CN113061549B

CN113061549B - 一种禽霍乱凝集抗原及其制备方法

Info

Publication number: CN113061549B
Application number: CN202110350248.0A
Authority: CN
Inventors: 龚建森; 张笛; 董永毅; 窦新红; 徐步; 许明; 沈海玉; 俞燕; 祁克宗; 苗晋锋
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-03-31
Also published as: CN113061549A

Abstract

本发明公开了一种禽霍乱凝集抗原及其制备方法，其由禽多杀性巴氏杆菌P1215灭活制成，所述禽多杀性巴氏杆菌P1215(Pasteurella multocida P1215)保藏编号：CCTCC NO:M2021196，保藏于中国典型培养物保藏中心。属于兽医诊断技术领域。本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，选用的禽霍乱凝集抗原生产菌种抗原性好、变异率低，无自凝反应，制成的抗原具有敏感性高、特异性强、反应快速、凝集图像清晰等优点，既可用于禽霍乱的临床快速诊断，也可用于禽霍乱疫苗的免疫效力评估，是一种较为理想的禽霍乱检测试剂。

Description

一种禽霍乱凝集抗原及其制备方法

技术领域

本发明属于兽医诊断技术领域，涉及一种禽霍乱凝集抗原及其制备方法。

背景技术

禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌引起的禽接触性传染病，该病以出血性败血症为特征，发病禽死亡率高达60％～100％，是家禽主要细菌性传染病。目前对禽霍乱的临床诊断通常根据病死禽的发病症状进行判断，但该病与新城疫、鸭瘟等病极易混淆，与传染性鼻炎、禽伤寒、传染性滑膜炎等也极为相似，因而容易造成误诊，进而延误疾病治疗，给养殖者带来严重的经济损失。随着近年来国家对养殖中抗生素使用的管控愈加严格，禽霍乱在养禽场的发病与流行情况较为严重，造成的损失非常可观。

血清学检测是疫情监测、疫情确诊、防疫水平检测中十分常用的方法，具有准确、快速、微量、便于操作等特点，在各级重大动物疫病防控及大群动物检疫、监测工作中普遍使用。目前我国对于禽霍乱的血清学检测方法通常依据中华人民共和国农业行业标准中的“禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术NY/T563-2016”中所述的琼脂扩散实验。但琼脂扩散实验存在费时耗力、敏感性低、判定困难、检测用途窄(不适用于水禽检疫)等缺陷，达不到临床快速批量检测的要求。而对于血清学检测中常用的平板凝集试验，其对检测抗原具有较高要求，采用传统方法制备的凝集抗原在实际应用中普遍存在敏感度低、诊断速度慢、凝集图像不够清晰等缺陷，不能满足临床检疫的要求。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种禽霍乱凝集抗原，该抗原由禽多杀性巴氏杆菌P1215制成。禽多杀性巴氏杆菌P1215是从历年来收集、保存的300余株自然病例所分离的禽多杀性巴氏杆菌菌种中，经多年反复筛选验证后获得的1株抗原性好、变异率低、无自凝反应的禽多杀性巴氏杆菌菌种。

禽多杀性巴氏杆菌P1215(PasteurellamultocidaP1215)已于2021年3月1日送中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)保藏，名称及鉴别特征：禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)，株号：P1215，保藏编号：CCTCCNO:M2021196。

本发明的第二个目的是提供一种禽霍乱凝集抗原的制备方法，包括如下具体步骤：

将禽多杀性巴氏杆菌P1215菌种经复苏传代后制成种子菌液，再将种子菌液培养增殖，用甲醛充分灭活，经结晶紫染色后制成禽霍乱凝集抗原。

在本发明的一个优选实施方式中，所述制备方法包括如下具体步骤：

(1)将禽多杀性巴氏杆菌P1215菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种于固体平板培养基，培养后挑选典型菌落接种固体斜面培养基，培养后经纯粹检查合格后作为种子菌液；

(2)将种子菌液接种扁平固体培养基，培养后，收集菌液，用含甲醛的枸橼酸钠生理盐水洗菌后，用比浊法调整细菌浓度，置4-8℃过夜灭活；

(3)将含结晶紫的枸橼酸钠生理盐水溶液加入上述灭活菌液中，每隔2-4h加一次，共加三次，混匀后于放置充分染色后，无菌分装制成禽霍乱检测抗原。

在一个优选实施方式中，所述制备方法是指：

(1)将禽多杀性巴氏杆菌P1215菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种于固体平板培养基，37℃培养24h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养24h后经纯粹检查合格后作为种子菌液；

