CN110564699B - 一种新型番鸭腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型番鸭腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法，所述病毒株于2019年7月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201952。本发明基于新型番鸭腺病毒建立相应灭火疫苗的制备方法，利用该方法制备的灭活疫苗能够有效预防和治疗番鸭新型腺病毒病，具有很好的商品化开发前景，解决了当前番鸭新型腺病毒病大规模流行却无有效应对措施的问题，极大减少了由于番鸭新型腺病毒病导致的番鸭养殖业经济损失。

Description

一种新型番鸭腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种新型番鸭腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

禽腺病毒(avian adenovirus)是家禽常见的传染病病原之一。多数禽腺病毒可在健康禽体内存在并复制，不表现临床症状或者非常轻微的症状，但混合感染时腺病毒可成为条件性病原；有时禽腺病毒也可作为原发性病原，并可引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽的临床和病理症候群，包括心包积水、肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病等多种禽类的病症。

鸭(Anas platyrhynchos domestica)源腺病毒包括富AT腺病毒属的鸭源腺病毒A型(DAdV-A)和禽腺病毒属的鸭源腺病毒B型(DAdV-B)。DAdV-A即鸭腺病毒1型(Duckadenovirus type 1，DAdV-1)，又称为产蛋下降综合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)，主要引起蛋鸭产蛋量下降。DAdV-B又称为鸭腺病毒2型(DAdV-2)，该病毒1982年首次报道于法国，感染该病毒的番鸭(Cairna moschata)主要临床表现为消瘦、跛行，直到2014年才利用高通量测序技术获得全基因组序列，随后ICTV将其科学命名为DAdV-B。

近年来，广东、福建、安徽、浙江等番鸭饲养区流行一种以肝脏肿大、表面出血以及颜色变淡为特征的新发疫病，俗称番鸭“白肝病”。经病原的分离鉴定及病毒人工感染试验，初步表明该病病原为不同于DAdV-2的一种新型番鸭腺病毒，有专家将该病毒命名为鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3，DAdV-3)，但该命名尚未被国际病毒分类委员会(ICTV)接受。通过对该新型番鸭腺病毒的流行病学调查，发现该病在我国几乎在所有番鸭养殖区域都有流行，给番鸭养殖业造成较大的经济损失。目前，国内外尚无有效预防和治疗该病的商品化疫苗(或抗体)，研制安全有效的疫苗和抗体迫在眉睫。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种引起雏番鸭白肝病的新型鸭腺病毒株，并利用病毒株制备成灭活疫苗，用于预防番鸭新型腺病毒病的发生，从而弥补现有技术的不足。

本发明技术方案如下：

一种新型番鸭腺病毒株，其中，所述病毒株于2019年7月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201952。

所述的新型番鸭腺病毒株，其中，所述新型番鸭腺病毒株与GenBank数据库中公布的鸭腺病毒2型GR株Hexon基因核苷酸同源性为76.6％。

一种新型番鸭腺病毒灭活疫苗，其中，所述新型番鸭腺病毒灭活疫苗利用如权利要求1或2所述的番鸭新型腺病毒株作为灭活抗原制备得到。

所述的新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：

将预先制备好的番鸭新型腺病毒株毒种接种至培养好的单层LMH细胞中，置37℃5％CO₂条件下继续培养72-96h，当细胞病变达80％以上时收集病毒液；

向收集的病毒液中加入10％甲醛溶液并充分混合，4℃灭活36小时得到灭活的抗原液；

将灭活的抗原液与疫苗佐剂混合乳化，制得灭活疫苗。

所述的新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法，其中，所述番鸭新型腺病毒株毒种的制备：取番鸭新型腺病毒第3代胚毒尿囊液接种于LMH细胞，经LMH细胞传代繁毒5-9代，直至80％以上细胞出现病变，测定该毒株5-9代的病毒含量并选取效价最高代次的毒株作为毒种。

所述的新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法，其中，将预先制备好的番鸭新型腺病毒株毒种按照终浓度1‰-1％的比例接种至培养好的单层LMH细胞中。

所述的新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法，其中，用于接种番鸭新型腺病毒株毒种的LMH细胞的培养方法为：取长至致密单层的LMH细胞，倒掉原培养液，用无菌PBS洗涤细胞后，用0.25％胰酶进行消化，弃去胰酶液，加入含8％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基混匀细胞，细胞按1:4-1:5比例进行传代，37℃、5％CO₂条件下培养至细胞单层。

