CN104789499A - 一种鸡白痢琼扩抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

一种鸡白痢琼扩抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡白痢琼扩抗原及其制备方法和应用，属于兽医诊断技术领域。该抗原是将鸡白痢沙门氏菌菌种SP8441和SP9905分别复苏传代后制成种子菌液，再将种子菌液接种固体培养基增殖，离心去除培养液后，通过裂解液提取细菌蛋白，制成鸡白痢琼扩抗原。本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，制成的鸡白痢琼扩抗原产品具有敏感性高、特异性强的优点，可以简化鸡白痢的净化流程，扩大检测应用范围，是一种较为理想的检测鸡白痢的琼扩抗原。

Description

一种鸡白痢琼扩抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于兽医诊断技术领域，尤其涉及一种鸡白痢琼扩抗原及其制备方法和应用。
背景技术
鸡白痢是家禽养殖中危害最严重的细菌性传染病，其病原为鸡白痢沙门氏菌，该病可经卵垂直传播，也可经呼吸道、消化道、眼结膜以及破损的皮肤伤口等途径水平传播。鸡白痢沙门氏菌感染后，可以在宿主体内长期存活，直至性成熟后在卵巢、输卵管、睾丸等性器官定殖，并产生持续高水平的凝集抗体，因此在种鸡性成熟后采用鸡白痢凝集抗原检测全血（血清），淘汰阳性鸡，可以切断病原垂直传播途径。但在生产实际中，使用鸡白痢凝集抗原进行检疫净化仍存在缺陷之处，如凝集抗原检测结果为弱阳性的个体，仍需间隔2-3周后进行再次检疫，不仅增加了饲养成本，延长了净化时间，同时也增加了疾病水平传播的风险；由于鸡白痢沙门氏菌感染青年鸡后不能在体内大量繁殖，通常不产生高水平的凝集抗体，导致凝集抗原对青年鸡的检测效果不甚理想，不利于疾病的早期诊断；使用凝集抗原对卵黄进行检测时，存在敏感度低、诊断速度慢、凝集图像不够清晰等缺点，限制了凝集抗原在外来引进鸡种种蛋检疫等领域方面的应用。由此可见，上述问题的存在严重影响到鸡白痢检疫净化的效果，导致检疫后的种鸡群不能达到彻底净化的目标，给养殖者造成了严重的经济损失。
发明内容
本发明旨在提供一种用于特异性检测鸡白痢沙门氏菌感染的琼扩抗原。本发明的另一目的在于提供该琼扩抗原的制备方法。
本发明原理是从历年来收集、保存的500余株自然病例所分离的鸡白痢沙门氏菌菌种中，经多年反复筛选验证后获得的2株不同亚型的、抗原性好的鸡白痢沙门氏菌菌种SP9905（标准型）和SP8441（变异型）作为琼扩抗原生产菌种，采用特定培养基增菌后，通过优选的细菌裂解缓冲液快速、温和地提取菌体蛋白，制成可溶性的琼扩抗原。该抗原可以有效缩短种鸡鸡白痢的检疫净化周期，还可以开展青年鸡的早期检疫，鸡白痢卵黄抗体的检测等，解决了鸡白痢凝集抗原存在的诸多缺陷，提升了鸡白痢的检疫净化效果。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种鸡白痢琼扩抗原，由鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905制成，所述的SP8441（Salmonella pullorum SP8441）、SP9905（Salmonella pullorum SP9905）已于2014年10月15日在中国典型培养物保藏中心（中国.武汉.武汉大学）保藏，名称及鉴别特征：鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum），株号：SP8441，保藏编号：CCTCC NO.M 2014477；鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum），株号：SP9905，保藏编号：CCTCC NO.M 2014478。
本发明提供了该鸡白痢琼扩抗原的制备方法，具体步骤如下：
1）种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养24h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；
2）细菌培养：将种子菌液按培养基体积的2.0%接种固体扁瓶培养基，经37℃培养24h后取出，用无菌生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，经4000r/min离心15min去除上清，再用无菌生理盐水重新悬浮菌泥，用调整比浊度方法将SP8441和SP9905的菌液浓度均调整至每毫升1.0×1010CFU，按比例混合；