(2)将种子菌液接种扁平固体培养基，37℃培养48h后，收集菌液，用含0.25％甲醛的枸橼酸钠生理盐水洗菌后，用比浊法调整细菌浓度至每毫升1.3×10¹⁰CFU，置4℃过夜灭活；

(3)将含1.5％结晶紫的枸橼酸钠生理盐水溶液按1：10加入上述灭活菌液中，每隔3h加一次，共加三次，混匀后于37℃放置24h充分染色后，无菌分装制成禽霍乱检测抗原。

所述液体培养基组成为：胰酪蛋白胨4.5g、蛋白示3.0g、大豆蛋白胨2g、酵母浸出粉2.5g、水解乳蛋白1.0g、硫酸镁0.6g、硫酸亚铁0.2g、磷酸氢二钾1.0g、葡萄糖3.0g、硫代硫酸钠5g、鸡血红素1ml(灭菌后加入)、小牛血清10ml(灭菌后加入)、蒸馏水1000ml。液体培养基中加入2％的纯化琼脂粉制成固体培养基。

所述枸橼酸钠生理盐水组成为：枸橼酸钠5g、氯化钠8.5g、蒸馏水1000ml。

本发明另一方面还涉及禽多杀性巴氏杆菌P1215(Pasteurella multocidaP1215)及其在制备禽霍乱检测抗原中的应用。

本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，选用的禽霍乱检测抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的禽霍乱检测抗原产品具有敏感性高、特异性强、诊断快速、凝集图像清晰的优点。本发明所筛选的P1215菌种传代后具有极低的的变异率，并且制成的抗原无自凝反应。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

将12株禽多杀性巴氏杆菌冻干菌种分别经液体培养基复苏繁殖后，在人工培养基上不加选择地连续传递数50代，每传递10代通过固体培养一次，并随意选择100个单菌落，观察、记录菌落形态。统计每传递10代后，菌落型的变异率。结果见表1，由表可见12株禽多杀性巴氏杆菌菌种在连续传代10次后，仅有4个菌株开始出现少量变异；传代20次后，只有4株未发生变异；传代30次后，仅P1215一个菌种未发生变异；传代40次后，所有菌种都出现变异，其变异率为2％-20％；传代50次后，变异率扩大至7％-27％，其中变异率最高是CU菌株(27％)，变异率最低的是P1215菌株(7％)。上述结果表明，本发明所筛选的禽多杀性巴氏杆菌P1215抗原生产菌种具有较好的遗传稳定性。

表1禽多杀性巴氏杆菌传代后的菌落型变异率测定

将上述12株禽多杀性巴氏杆菌接种扁平固体培养基，37℃培养48h后，收集菌液，用含0.25％甲醛的枸橼酸钠生理盐水洗菌后，用比浊法调整细菌浓度至每毫升1.0×10¹⁰CFU，置4℃过夜灭活后制成凝集抗原。将不同菌种制成的抗原与生理盐水混合，在室温条件下分别于1min、2min、3min、4min和5min后观察是否出现凝集反应。结果可见(表2)，12个菌种中，仅C48-1、P1059和P1215未出现自凝现象，其余9个菌种在与生理盐水混合1-3min后均出现了不同程度的凝集现象。

表2禽多杀性巴氏杆菌自凝性测定

根据上述实验结果表明，本发明所筛选的P1215菌种传代后具有极低的的变异率，并且制成的抗原无自凝反应。

实施例2

将禽多杀性巴氏杆菌P1215菌种分别经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养24h，挑选典型菌落制备种子菌液。将种子菌液按培养基体积的4.0％接种固体扁瓶培养基，经37℃培养48h后用含有0.25％甲醛的的枸橼酸钠生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，置4℃过夜灭活；将灭活菌液经离心去上清，再用含0.25％甲醛的枸橼酸钠生理盐水重新悬浮菌泥，比浊法调整细菌浓度至每毫升1.3×10¹⁰CFU，置4℃过夜灭活。将含1.5％结晶紫的枸橼酸钠生理盐水溶液按1：10加入上述灭活菌液中，每隔3h加一次，共加三次，混匀后于37℃放置24h充分染色后，无菌分装制成禽霍乱检测抗原。