所述的新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法，其中，将收集的病毒液导入灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％，加甲醛溶液后再导入另一灭活瓶中，4℃灭活36小时得到灭活的抗原液。

所述的新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法，其中，灭活的抗原液制备得到后进行无菌检验和灭活检验，其中，灭活检验是将灭活的抗原液作10倍稀释，接种细胞板上已长满单层的LMH细胞4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2ml；同时设未接种灭活的病毒液作阴性对照，接种未灭活的病毒液作阳性对照，37℃、5％CO₂培养箱培养，观察168小时，将培养物收获反复冻融后盲传1代，继续培养120小时，观察是否出现细胞病变效应。

所述的新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法，其中，所述疫苗佐剂为SEPPIC 71R油佐剂，将灭活的抗原液与SEPPIC 71R油佐剂按3:7比例进行乳化。

所述的新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法，其中，乳化过程为：先开动电机低速搅拌SEPPIC 71R油佐剂2分钟，同时缓缓加入灭活的抗原液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。

有益效果

本发明基于新型番鸭腺病毒建立相应灭火疫苗的制备方法，利用该方法制备的灭活疫苗能够有效预防和治疗番鸭新型腺病毒病，具有很好的商品化开发前景，解决了当前番鸭新型腺病毒病大规模流行却无有效应对措施的问题，极大减少了由于番鸭新型腺病毒病导致的番鸭养殖业经济损失。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCR鉴定新型番鸭腺病毒中的琼脂糖凝胶电泳结果，其中M：Marker 2000bp，1：阴性对照；2-3：病毒培养液。

图2为本发明实施例1新型番鸭腺病毒株对35日龄番鸭的致病性实验中病死番鸭剖检后肝脏照片。

图3为本发明实施例1新型番鸭腺病毒株对35日龄番鸭的致病性实验中病死番鸭剖检后脾脏照片。

图4为本发明实施例1新型番鸭腺病毒株对35日龄番鸭的致病性实验中病死番鸭剖检后胰腺和十二指肠照片。

图5为本发明实施例1新型番鸭腺病毒株对35日龄番鸭的致病性实验中病死番鸭剖检后胆囊照片。

图6为本发明实施例1新型番鸭腺病毒株对35日龄番鸭的致病性实验中病死番鸭剖检后肾脏照片。

图7为本发明实施例2中番鸭新型腺病毒GD MM株5-9代病毒含量测定结果(10ⁿTCID₅₀/0.1ml)。

图8为本发明实施例5中番鸭新型腺病毒灭活疫苗免疫攻毒法检验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

本发明所提供的引起雏番鸭腺病毒病症状的新型番鸭腺病毒，命名为番鸭新型腺病毒GD MM株，于2019年7月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201952。

本发明所提供的新型腺病毒用于制备用于预防雏番鸭白肝病的灭活疫苗。其中的抗原为上述的番鸭新型腺病毒GD MM株。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：番鸭新型腺病毒GD MM株的分离与鉴定

1流行病学调查

自2014年以来，广东、福建、安徽等地区的雏番鸭出现了以肝脏肿大充血、表面有不同程度出血或坏死、质地变脆、肝脏颜色变浅黄化或变白等症状的传染性疾病。该病通常危害1月龄以下番鸭，发病率和死亡率呈现一定的日龄相关性。目前，几乎在所有番鸭养殖区域都有发现该病的流行。经临床调查和实验室检测，初步诊断为新型鸭腺病毒。2018年成功从广东茂名某番鸭场的20日龄发病番鸭群中分离出一株病毒。

2病毒分离：

选取发病症状典型的病死番鸭肝脏、脾脏、肾脏，胰腺等组织50-100g，用研钵研磨组织，按1∶5(w/v)比例加含双抗(含1000U青霉素/ml+1000ug链霉素/ml)的无菌PBS(0.1mol/L，pH值7.2)匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液经0.22um滤器过滤除菌，无菌检验合格后保存备用。将病毒过滤液接种12～13日龄番鸭胚，每胚0.2ml，36-37℃孵育，每日照胚2次，弃去24小时内死亡的番鸭胚，收获24-144小时死亡番鸭胚和144小时存活番鸭胚尿囊液，置2-8℃冷却12-24小时，收获番鸭胚尿囊液及绒毛尿囊膜。将分离得到的番鸭腺病毒经番鸭胚传3代，收获的病毒液置于-80℃冰箱保存。

