CN113265358B - 鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原及其制备方法和应用，制备方法为分别将鸡白痢沙门氏菌C79‑1和鸡滑液囊支原体GX11‑T复苏传代后制成种子菌液，再接种相应培养基扩大培养，收获，分别经甲醛溶液灭活，浓缩，两种菌液按一定体积配比，加入终浓度为质量分数为3％的结晶紫溶液染色和体积分数为10％的甘油，混匀分装即得。本发明工艺方法简单合理，成本低，稳定性好，制备的双重平板凝集抗原经一次反应同时可检测两种疫病抗体，具有敏感性高，诊断快速，特异性强，凝集效果易于观察等优点，显著节约检测时间和检测费用，临床可用于鸡白痢和鸡滑液支原体两种抗体快速检测，淘汰病鸡，实现疾病净化。

Description

鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及兽医诊断技术领域，尤其涉及一种鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原，还涉及该双重平板凝集抗原的制备方法和应用。
背景技术
鸡白痢是由沙门氏菌引起的一种严重危害养鸡业发展的细菌性传染病。各品种和日龄鸡均可感染，成年鸡感染后症状轻微，仅表现为一过性生产性能下降，雏鸡受到的危害更严重，发病后，死亡率高。可水平传播，也能垂直传播。雏鸡感染多为种源垂直感染引起，通过定期检测种鸡，淘汰带菌鸡，降低垂直传播风险，实现种源净化，培育无鸡白痢鸡群可显著降低雏鸡发病率。目前，种鸡白痢检测净化主要采用平板凝集试验，全群阳性率不超过0.1％视为合格。
鸡滑液囊支原体是禽支原体中重要的致病性菌之一，在我国分布广泛，传染性强，感染鸡与火鸡后引起滑液囊支原体病。临床表现主要为渗出性关节滑膜炎和腱鞘炎，产蛋下降，传染性强，易与多种病原混合感染，各品种和日龄鸡均可感染。近年来临床发病率增高，给养殖业造成了巨大的经济损失。鸡滑液囊支原体对多种抗生素敏感，对外界抵抗力弱，但易产生耐药性。鸡群感染后，很难彻底清除。一年四季均可发病，冬春季节多发。当前疫苗及药物控制效果不佳。该病可水平传播也能垂直传播。同鸡白痢一样，鸡滑液囊支原体病也可以通过种源传播，通过淘汰阳性鸡只，可切断病原传播途径。最经济实用的阳性鸡筛选方式为平板凝集试验，鸡群通过多次检测实现净化。当前尚无商品化鸡滑液囊支原体病平板凝集诊断抗原，更无鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原；本发明的目的之二在于提供一种该双重平板凝集抗原的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种该双重平板凝集抗原的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原，由鸡白痢沙门氏菌C79-1和鸡滑液囊支原体GX11-T制成，所述鸡白痢沙门氏菌C79-1和鸡滑液囊支原体GX11-T均在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为CVCC 79207、CVCC2960。
本发明优选的，所述鸡白痢沙门氏菌C79-1和鸡滑液囊支原体GX11-T的菌液体积比为2:3。
本发明优选的，所述鸡白痢沙门氏菌C79-1的菌液浓度为1.0×1010CFU/mL；所述鸡滑液囊支原体GX11-T的菌液浓度为1.0×1011ccu/mL。
2、所述的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原的制备方法，包括以下步骤：
a)制备鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原；
b)制备鸡滑液囊支原体GX11-T抗原；
c)将步骤a)中制备的鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原和步骤b)中制备的鸡滑液囊支原体抗原按2:3体积配比，加入染色剂，加入保护剂，均质分装保存。
本发明优选的，步骤a)中制备鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原的方法为：
(1)将鸡白痢沙门氏菌C79-1菌种经复苏繁殖获得种子菌液；
(2)种子菌液扩大培养并灭活；
(3)灭活菌液加入2倍量的体积分数为95％乙醇，沉淀，离心弃上清，沉淀物重悬。
本发明中更为优选的，步骤a)制备鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原的方法具体为：
(1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌C79-1菌种经TSB液体培养基复苏繁殖后，接种TSA固体平板培养基，37℃培养20h后用马丁液体培养基洗下菌苔，扩大培养后，再按5.0％体积比例接种含有马丁肉汤培养基的发酵罐中发酵培养；所述固体平板培养基通过液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成；
(2)细菌培养：经37℃高密度发酵培养18h后，收获菌液，活菌计数，加入甲醛至终浓度为体积分数0.3％，37℃灭活24h；
(3)抗原制备：灭活菌液中加入2倍量的体积分数95％乙醇，沉淀3d，弃去部分上清，剩余部分8 000r/min离心10min弃去上清，沉淀物用体积分数为1％甲醛生理盐水重悬，调整菌液浓度为1.0×1010CFU/mL。
