CN110317749B - 一株牛支原体强毒株及其应用 - Google Patents

一株牛支原体强毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供牛支原体强毒株及其应用，属于微生物技术领域。本发明牛支原体强毒株，分类命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株，中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)保藏号为M2019235。该毒株能够诱导包括气喘、明显肺部实变等多种牛支原体感染典型临床病症，对牛的肺部具有很强的侵袭力，其活菌滴度高，毒力强，致病性高，病牛排菌时间长，发病快，攻毒后肺部毒株再次分离率高，可用于建立具有典型病症的牛支原体发病模型，符合牛场临床发病特征，因此本发明牛支原体强毒株具有良好的实际应用之价值。

Description

一株牛支原体强毒株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株牛支原体强毒株及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
牛支原体(Mycoplasma bovis)为引起犊牛支原体肺炎的主要病原之一。犊牛感染牛支原体后主要临床特征为气喘，剖检可见患病牛肺部出现明显的实变，这是牛支原体肺炎的典型特征。该病在世界范围内广泛流行，我国近几年呈上升趋势，给养牛业造成了重大损失。
目前，发明人发现，国内外关于牛支原体疫苗或强毒株的报道较少，这主要是以下两个方面：一方面，牛支原体对营养要求苛刻，体外分离培养的难度大，这限制了其病原学、免疫学和致病机制等相关研究的开展。另一方面，牛支原体疫苗的研发对于牛支原体肺炎的防控有重要的意义，但目前尚未见牛支原体强毒株的报道，大多数分离株纯培养物攻毒后难以诱使牛只发病，无法评价疫苗效力，阻碍了牛支原体疫苗的开发。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供一株牛支原体强毒株16M，该毒株能够诱导包括气喘、明显肺部实变等多种牛支原体感染典型临床病症，对牛的肺部具有很强的侵袭力，其活菌滴度高，毒力强，致病性高，病牛排菌时间长，发病快，攻毒后肺部毒株再次分离率高，可用于建立具有典型病症的牛支原体发病模型，符合牛场临床发病特征，因此本发明牛支原体强毒株具有良好的实际应用之价值。
本发明的第一个方面，提供一株牛支原体强毒株，分类命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCC NO:M2019235。
本发明的第二个方面，提供所述牛支原体16M株在建立牛支原体攻毒发病模型中的应用。
进一步的，所述应用具体为将所述牛支原体攻毒发病模型用于牛支原体疫苗效力检验中。
本发明的第三个方面，提供一种用于评估牛支原体疫苗效力的攻毒制剂，所述攻毒制剂含有牛支原体16M株。
本发明的第四个方面，提供一种评估牛支原体疫苗效力的方法，使用上述攻毒制剂感染牛支原体疫苗免疫过的牛，进而评估疫苗免疫效力。
本发明的第五个方面，提供上述牛支原体16M株在制备预防和/或治疗牛支原体感染引起的疾病的药物中的应用。
本发明的有益技术效果：
本发明首次提供一株牛支原体强毒株，经攻毒试验证明，使用牛支原体16M株培养物进行攻毒50天后，感染牛有明显的气喘症状，剖检后牛肺脏病变，本发明牛支原体16M株滴度高，毒力强，致病性高，排菌时间长，发病快，攻毒后肺部毒株再次分离率高，可作为牛支原体疫苗效力检验中攻毒材料，用于疫苗或治疗药物研发工作涉及的攻毒试验，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1牛支原体16M株菌落形态图(4×物镜)。
图2为本发明实施例1中牛支原体特异性PCR检测电泳图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，发明人发现，国内外关于牛支原体疫苗或强毒株的报道较少，主要是由于牛支原体对营养要求苛刻，体外分离培养的难度大，同时大多数分离株纯培养物攻毒后难以诱使牛只发病，无法评价疫苗效力，阻碍了牛支原体疫苗的开发。
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一株牛支原体强毒株，分类命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCC NO:M2019235。
所述牛支原体16M株为环状、球状、丝状和点状多形态微生物，无细胞壁，革兰氏染色阴性。其菌落为煎蛋样菌落，菌落直径约为100μm～200μm；经生理、生化及基因测序比对鉴定，确定该菌株为牛支原体(Mycoplasma bovis)。
本发明牛支原体强毒株可诱发包括气喘、明显肺部实变等多种牛支原体感染典型临床病症，与其他报道的牛支原体菌株相比更加符合牛场临床发病特征，所建立的发病模型更具有代表性；同时，其毒力强，致病性高，排菌时间长，发病快，其攻毒每头牛只需用2×l010CFU纯培养物即可发病，比一些报道使用感染细胞培养物更加纯净，所需滴度更低，从而更加有利于人工发病模型的建立和广泛应用。
本发明又一具体实施方式中，提供所述牛支原体16M株在建立牛支原体攻毒发病模型中的应用；所述应用具体为将所述牛支原体攻毒发病模型用于牛支原体疫苗效力检验中。
本发明又一具体实施方式中，采用所述牛支原体16M株纯培养物进行攻毒，所述牛支原体强毒株纯培养物的活菌滴度至少为4×109CCU/mL。
本发明的又一具体实施方式中，牛支原体16M株采用PPLO肉汤培养基进行培养得牛支原体16M株纯培养物，更进一步的，牛支原体16M株培养基组分如下：PPLO肉汤培养基21g/L，10倍MEM培养液10mL/L，葡萄糖3g/L，丙酮酸钠2g/L，酵母浸出物2g/L，健康马血清200mL/L，青霉素30万单位/L，质量百分浓度为1％的酚红碱性溶液(0.1M NaOH溶液)2mL/L，pH值至7.5±0.2。
本发明的又一具体实施方式中，所述牛支原体16M株纯培养物的培养条件为：在37±1℃培养2d。通过筛选优化培养基和培养条件，牛支原体16M株繁殖速度快，活菌滴度高，可达到4×109CCU/mL。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于评估牛支原体疫苗效力的攻毒制剂，所述攻毒制剂活性成分为牛支原体16M株。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种评估牛支原体疫苗效力的方法，使用上述攻毒制剂感染牛支原体疫苗免疫过的牛，进而评估疫苗免疫效力。
