淀后，用PBS洗涤处理沉淀，并用PBS 稀释，然后冰浴中超声波裂解，功率为600W，作用1s，间隔2s，共裂解 10min。

(3)、加入0.01％硫柳汞，4℃存放3天，即为血凝抑制试所需抗原，即副鸡禽杆菌血凝抑制抗原，该抗原用于血凝试验。其中，硫氰酸钾/氯化钠溶液称取48.59g硫氰酸钾，24.84g氯化钠，溶于900ml灭菌去离子水中，用灭菌去离子水定容至1000ml。置室温(15～25℃)保存。

检测结果如图1所示，图1中，A，B为KSCN/Nacl方法处理的血凝抑制抗原；C，D为猪葡萄球菌滤液方法处理后的血凝抑制抗原。结果是 KSCN/Nacl方法处理的血凝抑制抗原的HA效价为40，猪葡萄球菌滤液方法处理的血凝抑制抗原的HA效价为160，说明采用本发明的猪葡萄球菌滤液方法处理后的抗原的血凝效价明显比KSCN/Nacl方法处理的抗原的血凝效价要高。

实施例5在醛化红血球稀释液中添加了tween-20和不添加tween-20的HA试验比较

本实施例中按照实施例3中用实施例1制备的血凝抑制抗原测定HA 效价的时候，两种不同的稀释液的对比，其中按实施例2中添加有tween-20 进行，作为对比，不添加tween-20进行检测。

A，结果如图2所示，图中A、B两行为在醛化红血球的PBS稀释液中添加了吐温-20，可见添加了吐温-20的前2行的醛化红血球的沉淀性和凝集性更好，结果更加稳定、易判。C，D行为不添加tween-20的醛化红血球的HA试验，可见不添加吐温-20的后2行的醛化红血球的沉淀和凝集性没有前2行好，醛化红血球在凝集的过程中有少量形成沉淀，而且沉淀的红细胞也没有沉降于一点，中间出现空心现象。

实施例6血凝抑制抗原稀释液中添加牛血清白蛋白V与不添加的HA试验

本实施例中按照实施例3中用实施例1制备的血凝抑制抗原测定HA效价的时候，两种不同的稀释液的对比，其中按实施例2中添加有牛血清白蛋白V进行，作为对比，不添加牛血清白蛋白V进行检测。

结果如图3所示，图中1，2，3孔为在血凝抑制抗原稀释液中不添加牛血清白蛋白V，可见不添加牛血清白蛋白时，醛化红血球的凝集不完全，中间有部分醛化红血球发生了沉淀。4，5，6孔为在血凝抗原稀释液中添加牛血清白蛋白V，可见抗原和醛化红血球的凝集很完全，凝集的醛化红血球平铺于孔底，十分均匀。

实施例7副鸡禽杆菌血凝抑制(HI)试验抗原稳定剂的选择

1.按照实施例1制备血凝抗原，按照表3配方添加稳定剂；

2.置于2～8℃保存

3.实施例3中1测HA效价

每隔一定时间将血凝抗原取出，测定抗原的HA效价。

表3不同的稳定剂配方

抗原编号

甘油

蔗糖

明胶

EDTA

多胨

甘氨酸

BSA

蛋白酶抑制剂

PEG2000

1

8％

3％

2

8％

1％

3

8％

0.1％

4

8％

13％

0.1％

5

8％

1％

0.1％

6

2.5％

0.1％

3％

1.5％

7

1％

0.2％

1.2％

0.5％

8

3.5％

2.5％

1％

9

8％

0.05％

10

6.4％

0.05％

0.002％

11

3.2％

0.05％

0.1％

12

4％

0.8％

0.025％

0.2％

13

8％

3％

14

表4添加不同稳定剂的血凝抑制抗原4℃保存不同时间HA效价

从表4能够看出，由于添加了不同的稳定剂，2号、5号、8号、9号、 10号和13号血凝抑制抗原在2～8℃保存时，能够明显延长保存期。其中，5 号、8号和9号抗原在保存30个月时，HA效价仍然能够≥20，但是与新鲜制备的抗原比较，HA效价有所降低。14号抗原为不添加稳定剂的对照，可以看出在保存8个月时，HA效价为40，还可以使用。但保存至12个月时，HA效价降为0。8号抗原在保存24个月时，HA效价仍然能够达到80，与制备出来保持一致，因此，确定8号抗原的稳定剂最佳。而8号抗原的稳定剂含有3.5％的甘油，2.5％的多胨和1％的甘氨酸。