本发明优选的，步骤b)中制备鸡滑液囊支原体GX11-T抗原的方法为：
(1)将鸡白痢沙门氏菌C79-1菌种经复苏繁殖获得种子菌液；
(2)种子菌液连续增菌扩大培养后灭活；
(3)灭活菌液离心，重悬。
本发明更为优选的，步骤b)中制备鸡滑液囊支原体GX11-T抗原的方法具体为：
(1)种子菌液的制备：将鸡滑液囊支原体GX11-T菌种用鸡滑液囊支原体基础培养基稀释后，按10％的量接种于鸡滑液囊支原体基础培养基，置37℃培养24～48h收获后作为一级种子液，将一级种子液按1:10的比例再接种传代1次，收获后作为二级种子液；所述鸡滑液囊支原体基础培养基各组分浓度如下：PPLO粉22g/L、水解乳蛋白6g/L、酵母浸出粉3～7g/L、烟酰胺0.4g/L、质量浓度为0.5％的酚红溶液2ml/L；除菌猪血清150～200mL/L和青霉素终浓度为1000IU/mL，pH7.6～7.8；
(2)细菌培养：采用机械搅拌发酵罐大规模发酵培养鸡滑液囊支原体：先在发酵罐中加入鸡滑液囊支原体基础培养基各组分，并进行灭菌，温度降至37℃左右时，按1:10的比例接种体二级种子液，NaOH调pH7.6～7.8，采用连续增菌培养方式，37℃恒温培养，罐压为0.03～0.05Pa，溶氧量为40％，待pH下降至6.5时，添加鸡滑液囊支原体基础培养基为原培养体积的30％，用NaOH调pH7.6～7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6.4时，留样检验，加甲醛溶液至终浓度为体积分数0.3％，灭活24h；
(3)抗原制备：将灭活菌液经8 000r/min离心20min，弃去上清，用体积分数为1％甲醛生理盐水重悬，调整菌液浓度为1.0×1011CFU/mL。
本发明中，步骤c)为：将步骤a)中制备的鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原和步骤b)中制备的鸡滑液囊支原体抗原按2:3体积配比，再按体积比1:10加入质量分数3％结晶紫溶液染色，以7000r/min均质3分钟，然后加入甘油至终浓度体积分数为10％的，继续均质4分钟，充分混匀，无菌分装即制成鸡白痢和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原。
3、所述的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原在制备鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体检测试剂中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原及其制备方法和应用，本发明工艺方法简单合理，成本低，稳定性好，制备的双重平板凝集抗原经一次反应同时可检测两种疫病抗体，具有敏感性高，诊断快速，特异性强，凝集效果易于观察等优点，显著节约检测时间和检测费用，临床可用于鸡白痢和鸡滑液支原体两种抗体快速检测，淘汰病鸡，实现疾病种源净化。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为鸡白痢沙门氏菌平板凝集阳性和阴性结果；
图2为鸡滑液囊支原体平板凝集阳性和阴性结果；
图3为鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原特异性实验结果(1：鸡沙门氏菌阳性血清、2：鸡滑液囊支原体阳性血清、3：鸡大肠菌阳性血清、4：鸡葡萄球菌阳性血性、5：副鸡嗜血杆菌阳性血清、6：鸡新城疫阳性血清，7：禽流感阳性血清、8：鸡传染性支气管炎阳性血清、9：鸡腺病毒阳性血清)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原的制备
本实施例中提到的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原，由鸡白痢沙门氏菌C79-1和鸡滑液囊支原体GX11-T制成，鸡白痢沙门氏菌菌种C79-1和鸡滑液囊支原体菌种GX11-T均在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为：CVCC79207和CVCC2960。
鸡白痢沙门氏菌抗原通过以下方法制备：
(1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌C79-1菌种经TSB液体培养基复苏繁殖后，接种TSA固体平板培养基，37℃培养18h，挑选典型菌落接种TSA固体斜面培养基，37℃培养20h后用马丁液体培养基洗下菌苔，在马丁肉汤培养基中扩大培养后，再以发酵液总量5.0％接种到含有马丁肉汤培养基的发酵罐发酵培养,所述固体平板培养基通过液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成；
(2)细菌培养：经37℃高密度发酵培养18h后，收获菌液，活菌计数，加入甲醛至终浓度为体积分数0.3％，37℃灭活24h；
(3)抗原制备：灭活菌液中加入2倍量的体积分数为95％乙醇，沉淀3d，弃去部分上清，剩余部分8000r/min离心10min弃去上清，沉淀物用体积分数为1％甲醛生理盐水重悬，调整菌液浓度为1.0×1010CFU/mL。
鸡滑液囊支原体抗原通过以下方法制备：