所述感染途径包括但不限于滴鼻、腹腔、肺内和气管内注射；最优选为滴鼻，感染方法简单，可操作性强。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述牛支原体16M株在制备预防和/或治疗牛支原体感染引起的疾病的药物中的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
其中，PPLO肉汤、酵母浸出物均购自美国BD公司，10倍MEM培养液购自美国Gibco公司，马血清购自hyclone公司，其他成分均购自国药公司。
牛支原体强毒株培养物制备过程中采用的1L培养基所含成分如下：PPLO肉汤培养基21g，10倍MEM培养液10mL，酵母浸出物2g，健康马血清200mL，青霉素30万单位，质量百分浓度为1％的酚红碱性溶液(0.1M NaOH溶液)2mL，pH值至7.5±0.2。
牛支原体固体培养基，即在牛支原体增菌液体培养基中添加终浓度为1％(质量百分浓度)的琼脂。
实施例1:牛支原体16M株的获得及培养鉴定
1.菌株分离及克隆纯化
从山东某牛场有气喘等特征的犊牛中进行筛选，选取牛支原体肺炎特征典型的病牛，宰杀剖检后采集其肺脏病变部位，并及时送实验室进行分离鉴定。将实变的肺组织剪碎至云雾状后，加入1ml培养基，震荡10s，4000rpm离心15min。小心吸取上清液，经0.45μm滤膜过滤后加入9mL培养基中37±1℃培养3～5日。待培养基颜色由红色变为黄色且培养基透明，取2ml培养基提取DNA，通过生化鉴定、特异性PCR和16s rRNA测序，鉴定分离菌为牛支原体。将菌液接种至固体培养基上，克隆纯化3次，第3次克隆收获的培养物即为第1代菌种，命名为16M株。
2. 16M株的特性
2.1形态特征
16M株为环状、球状、丝状和点状多形态微生物，无细胞壁，革兰氏染色阴性。其菌落为煎蛋样菌落，菌落直径约为100μm～200μm，见图1。
2.2生化特性
需要胆固醇试验：16M株仅在有血清的培养物中生长，在无血清培养基中不生长，表明16M株生长需要胆固醇。
葡萄糖发酵：16M株在含0.5％葡萄糖的培养基中培养，培养基未变色，表明其不能发酵葡萄糖培养基产酸；
精氨酸水解试验：16M株在含0.2％精氨酸的培养基中培养，培养基未变色，表明其不能水解精氨酸产碱。
生化特性说明，16M株符合细菌分类学中牛支原体的特征。
2.3培养特性
16M株在增菌液体培养基上生长良好，37℃培养3天，培养物pH下降至6.6，无明显浑浊。培养物中活菌滴度可以达到4×109CCU/mL，而牛支原体标准株PG45的活菌滴度为8×108CCU/mL，说明该菌株培养滴度显著高于标准株。16M株接种至固体培养基，37℃培养5日后，可见煎蛋样菌落，菌落大小为10～20μm。
2.4分子生物学鉴定
根据文献报道，采用牛支原体特异性检测引物(上游引物序列：TTACGCAAGAGAATGCTTCA，SEQ ID NO.1，下游引物序列：TAGGAAAGCACCCTATTGAT，SEQ ID NO.2)，以16M株总DNA为模板，进行特异性PCR检测。16M株与牛支原体16s rRNA基因的同源性为99.9％，结合特异性PCR检测结果(见图2)，显示16M株为牛支原体。
将16M株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏信息如下：
分类命名：牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株；
地址：中国.武汉.武汉大学；
保藏日期：2019年4月4日；
保藏编号为CCTCC NO:M2019235。
实施例2牛支原体16M株培养物攻毒试验与评价
采用牛支原体增菌液体培养基分别培养牛支原体16M株，得到培养物。将16M株培养物离心收集，PBS清洗2次，加入PBS重悬后调整浓度至1010CFU/mL，以备攻毒用。
1.攻毒试验
选择2～3月龄的断奶犊牛作为试验牛，随机分为2组，每组3头，随机选一组(16M株攻毒组)用16M株培养物(l010CFU/mL)进行攻毒，另选一组(PBS对照组)用PBS作为对照，攻毒方式为鼻内接种，攻毒剂量为l010CFU/头，为量为2mL。
攻毒50日后，剖检所有试验牛，观察肺病变，按牛支原体肺炎肺病变指数记分标准判定。牛支原体肺炎肺病变指数记分标准为：试验牛剖检后，分别观察肺组织左上叶、左下叶、右上叶、右中叶和右下叶的实变肺面积占该肺叶面积的百分比；将面积比在1％到25％之间的记为1分，在26％到50％之间的记为2分，在51％到75％之间的记为3分，在76％到100％之间的记为4分；各肺叶评定的记分相加即为该牛的肺病变指数记分，最高为20分。
2.攻毒后临床症状观察与牛支原体排菌情况
16M株感染后犊牛有明显的临床症状，早期体温升高，偶有咳嗽，运动后腹式呼吸明显，血清学检测显示抗体强阳性。分别在攻毒前、攻毒后第4天、第7天、第11天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天采集攻毒组和对照组的鼻拭子。经处理后，通过增菌培养基培养，观察培养物颜色变化、涂片镜检及PCR鉴定，检测攻毒组和对照组的排菌情况，结果如表1所示。检测结果显示，该菌株感染牛只后可持续排菌。
表1攻毒后排菌情况检测
Figure GDA0002167428130000081
Figure GDA0002167428130000091
3.剖检观察与肺部病变评分
剖检结果显示，牛支原体分离株16M株牛支原体均可导致犊牛产生明显的肺部实变，肺部病变评分见表2。肺病变指数与对照组相比差异显著(P<0.05)，说明16M株具有较强的毒力，可用作牛支原体疫苗效力检验中的攻毒毒株。
表2肺部病变评分表
Figure GDA0002167428130000092
4.攻毒组与对照组各脏器感染情况
对攻毒组和对照组剖检牛肺组织样品进行分离培养和PCR鉴定，证实致病病原为牛支原体。试验结果表明，牛支原体16M株的毒力强、致病性高，排菌时间长，肺部病变明显，攻毒组的肺部再次分离率达100％，结果如表3所示。
表3攻毒组与对照组各脏器感染情况
Figure GDA0002167428130000101
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心
<120> 一株牛支原体强毒株及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
ttacgcaaga gaatgcttca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
taggaaagca ccctattgat 20

