CN115887631A - 一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗，由副猪嗜血杆菌5型HPS‑FJLMF和猪链球菌2型SS‑FJLMF制备而成，两菌株分别保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022240、CCTCC NO:M2022243。该二联疫苗安全性良好、稳定有效，效力试验结果证明，经该二联疫苗免疫的猪只均能产生良好抗体，为其提供了较好的攻毒保护力。

Description

一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗

技术领域

本发明涉及农业养殖疾病防控中兽用生物制品技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗。

背景技术

副猪嗜血杆菌病，又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称H.parasuis，可以引起猪的格氏病(Glasser's disease)。临床上以体温升高、关节肿胀、呼吸困难、多发性浆膜炎、关节炎和高死亡率为特征，严重危害仔猪和青年猪的健康。副猪嗜血杆菌病已经在全球范围影响着养猪业的发展，给养猪业带来巨大的经济损失。

副猪嗜血杆菌病由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起，属革兰氏阴性短小杆菌，形态多变，有15个以上血清型，其中血清型以5最为常见，4型和13型次之，共占70％以上。该菌生长时严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)，不需要X因子(血红素或其它卟啉类物质)，在血液培养基和巧克力培养基上生长，菌落小而透明，在血液培养基上无溶血现象；在葡萄球菌菌台周围生长良好，形成卫星现象。一般条件下难以分离和培养，尤其是应用抗生素治疗过的病猪病料，因而给本病的诊断带来困难。

猪链球菌病是由多种致病性猪链球菌感染引起的一种人畜共患病。猪链球菌是猪的一种常见和重要病原体，也是人类动物源性脑膜炎的常见病因，可引起脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎和肺炎，主要表现为发热和严重的毒血症状。少部分患者发生链球菌中毒性休克综合征，严重病例病情进展非常快，如果诊断、治疗不及时，预后较差，病死率极高。

猪链球菌是一种革兰阳性球菌，呈圆形或卵圆形，常呈链状排列，长短不一，无鞭毛，不运动，不形成芽胞，但有荚膜；为兼性厌氧菌，但在无氧时溶血明显，培养最适温度为37℃。菌落细小，直径1～2mm，透明、发亮、光滑、圆形、边缘整齐，在液体培养中呈链状。到目前为止，共有35个血清型(1～34，1/2型)，但是，并非所有的血清型都有致病性。大多数致病性血清型在1～9血清型，最常见的致病血清型为2型。猪链球菌在血平板培养基上生长，菌落周围形成溶血环。猪链球菌的致病因子有荚膜、溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外因子(EF)、溶血素。荚膜可以保护细菌，抵抗吞噬。溶菌酶释放蛋白、细胞外因子的存在提高了菌株的致病力。本菌抵抗力不强，对干燥、湿热均较敏感，常用消毒药都可将其杀死。

副猪嗜血杆菌与猪链球菌具有协同致病作用，这样的协同作用可提高呼吸道疾病的发病率并增加疾病的严重程度，造成严重的经济损失。随着我国集约化养猪规模的逐渐提高，当前我国推行仍是绿色无兽药残留的疾病防控方式，疫苗注射免疫是当前及未来主要防控手段。但目前采取给动物注射疫苗以防控病菌传染的方法会导致病菌发生新的变异，致使疫苗失效；而且，自然界中突变的病菌也会导致现有的疫苗的免疫效果下降。因此，筛选新的菌株并将其制备成疫苗已成为生物制品领域中的研究热点之一。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中疫苗失效的问题，提供一种新的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病二联疫苗，毒力强、免疫原性好，具有较好的交叉保护性，安全稳定。

本发明技术方案详述如下：

本发明提供了一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗，由副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株制备而成，所述副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2022240；所述猪链球菌2型SS-FJLMF株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022243。

可选或优选的，上述二联疫苗，所述副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株均采用甲醛灭活。

可选或优选的，上述二联疫苗，所述疫苗是将含有灭活的副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株的水相和MONTANIDETM ISA206VG佐剂油相预热至30℃，按质量比1:1混合搅拌乳化制成。

可选或优选的，上述二联疫苗，所述含有灭活的副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株的水相的制备方法为：副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株分别使用灭菌生理盐水稀释成1.0×10⁹CFU/ml和2.5×10⁹CFU/ml的菌液，分别加入菌液质量10％的甲醛水溶液，使甲醛终浓度为0.1％，37℃搅拌灭活24小时；所述甲醛水溶液中甲醛质量百分含量为0.4％。