(1)种子菌液的制备：将鸡滑液囊支原体GX11-T菌种用鸡滑液囊支原体基础培养基稀释后，按10％的量接种于鸡滑液囊支原体基础培养基，置37℃培养24-48小时收获后作为一级种子液，将一级种子液按1:10的比例再接种传代1次收获作为二级种子液；所述鸡滑液囊支原体基础培养基成分为：PPLO粉22g、水解乳蛋白6g、酵母浸出粉3～7g、烟酰胺0.4g、质量浓度为0.5％的酚红溶液2mL、去离子水800mL，高压灭菌备用；使用时加入滤过除菌的150～200mL猪血清和1000单位/mL青霉素，并加入20％NaOH调pH7.6～7.8。
(2)细菌培养：采用机械搅拌发酵罐大规模发酵培养鸡滑液囊支原体：先在发酵罐中加入鸡滑液囊支原体基础培养基各组分，并进行灭菌，温度降至37℃左右时，按1:10的比例接种体二级种子液，20％NaOH调pH7.6～7.8，采用连续增菌培养方式，37℃恒温培养，罐压为0.03～0.05MPa，溶氧量为40％，待pH下降至6.5时，添加基础培养基为原培养体积的30％，用20％NaOH调pH 7.6～7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6.4时，留样检验，测定菌体浓度，加入甲醛至终浓度为体积分数0.3％，灭活24h。
(3)抗原制备：将灭活菌液经8 000r/min离心20min，弃去上清，用体积分数为1％甲醛生理盐水重悬，调整菌液浓度为1.0×1011ccu/mL。
取上述制备的浓度为1.0×1010CFU/mL鸡白痢沙门氏菌C79-1灭活菌液菌体和浓度为1.0×1011ccu/mL鸡滑液囊支原体灭活菌液菌体，二者按2:3体积配比，再按体积比1:10加入质量分数为3％结晶紫溶液染色，以7000r/min均质3分钟，然后加入甘油至最终浓度为体积分数10％，继续均质4分钟，充分混匀，无菌分装即制成鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原。
实施例2、鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原使用方法
使用前30min自冰箱取出鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原、阴性或阳性血清与待检血清，使其达到室温。用移液器吸取充分混匀的诊断抗原一滴(0.025mL～0.05mL)，垂直滴于玻璃板上，然后迅速在抗原旁边滴加同量的被检血清一滴(0.025mL～0.05mL)。混合均匀血清与抗原，涂布成直径为1cm～2cm的片状，不断摇动玻璃板，2min内观察结果。试验应在20℃～25℃条件下进行。每批试验应设阳性血清与阴性血清对照。
结果判定：在2min内出现50％(++)以上凝集者为阳性，2min内不凝集(一)者为阴性，介于上述两者之间为可凝，凝集判读标准见表1。
表1血清平板凝集试验判读标准
Figure BDA0003083685790000051
鸡白痢沙门氏菌平板凝集阳性和阴性结果如图1所示，鸡滑液囊支原体平板凝集阳性和阴性结果如图2所示。
实施例3、鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原特异性实验
将制备的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原分别与鸡沙门氏菌阳性血清、鸡滑液囊支原体阳性血清、鸡大肠菌阳性血清、鸡葡萄球菌阳性血性、副鸡嗜血杆菌阳性血清、鸡新城疫阳性血清，禽流感阳性血清、鸡传染性支气管炎阳性血清、鸡腺病毒阳性血清等进行平板凝集反应，结果如图3所示，仅鸡沙门氏菌阳性血清、鸡滑液囊支原体阳性血清有凝集反应，其余均为阴性。
实施例3、鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原临床应用
用自制抗原检测某公司提供的50份自然感染鸡血清，同时以商品化鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集抗原(购自山东绿都生物科技有限公司)和实施例1制备的双重抗原为对照，进行玻片凝集试验，按照判定标准进行结果判定。结果显示，鸡白痢沙门氏菌抗体阳性11份，鸡滑液囊支原体抗体阳性8份，自制抗原与商品化抗原平板凝集检测结果一致，符合率为100％，说明本发明方法制备双重平板凝集抗原反应时间快，凝集图像清晰，可用于临床鸡血清样品检测。
实施例4、不同体积配比的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原的凝集实验
参照实施例1的方法制备鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原，区别在于鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体灭活菌液的体积配比不同，不同体积配比的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原的凝集实验结果见表2。
表2不同体积配比的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原的凝集实验
Figure BDA0003083685790000061