3病毒的鉴定

3.1血凝性鉴定：

分别无菌采集SPF鸡和鹅血液5ml，按照2015版《中国兽药典》方法分别制备成0.8％、1％和2％浓度的红细胞悬液，4℃保存备用。将收获的番鸭胚病毒液进行HA效价测定，检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。结果表明分离毒不能凝集SPF鸡、鸭、鹅红细胞，即使改变红细胞悬液的浓度，也不能使之凝集，红细胞对照成立。

3.2理化特性检验：

病毒液分别经氯仿、乙醚、丙酮、盐酸(pH3)、氢氧化钠(pH10)、温度(60℃、1小时)处理后，接种LMH细胞，另设空白对照细胞，收毒后检测各组样品的病毒含量。结果：氯仿、丙酮、乙醚对分离毒GD MM的毒价影响较小、盐酸(pH3)和温度(60℃、1小时)不影响病毒效价，表明病毒没有脂质囊膜，对氯仿、丙酮、乙醚有较强抵抗力，且耐酸。而经氧化钠(pH10)处理后，接种LMH细胞，未产生细胞病变效应(CPE)，表明该病毒不耐碱。

3.3PCR鉴定：

取分离株病毒培养液200ul，利用DNA提取试剂盒提取病毒DNA，根据NCBI上公布的鸭腺病毒Hexon基因序列设计PCR引物进行检测。

上游F：5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’

上游R：5’-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3’

PCR反应体系：总体积25ul

在0.5m1PCR管中依次加入：10×Ex Taq Mix 12.5u1，上游引物(20pmol)1u1，下游引物(20pmol)1u1，DNA 2ul。

用灭菌去离子水8.5ul补足至总体积25u1，PCR反应在PTC-100基因扩增仪内进行。PCR反应参数：预变性条件为94℃，3分钟，变性条件为94℃，30秒，退火温度和时间为54℃，30秒，延伸温度为72℃延伸60秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，结果与有目的条带吻合，初步证明分离病毒为鸭腺病毒。

对扩增的Hexon基因进行测序，经NCBI BLAST序列比对分析，分离毒株与GenBank数据库中公布的鸭腺病毒2型GR株(登录号：KJ469653.1)Hexon基因核苷酸同源性为76.6％。

3.4病毒致病性

3.4.1对鸡的致病性：

将GD MM株病毒液通过静脉注射接种7日龄SPF鸡5只，1.0ml/只，观察14日，攻毒组和对照组SPF鸡均健活，无任何临床表现，攻毒后14日剖检，攻毒组和对照组均无明显临床症状。

3.4.2对樱桃谷鸭的致病性：

将GD MM株病毒液经静脉注射接种2日龄雏鸭10只，1.0ml/只，攻毒后对照组鸭表现正常，攻毒组雏鸭出现精神萎靡，攻毒后7d死亡3只鸭子，剖检病死鸭肝脏肿大出血、肝脏颜色变浅，十二指肠出血，脾脏肿大出血，肾脏充血肿大，攻毒后14天对存活鸭子进行剖杀，肝脏出现肿大发黄，肾脏肿大充血的症状。

3.4.3对雏番鸭的致病性：

将GD MM株以肌肉注射途径接种2日龄雏番鸭10只，1.0ml/只，雏番鸭在攻毒后24小时出现喜卧、缩脖、精神萎靡的临床症状，攻毒后36小时陆续出现鸭子死亡，直到攻毒后第5日攻毒组10日鸭子全部死亡，死亡率为100％，剖检病死亡雏番鸭，可见肝脏肿大表现为黄化的现象、质脆、出现不同程度的出血点或者出血斑，脾脏肿大、出血，胆囊肿大，胰腺出血，十二指肠出血，肾脏肿出血。