3）抗原制备：将上述混合菌液冻融1次后与细菌裂解缓冲液等体积充分混合，4℃作用1h，12000r/min离心20min取上清液，无菌分装制成鸡白痢琼扩抗原。
所述鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905的菌液体积比为4:6。
所述液体培养基组成为：蛋白胨12g、酵母粉6.0g、水解酪蛋白5.0g、甘油8.0ml、硫代硫酸钠7.5g、单盐酸半胱氨酸0.8g、硫酸镁1.0g、硫酸锌1.2g、柠檬酸钠2.0g、磷酸二氢铵0.8g、磷酸氢二钾1.5g、海藻糖3.0g、去氧胆酸钠0.5g、蒸馏水1000ml。
所述的固体培养基通过液体培养基中加入1.5%的纯化琼脂粉制成。
所述细菌裂解缓冲液组成为：氯化钠16g、氯化钾0.4g、磷酸二氢钾0.54g、磷酸氢二钠2.84g、聚乙二醇对异辛基苯基醚10ml、脱氧胆酸6g、二硫苏糖醇1g、甘油15.0ml、十二烷基磺酸钠2g、焦磷酸钠5g、苯甲基磺酰氟0.4g、抑肽酶0.05g、亮抑酶肽0.02g、胃蛋白酶抑制剂0.002g、蒸馏水1000ml。
本发明还公开了上述所述的鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905。
本发明的另一目的在于提供了鸡白痢琼扩抗原在鸡白痢检测试剂中的用途。
本发明的有益效果为：本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，选用的鸡白痢琼扩抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的鸡白痢琼扩抗原产品具有产量高、敏感性高、特异性强、凝集图像清晰的优点，不仅可以有效缩短鸡白痢检疫净化周期，还可用于鸡白痢早期检疫或卵黄抗体检测，具有较好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
1）分离纯化与染色镜检
鸡白痢沙门氏菌SP8441株于1984年12月从北京市某鸡场的6月龄白来航蛋鸡输卵管中分离所得。其具体分离方法为：无菌剪取输卵管一小段加入营养肉汤中37℃过夜培养，再接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。挑取直径为1.0mm-2.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
鸡白痢沙门氏菌SP9905株于1999年5月从江苏省扬州市某鸡场的11月龄狼山鸡盲肠内容物中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集盲肠内容物加入亚硒酸盐胱氨酸增菌液中37℃过夜培养，再接种麦康凯琼脂37℃培养24小时，挑取直径为0.5mm-1.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
2）生化鉴定
从马丁琼脂平板上挑取菌落，进行生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照说明书进行操作。结果菌株的各项生化指标（见表1）均符合鸡白痢沙门氏菌生化特性。
表1 鸡白痢沙门氏菌生化鉴定结果
菌株 靛基质 尿素 氰化钾 赖氨酸 鸟氨酸 甘露醇 山梨醇
SP9905 - - - + + + -
SP8441 - - - + + + -
菌株 水杨苷 丙二酸盐 ONPG 卫矛醇 葡萄糖 麦芽糖 乳糖
SP9905 - - - - + + -
SP8441 - - - - + - -
菌株 蔗糖 阿拉伯糖 伯胶糖 鼠李糖 酒石酸 硫化氢 运动性
SP9905 - + + + - + -
SP8441 - + + + - - -
    3）血清学分型
    从马丁琼脂平板上挑取菌落至生理盐水中，用比浊法调整细菌浓度至每毫升1.0×1010CFU，采用玻片凝集的方法对菌株进行血清学分型鉴定。具体操作方法如下：取洁净玻片1张，用微量移液器吸取25μl 沙门氏菌阳性血清（除O122和O123购自中国兽医药品检查所外，其余血清均购自丹麦哥本哈根国立血清研究所）滴于载玻片上，另吸取25μl 生理盐水做对照，然后吸取25μl菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀。轻轻摇动载玻片，2min 后判定结果。检测结果如表2：SP9905为标准型，SP8441为变异型。
表2 鸡白痢沙门氏菌血清学分型结果
菌株 A-F O1 O2 O4 O7 O8 O9
SP9905 ++++ ++ - - - - +++
SP8441 ++++ - - - - - +++
菌株 O10 O11 O15 O19 O122 O123  
SP9905 - - - - + ++++  
SP8441 - - - - ++++ +  