实施例8特异性实验

(1)、将鸡红细胞进行10％及1％的醛化；

具体地：(101)、健康鸡(未被鸡副鸡禽杆菌免疫或感染)的红细胞离心后，用生理盐水洗涤沉淀，之后加入磷酸缓冲液配成体积比为10％的红细胞悬液；

(102)、按照上述红细胞悬液体积的5％的比例准备戊二醛溶液(50％)，首先，用PBS将戊二醛储存液由50％稀释至戊二醛的终浓度为5％，置磁力搅拌器上，边搅拌边加入红细胞悬液中(如红细胞悬液体积为100毫升，那么就取5毫升50％的戊二醛，将其稀释至5％即50毫升)，再置2～8℃持续搅拌2小时使其作用完全；

(103)、以1000×g离心10分钟，弃上清，沉淀用PBS清洗3次，然后用PBS将沉淀配成体积比为10％的红细胞悬液，制成10％的醛化红细胞；

(104)、用含tween-20和牛血清白蛋白的PBS缓冲液将10％醛化红细胞稀释为1％醛化红细胞。

(2)血凝(HA)试验(见实例3)，来检测血凝抑制抗原的HA效价，然后将抗原用牛血清白蛋白PBS稀释至4个HA效价单位(如HA效价为1∶ 160，则抗原稀释为1∶40)，即为4个HAU的工作抗原液。

(3)血凝抑制(HI)试验(见实例3)。被检血清、阳性血清和阴性血清用10％醛化红细胞做1：5稀释，室温下作用4h然后4℃过夜，中间充分振荡不少于5次，然后1500×g离心5min，取上清即为5倍稀释的被检血清、阳性血清和阴性血清；

(4)、将上述被检血清、阳性血清和阴性血清加入96孔V型微量板的孔中，利用牛血清白蛋白PBS(PBSS)将上述步骤5倍稀释的被检血清、阳性血清和阴性血清进行2倍系列稀释后(稀释好的血清体积为25μl)，再加入稀释好的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原25μl，在室温静置20～30分钟或37℃静置20分钟；

(5)、继续向所述V型微量板孔中加入步骤S1中醛化后的红细胞25μl；充分振荡混匀后，静置40～60分钟或者37℃静置40分钟，至醛化红细胞对照孔红细胞完全下沉为准；

(6)、判断结果：

取免疫了马立克疫苗、新支二联疫苗、法氏囊疫苗、禽流感病毒H5亚型疫苗、禽流感H9亚型疫苗、传染性喉气管炎疫苗和鸡传染性贫血疫苗30 份临床鸡血清，用上述副鸡禽杆菌血凝抑制试验方法检测。结果表明除了副鸡禽杆菌血凝抑制对照阳性血清外，其他血样品全部为阴性。

实施例9敏感性实验

取副鸡禽杆菌血凝抑制试验方法检测结果为阳性的鸡血清，稀释不同的比例，用实施例8中的检测方法进行检测。结果：强阳性血清的最高检出限均为1∶1280，对阳性血清的最高检出限均为1∶80，对弱阳性血清的最低检出限均为1∶5。表明该方法的敏感性比较高。

Claims

1.一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、培养副鸡禽杆菌获得菌液；

S2、将副鸡禽杆菌菌液离心并用PBS洗涤沉淀，之后用PBS稀释获得副鸡禽杆菌PBS悬浮液，加入猪葡萄球菌滤液，混匀，在37℃震荡1.5～3小时，再4℃作用24～48小时；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述菌液的OD₆₀₀值≥0.9；在步骤S2中，所述离心的速率采用8000×g，离心10min，100mL菌液离心的沉淀用20～30mL PBS悬浮。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述猪葡萄球菌滤液为猪葡萄球菌在LB液体培养基中过夜培养后，待OD₆₀₀值≥1.0收获菌液，离心取上清液，用0.22μm滤器过滤后的液体；所述猪葡萄球菌滤液的加入量为所述副鸡禽杆菌PBS悬浮液体积的10％～20％。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声波裂解的功率为600W，作用1s，间隔2s，共裂解10min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原中加有抗原稳定剂，所述抗原稳定剂中含终浓度中按体积百分比为3.5％的甘油，含终浓度按质量百分比为2.5％的多胨和1％的甘氨酸。

6.一种含有根据权利要求1-5中任一所述制备方法制备获得的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的检测试剂或检测试剂盒。

7.权利要求1-5中任一所述制备方法制备获得的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原在制备检测鸡副鸡禽杆菌抗体的检测试剂或检测试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原用于鸡副鸡禽杆菌抗体的血凝抑制试验时，所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原添加有牛血清白蛋白V，在醛化红血球PBS稀释液中添加有tween-20以及牛血清白蛋白V。