实施例3

按实施例2所述制备方法制成的禽霍乱检测抗原，对禽霍乱阳性血清(IDEXX)、J亚型禽白血病阳性血清(IDEXX)、禽流感病毒H5亚型阳性血清(北京中海)、新城疫阳性血清(北京中海)、鸡白痢鸡伤寒阳性血清(北京中海)、鸡传染性法氏囊病阳性血清(北京中海)、沙门氏菌阳性血清O多价A-F(宁波天润)、沙门氏菌阳性血清O4(宁波天润)、沙门氏菌阳性血清O9(宁波天润)、大肠杆菌阳性血清OK多价1(宁波天润)、志贺氏菌多价阳性血清(宁波天润)、霍乱弧菌O多价阳性血清(宁波天润)、SPF鸡阴性血清(北京中海)、禽霍乱免疫血清15份(自制)进行平板凝集试验，判定结果以“++++”、“+++”、“++”、“+”分别代表100％、75％、50％和25％凝集，“-”表示无凝集反应发生。检测结果如表3所示，由表可知该禽霍乱抗原仅与禽霍乱阳性血清及15份禽霍乱免疫血清发生凝集反应，而与其它阳性血清及SPF鸡阴性血清不反应，表明该抗原具有较好的特异性。

表3禽霍乱凝集抗原特异性试验

实施例4

按实施例2所述制备方法制成禽霍乱检测抗原(实验抗原)，同时参考专利200510027332.X所述方法制成用于检测效果比对的禽霍乱检测抗原(对照抗原)。使用实施例3中的15份禽霍乱免疫血清，分别用实验抗原与对照抗原测定不同血清的平板凝集反应效价(以++++、+++、++、+、-表示)；凝集反应时间，以0.5(凝集反应在0.5min内出现)、1(凝集反应在1min内出现)、2(凝集反应在2min内出现)、＞2(凝集反应在2min后出现)表示；凝集图像清晰度，以“c”(表示反应底液澄清)，“m”(表示反应底液浑浊)来表示，检测结果详见表4。

由表可见，用本发明方法制备的实验抗原阳性检出率为100％(15/15)，高于对照抗原的阳性检出率80.0％(12/15)；在凝集反应时间方面，实验抗原在0.5min、1min、2min内出现凝集反应的分别占60％(9/15)、20％(3/15)、20％(3/15)，在1min内完全凝集的比例达80％，没有出现2min后凝集的血清。而对照抗原在0.5min、1min、2min内出现凝集反应的分别占20％(3/15)、33.3％(5/15)、26.7％(4/15)，另外还有20％(3/15)血清在2min后凝集；在凝集图像清晰度方面，实验抗原没有出现反应底液浑浊的现象，而对照抗原则有33.3％(5/15)血清反应底液浑浊。上述结果表明，在平板凝集效价、凝集反应时间和凝集图像清晰度方面，用本发明方法制备的抗原检测效果明显优于对照抗原。

表4不同凝集抗原的检测效果比较

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种禽霍乱凝集抗原，其由禽多杀性巴氏杆菌P1215灭活制成，所述禽多杀性巴氏杆菌P1215（Pasteurella multocida P1215）保藏编号：CCTCC NO:M2021196，保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.根据权利要求1所述的禽霍乱凝集抗原，所述抗原无自凝反应。

3.权利要求1-2任意一项所述禽霍乱凝集抗原的制备方法，其特征是包括如下步骤：将禽多杀性巴氏杆菌P1215菌种经复苏传代后制成种子菌液，再将种子菌液培养增殖，用甲醛充分灭活，经结晶紫染色后制成禽霍乱凝集抗原。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

（1）将禽多杀性巴氏杆菌P1215菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种于固体平板培养基，培养后挑选典型菌落接种固体斜面培养基，培养后经纯粹检查合格后作为种子菌液；

（2）将种子菌液接种扁平固体培养基，培养后，收集菌液，用含甲醛的枸橼酸钠生理盐水洗菌后，用比浊法调整细菌浓度，置4-8℃过夜灭活；

（3）将含结晶紫的枸橼酸钠生理盐水溶液加入上述灭活菌液中，每隔2-4h加一次，共加三次，混匀后于放置充分染色后，无菌分装制成禽霍乱检测抗原。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述枸橼酸钠生理盐水组成为：枸橼酸钠5g、氯化钠8.5g、蒸馏水1000ml。

6.由权利要求3-5任何一项所述制备方法所制备得到的禽霍乱凝集抗原。

7.权利要求1、2或6所述的禽霍乱凝集抗原在制备禽霍乱检测试剂中的用途。

8.禽多杀性巴氏杆菌P1215（Pasteurella multocida P1215），所述禽多杀性巴氏杆菌P1215（Pasteurella multocida P1215）保藏编号：CCTCC NO:M2021196，保藏于中国典型培养物保藏中心。

9.权利要求8所述的禽多杀性巴氏杆菌P1215（Pasteurella multocida P1215）在制备禽霍乱检测抗原中的应用。