3.4.4对35日龄番鸭的致病性：

将GD MM株以肌肉注射途径接种35日龄雏番鸭10只，2.0ml/只，番鸭在攻毒后24小时出现喜卧、精神萎靡的临床症状，攻毒后48小时陆续出现鸭子死亡，直到攻毒后第7天攻毒组10只鸭子死亡9只，死亡率为90％，剖检病死亡番鸭，可见肝脏肿大、出现不同程度的出血点或者出血斑(图2)，脾脏肿大、出血(图3)，胰腺出血，十二指肠出血(图4)，胆囊严重肿大(图5)，肾脏肿出血(图6)的临床症状与2日龄雏鸭攻毒症状一致。1日存活的番鸭进行剖杀，肝脏出现肿大出血，脾脏肿大出血，胆囊肿大，肾脏肿出血。

实施例2：番鸭新型腺病毒GD MM株毒种的制备

取番鸭新型腺病毒第3代胚毒尿囊液，经0.22μL滤器过滤后，按培养液3-5％的比例接种于长至单层弃掉原培养液的LMH细胞，37℃吸附1h后弃去病毒液，再加入无牛血清的DMEM/F12病毒维持液，37℃、5％CO₂条件下静置培养72-96h，收获病毒液。经LMH细胞传代繁毒F5-F9代，直至80％以上细胞出现病变，并且病变时间控制在72-96h内收获病毒液。测定该毒株5-9代的病毒含量，结果见图7。将同代次检验无菌的病毒液混合，定量分装，置于-80℃冰箱保存。将效价最高代次的毒用于疫苗的制备。由病毒含量测定结果规定疫苗用毒效价≥10^-6.5TCID₅₀/0.1ml。

实施例3：番鸭新型腺病毒GD MM株抗原的制备

LMH细胞培养：取长至致密单层的LMH细胞，倒掉原培养液，用无菌PBS洗涤细胞后，用0.25％胰酶进行消化，弃去胰酶液，加入适量含8％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基混匀细胞，细胞按1:4-1:5比例进行传代，37℃、5％CO₂条件下培养至细胞单层。

接毒：将上述长满单层的LMH细胞，弃掉原培养液，按终浓度1‰-1％的比例接种LMH细胞，置37℃5％CO₂条件下的培养箱继续培养72-96h。

收毒：接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80％以上时收获病毒液，置-20℃保存。

实施例4：番鸭新型腺病毒GD MM株病毒液的灭活及半成品检验与疫苗的制备

1、灭活：将GD MM株病毒液导入灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。4℃灭活36小时，如有剩余放2-8℃保存，不超过1个月。

2、半成品检验

2.1无菌检验，取灭活的病毒液，按2015年版《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

2.2灭活检验，将灭活后的GD MM株病毒液作10倍稀释，接种已长满单层的LMH细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种灭活的病毒液作阴性对照，接种未灭活的病毒液作阳性对照，37℃、5％CO₂培养箱培养，观察168小时。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时，观察未出现CPE，证明病毒灭活完全。

2.3抗原琼扩效价测定，用直径3mm的金属打孔器按六角形图案打孔或用梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔距离为3mm。中心孔加满番鸭新型腺病毒阳性血清，周围孔加不同稀释度(原倍抗原、1∶2、1∶4、1∶8……)待检抗原。同时设立病毒阳性对照和阴性对照。置37℃恒温培养箱中倒置培养24-48小时，观察结果。

3、灭活疫苗的制备

取灭活的抗原液与SEPPIC 71R油佐剂按3∶7比例进行乳化，先开动电机低速搅拌71R佐剂2分钟，同时徐徐加入抗原液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。

4、分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2-8℃保存。

实施例5

疫苗成品检验

1、性状

外观：乳白色乳剂。

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，应不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相少于0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，结果符合规定。

2、装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检查，结果符合规定。

3、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

4、安全检验：皮下免疫7日龄雏番鸭10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1.0ml，观察21日，试验番鸭生长发育均正常，精神状态良好，剖检注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应，表明上述疫苗安全性良好。

5、疫苗免疫效果检测

5.1血清学方法将疫苗以1.5ml/只的剂量颈部皮下或肌肉注射种番鸭10只，另设不免疫对照10只。免疫后28日，免疫番鸭和对照番鸭分别采血，分离血清，用琼脂免疫扩散试验法测定血清抗体效价，记录抗体结果。

5.2免疫攻毒法将疫苗以1.5ml/只的剂量颈部皮下注射种番鸭，另设不免疫作对照。免疫后1-2月，收集种蛋，孵化出雏番鸭，对1日龄雏番鸭10只进行攻毒，同时设不免疫对照子代1日龄雏番鸭10只作为对照。所有免疫番鸭和对照番鸭子代，肌肉注射病毒液0.5ml/只(病毒含量10^7.5TCID50/0.1ml)。观察并详细记录免疫番鸭和对照番鸭子代的发病情况。