注：“++++”代表100%凝集，“+++”代表75%凝集，“++”代表50%凝集，“+”代表25%凝集，“-”代表未发生凝集。
结合具体实施例说明上述鸡白痢琼扩抗原制备及其应用效果。
A. 培养基和试剂配置
液体培养基组成为：蛋白胨12g、酵母粉6.0g、水解酪蛋白5.0g、甘油8.0ml、硫代硫酸钠7.5g、单盐酸半胱氨酸0.8g、硫酸镁1.0g、硫酸锌1.2g、柠檬酸钠2.0g、磷酸二氢铵0.8g、磷酸氢二钾1.5g、海藻糖3.0g、去氧胆酸钠0.5g、蒸馏水1000ml。
固体培养基通过液体培养基中加入1.5%的纯化琼脂粉制成。
细菌裂解缓冲液组成为：氯化钠16g、氯化钾0.4g、磷酸二氢钾0.54g、磷酸氢二钠2.84g、聚乙二醇对异辛基苯基醚10ml、脱氧胆酸6g、二硫苏糖醇1g、甘油15.0ml、十二烷基磺酸钠2g、焦磷酸钠5g、苯甲基磺酰氟0.4g、抑肽酶0.05g、亮抑酶肽0.02g、胃蛋白酶抑制剂0.002g、蒸馏水1000ml。
B. 该鸡白痢琼扩抗原的制备
1）种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养24h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；
2）细菌培养：将种子菌液按培养基体积的2.0%接种固体扁瓶培养基，经37℃培养24h后取出，用无菌生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，经4000r/min离心15min去除上清，再用无菌生理盐水重新悬浮菌泥，用调整比浊度方法将SP8441和SP9905的菌液浓度均调整至每毫升1.0×1010CFU，按比例混合；
3）抗原制备：将上述混合菌液冻融1次后与细菌裂解缓冲液等体积充分混合，4℃作用1h，12000r/min离心20min取上清液，无菌分装制成鸡白痢琼扩抗原
实施例2
将鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905菌种分别经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养24h，挑选典型菌落制备种子菌液。将种子菌液按培养基体积的2.0%接种固体扁瓶培养基，经37℃培养24h后用无菌生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，经4000r/min离心15min去除上清，再用无菌生理盐水重新悬浮菌泥，用调整比浊度方法将SP8441和SP9905的菌液浓度均调整至每毫升1.0×1010CFU，按体积比4:6混合。将混合菌液冻融1次后与细菌裂解缓冲液等体积充分混合，4℃作用1h，12000r/min离心20min取上清液，无菌分装制成鸡白痢琼扩抗原。
选取366只28周龄海兰蛋鸡，采用本发明研制的鸡白痢琼扩抗原与商品化的鸡白痢凝集试验抗原（购自青岛易邦生物工程有限公司）同时进行全血琼脂扩散试验与全血平板凝集试验，所有鸡只全部剖检进行细菌分离，结果见表3。
由表3可见，用本发明研制的鸡白痢琼扩抗原对海兰蛋鸡的判定结果为阳性45只，阴性321只，而凝集抗原的判定结果为阳性42只，可疑18只，阴性306只，且凝集抗原检测阳性或阴性的鸡只与琼扩抗原检测结果一致，但凝集抗原判定可疑的18只蛋鸡在通过琼扩抗原检测发现有3只阳性，15只为阴性。进一步研究发现，两种抗原都判定为阳性或阴性的鸡只，其剖检细菌分离鉴定结果也与之符合，而凝集抗原判定可疑的18只蛋鸡，其细菌分离鉴定结果与琼扩判定结果一致（实际为3只阳性，15只阴性）。上述结果表明，用本发明方法制备的琼扩抗原检测效果优于商品化凝集抗原。根据阳性反应率和细菌分离结果计算，本发明研制的鸡白痢琼扩抗原的敏感性与特异性均为100%（敏感性=真阳性/真阳性+假阴性；特异性=真阴性/真阴性+假阳性）。
表3鸡白痢琼扩抗原与凝集抗原的检测结果比较
琼脂扩散试验：出现沉淀线判为阳性，未出现沉淀线判为阴性；平板凝集试验：凝集效价为“++++”或“+++”判为阳性，“++”或“+” 判为可疑，“-”判为阴性。
实施例3
按实施例2所述制备方法制成的鸡白痢琼扩抗原，对8-13周龄的苏禽黄鸡、京粉蛋鸡、海兰蛋鸡、绿壳蛋鸡、仙居鸡进行全血琼脂扩散试验，同时使用商品化的鸡白痢凝集试验抗原（购自青岛易邦生物工程有限公司）进行全血平板凝集试验，并将所有鸡只全部剖检进行细菌分离，结果见表4。
由表4可见，在检测的492只青年鸡中，琼扩抗原判定的阳性鸡有60只，且细菌分离率达100%，显著高于凝集抗原的阳性检测率（P<0.05）。上述结果表明，用本发明方法制备的琼扩抗原对不同品种的青年鸡具有良好的检测效果。根据阳性反应率和细菌分离结果计算，本发明研制的鸡白痢琼扩抗原对青年鸡的敏感性与特异性均为100%。