Claims (12)

1.一株牛支原体强毒株，分类命名为牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCC NO: M2019235。
2.权利要求1所述牛支原体强毒株在建立牛支原体攻毒发病模型中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，将所述牛支原体攻毒发病模型用于牛支原体疫苗效力检验中。
4.如权利要求2或3所述应用，其特征在于，采用所述牛支原体强毒株纯培养物进行攻毒。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述牛支原体强毒株纯培养物的活菌滴度至少为4×109 CCU/mL。
6.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述牛支原体强毒株采用PPLO肉汤培养基进行培养得所述牛支原体强毒株纯培养物。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述牛支原体强毒株培养基组分如下：PPLO肉汤培养基21g/L，10倍MEM培养液10 mL/L，葡萄糖3g/L，丙酮酸钠2g/L，酵母浸出物2g/L，健康马血清200mL/L，青霉素30万单位/L，质量百分浓度为1%的酚红碱性溶液2mL/L，pH值至7.5±0.2。
8.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述牛支原体强毒株纯培养物的培养条件为：在37±1℃培养2天。
9.一种用于评估牛支原体疫苗效力的攻毒制剂，其特征在于，所述攻毒制剂活性成分为权利要求1所述牛支原体强毒株。
10.一种评估牛支原体疫苗效力的方法，其特征在于，使用权利要求9所述攻毒制剂感染牛支原体疫苗免疫过的牛，进而评估疫苗免疫效力。
11.如权利要求10所述方法，其特征在于，所述感染途径包括滴鼻、腹腔、肺内和气管内注射。
12.如权利要求10所述方法，其特征在于，所述感染途径为滴鼻。
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