结论：上述结果表明鸡白痢沙门氏菌与鸡滑液囊支原体体积比为2:3时能够同时检测鸡白痢沙门氏菌与鸡滑液囊支原体，并且凝集实验阳性信号最强。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原，其特征在于：由鸡白痢沙门氏菌C79-1和鸡滑液囊支原体GX11-T制成，所述鸡白痢沙门氏菌C79-1和鸡滑液囊支原体GX11-T均在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为CVCC 79207、CVCC2960；所述鸡白痢沙门氏菌C79-1和鸡滑液囊支原体GX11-T的菌液体积比为2：3；所述鸡白痢沙门氏菌C79-1的菌液浓度为1.0×1010CFU/mL；所述鸡滑液囊支原体GX11-T的菌液浓度为1.0×1011ccu/mL。
2.权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)制备鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原；
b)制备鸡滑液囊支原体GX11-T抗原；
c)将步骤a)中制备的鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原和步骤b)中制备的鸡滑液囊支原体抗原按2:3体积配比，加入染色剂，加入保护剂，均质分装保存。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤a)制备鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原的方法为：
(1)将鸡白痢沙门氏菌C79-1菌种经复苏繁殖获得种子菌液；
(2)种子菌液扩大培养并灭活；
(3)灭活菌液加入2倍量的体积分数为95％乙醇，沉淀，离心弃上清，沉淀物重悬。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)制备鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原的方法具体为：
(1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌C79-1菌种经TSB液体培养基复苏繁殖后，接种TSA固体平板培养基，37℃培养20h后用马丁液体培养基洗下菌苔，扩大培养后，再按5.0％体积比例接种含有马丁肉汤培养基的发酵罐中发酵培养；所述固体平板培养基通过液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成；
(2)细菌培养：经37℃高密度发酵培养18h后，收获菌液，活菌计数，按加入甲醛至终浓度为体积分数0.3％，37℃灭活24h；
(3)抗原制备：灭活菌液中加入2倍量的体积分数为95％乙醇，沉淀3d，弃去部分上清，剩余部分8 000r/min离心10min弃去上清，沉淀物用体积分数为1％甲醛生理盐水重悬，调整菌液浓度为1.0×1010CFU/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中制备鸡滑液囊支原体GX11-T抗原的方法为：
(1)将鸡滑液囊支原体GX11-T菌种经复苏繁殖获得种子菌液；
(2)种子菌液连续增菌扩大培养后灭活；
(3)灭活菌液离心，重悬。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中制备鸡滑液囊支原体GX11-T抗原的方法具体为：
(1)种子菌液的制备：将鸡滑液囊支原体GX11-T菌种用鸡滑液囊支原体基础培养基稀释后，按10％的量接种于鸡滑液囊支原体基础培养基，置37℃培养24～48h收获后作为一级种子液，将一级种子液按1:10的比例再接种传代1次，收获后作为二级种子液；所述鸡滑液囊支原体基础培养基各组分浓度如下：PPLO粉22g/L、水解乳蛋白6g/L、酵母浸出粉3～7g/L、烟酰胺0.4g/L、质量浓度为0.5％的酚红溶液2ml/L；除菌猪血清150～200mL/L和青霉素终浓度为1000IU/mL，pH7.6～7.8；
(2)细菌培养：采用机械搅拌发酵罐大规模发酵培养鸡滑液囊支原体：先在发酵罐中加入鸡滑液囊支原体基础培养基各组分，并进行灭菌，温度降至37℃左右时，按1:10的比例接种体二级种子液，NaOH调pH7.6～7.8，采用连续增菌培养方式，37℃恒温培养，罐压为0.03～0.05Pa，溶氧量为40％，待pH下降至6.5时，添加鸡滑液囊支原体基础培养基为原培养体积的30％，用NaOH调pH7.6～7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6.4时，留样检验，加甲醛溶液至终浓度为体积分数0.3％，灭活24h；
(3)抗原制备：将灭活菌液经8 000r/min离心20min，弃去上清，用体积分数为1％甲醛生理盐水重悬，调整菌液浓度为1.0×1011CFU/mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤c)为：将步骤a)中制备的鸡白痢沙门氏菌C79-1抗原和步骤b)中制备的鸡滑液囊支原体抗原按2:3体积配比，再按体积比1:10加入质量分数为3％结晶紫溶液染色，以7000r/min均质3分钟，然后加入甘油至终浓度体积分数为10％，继续均质4分钟，充分混匀，无菌分装即制成鸡白痢和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原。
8.权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体双重平板凝集抗原在制备鸡白痢沙门氏菌和鸡滑液囊支原体检测试剂中的应用。
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