可选或优选的，上述二联疫苗，所述搅拌乳化条件为500r/min搅拌40分钟。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的二联疫苗使用了新筛选的副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株，这两个菌株毒力强、免疫原性好，并具有较好的交叉保护性。该二联灭活疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，使用本发明的二联疫苗免疫的猪只均能产生良好抗体，为其提供了较好的攻毒保护力。

保藏信息：

副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株，Haemophilus parasuis HPS-FJLMF，于2022年03月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M2022240。

猪链球菌2型菌株SS-FJLMF株，Streptococcus suis SS-FJLMF，于2022年03月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M2022243。

附图说明

图1为HPS通用特异性引物PCR鉴定图片，目的片段大小约为820bp。

图2为金黄色葡萄球菌与副猪嗜血杆菌HPS-FJLMF株在不含NAD绵羊血琼脂平板上共培养“卫星生长”现象。

图3为HPS 5型特异性分型引物对已分离的HPS-FJLMF菌株进行血清型PCR鉴定，扩增目的片段大小为560bp。

图4为在含0.01％NAD和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基上，37℃培养24～48小时，形成直径0.3～2.0mm、圆形、光滑、湿润、无色透明的露珠样菌落。

图5为筛选菌株的接种绵羊血琼脂平板培养基鉴定结果：培养24～48h，长出灰白色、圆形、透明、湿润、中央凸起、表面光滑、边缘整齐、呈α溶血、针尖大小的半透明小菌落，菌落直径在2-3mm，菌落周围形成透明溶血环。

图6为血清型鉴定结果：应用猪链球菌1、2、7、9型阳性血清(购自中国兽医药品监察所)对猪链球菌SS-FJLMF株进行玻片凝集血清型鉴定试验，结果显示该菌株与猪链球菌2型发生特异性凝集反应，不与其他猪链球菌1、7、9型发生反应。

图7为对实验室分离的3株猪链球菌2型毒株进行毒力基因PCR鉴定，PCR鉴定结果显示，该猪链球菌SS-FJLMF株(编号3)三个毒力基因均为阳性。编号1菌株只有mrp毒力基因阳性，编号2菌株有sly和epf两个毒力基因阳性，编号3菌株mrp、sly和epf三个毒力基因均为阳性。

具体实施方式

下面结合较佳的具体实施例对本发明技术方案进行详细解释和说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施。

实施例中所用仪器、试剂、生物材料如无特殊说明，均可通过商业途径购买，所用实验方法手段为本领域常规操作。

实施例1：副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株的筛选

1.自2020年以来流行病学调查，发明人对副猪嗜血杆菌的流行病学进行调查，并对部分猪场进行跟踪调查发现，副猪嗜血杆菌目前已在我国猪场广泛存在。

2.菌株分离培养及筛选

2.1病料中细菌的粗筛选采集疑似病猪的肺脏、胸腹腔积液、心包积液、心血、关节液和脑组织等病料，接种TSA培养基(即大豆酪蛋白琼脂培养基)，于5％CO₂条件下，37℃培养24～48h，挑取单个菌落，进行培养并鉴定。

2.2PCR及测序初步鉴定挑取接种平板中长成疑似猪链球菌形态的单个菌落的菌落，每个平板挑取18个单菌落，采用副猪嗜血杆菌(HPS)通用特异性引物进行菌落PCR鉴定，均成功鉴定到约820bp大小目的条带，见图1。不同猪只、不同病料培养平板的菌落经PCR扩增均能扩增出820bp大小的目的条带。将扩增片段直接送测序确定，结果表明所有分离出来的菌株基因序列相同，命名为副猪嗜血杆菌HPS-FJLMF株。

3.菌株鉴定

3.1形态及生化特性

副猪嗜血杆菌HPS-FJLMF株为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态(从单个的球杆菌到长的、细长的、以至丝状的菌体)。接触酶试验、硝酸盐还原试验结果均为阳性；溶血性试验、尿素酶试验、氧化酶试验、V-P试验、吲哚试验均为阴性。该菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖。该菌株与金黄色葡萄球菌一起培养，可见在金黄色葡萄球菌线两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，呈现出典型的“卫星生长”现象，并且不出现溶血现象，证明此菌为依赖NAD生长的细菌，详见图2。