结果显示，3批疫苗免疫种番鸭后，免后28天，琼扩抗体效价均能达到10/10以上阳性，而对照未免疫番鸭，琼扩抗体效价均为阴性；子代1日龄雏番鸭母源抗体高，攻毒后3批疫苗免疫番鸭子代观察14日，试验免疫组番鸭全部存活，剖检只有1只鸭子出现肝脏轻微肿大，颜色稍微变浅，各试验组番鸭保护数均不少于9只；对照番鸭攻毒全部发病，死亡9只，死亡番鸭和攻毒后14天存活番鸭子进行剖杀，均可见肝脏肿大表现为黄化的现象、质脆、出现不同程度的出血点或者出血斑，脾脏肿大、出血，胆囊肿大，胰腺出血，十二指肠出血，肾脏肿出血等典型病变。详见图8。

综上，本发明筛选的新型番鸭腺病毒GD MM株疫苗是一种免疫效果比较理想的灭活苗，免疫种番鸭后，使子代的母源抗体提升，能够有效的预防子代雏番鸭新型腺病毒感染的发生。

本发明所筛选的病毒，其制备的番鸭腺病毒疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的灭活疫苗对番鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种新型番鸭腺病毒灭活疫苗，其特征在于，所述新型番鸭腺病毒灭活疫苗利用命名为番鸭新型腺病毒GD MM株的番鸭新型腺病毒株作为灭活抗原制备得到，所述番鸭新型腺病毒GD MM株于2019年7月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201952，所述番鸭新型腺病毒GD MM株与GenBank数据库中公布的鸭腺病毒2型GR株Hexon基因核苷酸同源性为76.6％，用于制备番鸭腺病毒灭活疫苗的番鸭新型腺病毒GD MM株的病毒效价≥10^-6.5TCID₅₀/0.1ml，用于制备番鸭腺病毒灭活疫苗的制备方法具体包括以下步骤：

番鸭新型腺病毒GD MM株的制备：取番鸭新型腺病毒第3代胚毒尿囊液，经0.22μL滤器过滤后，按培养液3-5％的比例接种于长至单层弃掉原培养液的LMH细胞，37℃吸附1h后弃去病毒液，再加入无牛血清的DMEM/F12病毒维持液，37℃、5％CO2条件下静置培养72-96h，收获病毒液,经LMH细胞传代繁毒F5-F9代，直至80％以上细胞出现病变，并且病变时间控制在72-96h内,收获病毒液,测定该毒株5-9代的病毒含量，将同代次检验无菌的病毒液混合，定量分装；

LMH细胞培养：取长至致密单层的LMH细胞，倒掉原培养液，用无菌PBS洗涤细胞后，用0.25％胰酶进行消化，弃去胰酶液，加入含8％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基混匀细胞，细胞按1:4-1:5比例进行传代，37℃、5％CO₂条件下培养至细胞单层；

接毒和收毒：将利用番鸭新型腺病毒GD MM株的制备方法获得的病毒效价≥10^{- 6.5}TCID₅₀/0.1ml的番鸭新型腺病毒GD MM株病毒接种至培养好的单层LMH细胞中，置37℃5％CO₂条件下继续培养72-96h，当细胞病变达80％以上时收集病毒液；

病毒液灭活：将收集的病毒液导入灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％，加甲醛溶液后再导入另一灭活瓶中，4℃灭活36小时得到灭活的抗原液；

无菌检验和灭活检验：灭活的抗原液制备得到后进行无菌检验和灭活检验，其中，灭活检验是将灭活的抗原液作10倍稀释，接种细胞板上已长满单层的LMH细胞4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2ml；同时设未接种灭活的病毒液作阴性对照，接种未灭活的病毒液作阳性对照，37℃、5％CO₂培养箱培养，观察168小时，将培养物收获反复冻融后盲传1代，继续培养120小时，观察是否出现细胞病变效应；

灭活疫苗的制备：取灭活的抗原液与SEPPIC 71R油佐剂按3∶7比例进行乳化，先开动电机低速搅拌71R佐剂2分钟，同时徐徐加入抗原液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。

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