表4鸡白痢琼扩抗原与凝集抗原对不同品种青年鸡的检测结果
实施例4
选取35只已开产海兰蛋鸡，收集其所产蛋，用新洁尔灭擦拭蛋壳表面消毒后无菌吸取卵黄，使用实施例2所述制备方法制成的鸡白痢琼扩抗原进行卵黄琼脂扩散试验，同时使用商品化的鸡白痢凝集试验抗原（购自青岛易邦生物工程有限公司）进行卵黄平板凝集试验，并将所有鸡只全部剖检进行细菌分离，结果见表5。
由表5可见，琼扩抗原的卵黄检测结果有6只为阳性，其余均为阴性，该结果与剖检细菌分离鉴定结果一致。而凝集抗原仅有2只检测阳性，另有9只判定可疑，24只阴性，该结果与细菌分离鉴定结果存在较大误差。因此，本发明研制的鸡白痢琼扩抗原更适应于卵黄检疫。
表5鸡白痢琼扩抗原与凝集抗原对卵黄检测效果的比较
注：P代表阳性，S代表可疑，N代表阴性。
实施例5
选取385只32周龄的海兰蛋鸡，使用商品化的鸡白痢凝集试验抗原（购自青岛易邦生物工程有限公司）进行全血平板凝集试验，淘汰阳性反应鸡，可疑鸡用实施例一所述制备方法制成的鸡白痢琼扩抗原进一步筛查并淘汰阳性反应鸡。其后每间隔3周后，再用上述流程检疫一次，共检疫3次，最后将存活鸡全部剖杀，进行细菌分离鉴定。
检疫结果见表6，使用凝集抗原与琼扩抗原相结合的检测方法，在第一次检疫后即可将鸡群的鸡白痢阳性率降至零检出的理想效果，通过第二批和第三批检疫均未发现阳性个体，剖检细菌分离鉴定结果为零检出。上述实验表明，在鸡白痢检疫净化中使用本发明研制的鸡白痢琼扩抗原，不仅可以提高阳性检出率，还可以缩短检疫净化周期，全面提升了鸡白痢的检疫净化效果。
表6鸡白痢琼扩抗原与凝集抗原的临床检疫净化

Claims (7)

1.一种鸡白痢琼扩抗原，其特征在于：由鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905制成，所述的鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905均已于2014年10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为：CCTCC NO.M 2014477和CCTCC NO.M 2014478。
2.权利要求1鸡白痢琼扩抗原的制备方法，其特征在于：包括步骤如下：
1）种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养24h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；
2）细菌培养：将种子菌液按培养基体积的2.0%接种固体扁瓶培养基，经37℃培养24h后取出，用无菌生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，经4000r/min离心15min去除上清，再用无菌生理盐水重新悬浮菌泥，用调整比浊度方法将SP8441和SP9905的菌液浓度均调整至每毫升1.0×1010CFU，按比例混合；
3）抗原制备：将上述混合菌液冻融1次后与细菌裂解缓冲液等体积充分混合，4℃作用1h，12000r/min离心20min取上清液，无菌分装制成鸡白痢琼扩抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述液体培养基组成为：蛋白胨12g、酵母粉6.0g、水解酪蛋白5.0g、甘油8.0ml、硫代硫酸钠7.5g、单盐酸半胱氨酸0.8g、硫酸镁1.0g、硫酸锌1.2g、柠檬酸钠2.0g、磷酸二氢铵0.8g、磷酸氢二钾1.5g、海藻糖3.0g、去氧胆酸钠0.5g、蒸馏水1000ml；
所述的固体培养基通过液体培养基中加入1.5%的纯化琼脂粉制成；
所述细菌裂解缓冲液组成为：氯化钠16g、氯化钾0.4g、磷酸二氢钾0.54g、磷酸氢二钠2.84g、聚乙二醇对异辛基苯基醚10ml、脱氧胆酸6g、二硫苏糖醇1g、甘油15.0ml、十二烷基磺酸钠2g、焦磷酸钠5g、苯甲基磺酰氟0.4g、抑肽酶0.05g、亮抑酶肽0.02g、胃蛋白酶抑制剂0.002g、蒸馏水1000ml。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述鸡白痢沙门氏菌SP8441和SP9905的菌液体积比为4:6。
5.权利要求1所述的鸡白痢琼扩抗原在鸡白痢检测试剂中的应用。
6.权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌SP8441。
7.权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌SP9905。
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