3.2血清型鉴定

采用副猪嗜血杆菌5型特异性分型引物对已分离的HPS-FJLMF菌株进行血清型PCR鉴定试验，副猪嗜血杆菌HPS-FJLMF株菌为HPS 5型。详见图3。

表1副猪嗜血杆菌5型特异性分型引物

3.3培养特性

副猪嗜血杆菌HPS-FJLMF株在含0.01％辅酶(NAD)和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中呈均匀一致的混浊生长；在含0.01％NAD和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基上，37℃培养24～48小时，形成直径0.3～2.0mm、圆形、光滑、湿润、无色透明的露珠样菌落。详见图4。

3.4菌株毒力

对8～10周龄健康易感仔猪腹腔注射，副猪嗜血杆菌HPS-FJLMF株的菌液攻毒进行最小发病剂量试验，能使至少4头及以上仔猪发病的HPS-FJLMF株的攻毒剂量为1.0×10⁹CFU/头。

实施例2：猪链球菌2型SS-FJLMF株的筛选

1.自2020年以来，发明人对猪链球菌流行病学进行调查，并对部分猪场进行实地跟踪调查发现，猪链球菌目前已在我国猪场广泛存在。

2.菌株的分离培养

2.1病料中细菌的粗筛选采集疑似病猪的肺脏、胸腹腔积液、心包积液、心血、关节液和脑组织等病料，接种TSA培养基(即大豆酪蛋白琼脂培养基)，于5％CO₂条件下，37℃培养24～48h。

2.2PCR及测序初步鉴定挑取接种平板中长成疑似猪链球菌形态的单个菌落的菌落，每个平板挑取20个单菌落，采用猪链球菌特异性引物直接进行菌落PCR鉴定，将PCR鉴定阳性菌落直接送测序进行确定，共筛选出3个菌株，分别命名为菌株1、菌株2、菌株3。

3.菌株的鉴定

3.1形态及生化特性

三个菌株中有部分菌落形态为针尖状大小、灰白色半透明，圆形、光滑、边缘整齐。纯化接种后，进行革兰氏染色，该菌为革兰氏阳性菌，圆形或卵圆形，链状排列或成双，链的长短不一。

3.2溶血特性鉴定

挑取步骤2中的单个菌落接种普通绵羊血琼脂平板培养基，培养24～48h，长出灰白色、圆形、透明、湿润、中央凸起、表面光滑、边缘整齐、呈α溶血、针尖大小的半透明小菌落，菌落直径在2-3mm，菌落周围形成透明溶血环。其中编号3菌株的培养结果详见图5。

3.3血清型

应用猪链球菌1、2、7、9型阳性血清(购自中国兽医药品监察所)对三个菌株进行玻片凝集试验，进行血清型鉴定，结果显示该菌株与猪链球菌2型发生凝集反应，不与其他猪链球菌1、7、9型发生反应，表明该菌株为猪链球菌2型。编号3菌株血清型检测结果详见图6。

3.4菌株毒力

3.4.1毒力基因鉴定

分别采用sly基因、epf基因、mrp基因3个毒力相关基因特异性引物对三个编号的菌株进行PCR鉴定，3个毒力相关基因引物序列如下表所示：

对实验室分离的3株猪链球菌2型毒株进行毒力基因PCR鉴定，PCR鉴定结果显示，编号1菌株只有mrp毒力基因阳性，编号2菌株只有sly和epf毒力基因阳性，而只有编号3菌株的三个毒力基因均为阳性，详见图7。最后保留编号3菌株，命名为SS-FJLMF株。

3.4.2对小鼠的致病力试验

选取体重为28-32g健康易感昆明白小鼠15只，随机分为3组，每组5只，分别按照1×10⁹CFU/只、5×10⁸CFU/只及1×10⁸CFU/只进行腹腔注射菌液攻毒最小致死剂量试验，结果表明SS-FJLMF株菌株对小鼠的最小致死剂量为5×10⁸CFU/只。

3.4.3对仔猪的致病力试验

选取8～10周龄健康易感仔猪15头，随机分为3组，每组5头，分别按照5×10⁹CFU/头、1.5×10⁹CFU/头及1×10⁹CFU/头进行静脉注射菌液攻毒最发病剂量试验，结果显示，按照5×10⁹CFU/头和1.5×10⁹CFU/头攻毒组猪均5/5发病，按照1×10⁹CFU/头攻毒组猪为4/5发病，确定SS-FJLMF株菌株对仔猪5/5发病的最小剂量为1.5×10⁹CFU/头。

实施例3：副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株抗原的制备

1.菌液培养

1.1HPS-FJLMF株的培养：采用发酵罐对HPS-FJLMF株进行培养。

按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清、0.01％NAD和1％～3％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速120r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养8小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过24小时。

1.2SS-FJLMF株的培养：采用发酵罐对SS-FJLMF株进行培养。

按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清和1％～3％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速180r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养5小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过24小时。

1.3灭活

根据活菌计数结果，将HPS-FJLMF株和SS-FJLMF株的菌泥分别重悬于适量灭菌的生理盐水中稀释至1.0×10⁹CFU/ml和2.5×10⁹CFU/ml，向菌液中分别计量加入占菌液质量10％的甲醛水溶液(甲醛质量百分含量为0.4％)，使甲醛的终浓度为0.1％，37℃搅拌灭活24小时，取适量灭活后菌液进行灭活检验，其余灭活后菌液置2～8℃保存，保存时间不超过14日。

1.4半成品检验

1.4.1纯粹检验按现行《中国兽药典》附录“无菌检验或纯粹检验”进行检验。

1.4.2活菌计数按现行《中国兽药典》附录“活菌计数”进行计数。

1.4.3灭活检验按现行《中国兽药典》附录(2020版第三部)行检验。

实施例4：灭活二联疫苗的制备

1.水相：按体积比1:1配制检验合格的副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株灭活抗原液，由于灭活后测不到菌数量，只能用灭活前指标进行衡量，该水相中灭活抗原计数按灭活前指标计算为每ml抗原液含灭活前HPS-FJLMF株抗原1.0×10⁹CFU，每ml抗原液含灭活前SS-FJLMF株抗原2.5×10⁹CFU。

2.油相：MONTANIDETM ISA206VG佐剂(以下简称ISA206佐剂，为市售商品)。

3.乳化：水相和油相分别预热至30℃，再按质量比1:1混合，500r/min搅拌40分钟。

4.分装：定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

5.成品检验

5.1性状

外观：乳白色乳剂。

剂型：水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不大于0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录“粘度测定”进行，应符合规定。

5.2装量检查：按现行《中国兽药典》附录“最低装量检查”进行检验，应符合规定。

5.3无菌检验：按现行《中国兽药典》附录(2020年版三部)进行检验，应无菌生长。

5.4安全检验：用3～5周龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗4.0ml，观察14日，应不出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。

5.5效力检验

5.5.1血清学方法

取3～5周龄健康易感仔猪20头，随机分为A、B、C、D四组，每组5头，其中A、B组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2.0ml/头，C、D组为未免疫对照组，均颈部肌肉注射生理盐水，2.0ml/头。一次免疫后21日，按相同剂量和相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日对所有仔猪采血并分离血清，分别检测副猪嗜血杆菌和猪链球菌抗体效价。

结果显示，副猪嗜血杆菌的微量凝集抗体：免疫组5头仔猪的抗体效价均≥1:32，对照组5头仔猪的抗体效价均≤1:4；猪链球菌的微量凝集抗体：免疫组5头仔猪的抗体效价均≥1:32，对照组5头仔猪的抗体效价均≤1:4。

5.5.2免疫攻毒法

用3～5周龄健康易感仔猪20头，随机分为A、B、C、D四组，每组5头，其中A、B组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2.0ml/头，C、D组为未免疫对照组，均颈部肌肉注射生理盐水，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同方法和相同剂量进行二次免疫，二次免疫后14日进行攻毒。

结果显示，A、B组试验猪腹腔注射HPS-FJLMF株菌液3.0ml(活菌量约为1.0×10⁹CFU/头)；C、D组试验猪静脉注射SS-FJLMF株菌液3.0ml(活菌量约为1.5×10⁹CFU/头)。攻毒后连续观察14日，副猪嗜血杆菌：免疫组猪均至少4头保护，对照组猪5头发病；猪链球菌：免疫组猪均5头保护，对照组猪均5头发病。

实施例4：与市售二联灭活疫苗的对比试验

用市售的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病二联灭活疫苗，及本发明的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病二联灭活疫苗，分别各免疫10头猪，并设置10头猪为未免疫对照猪。根据各自疫苗的免疫程序进行免疫，免疫后采血进行抗体测定。并分别用本发明的两株菌株进行攻毒。试验结果见下表：

表1：本产品与市售二联灭活疫苗产品对比试验结果

结果表明，市场上出售的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病二联灭活疫苗，无论是从抗体上还是从攻毒保护率上，均比本发明的副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联灭活疫苗的效果较差。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗，其特征在于，由副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株制备而成，所述副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2022240；所述猪链球菌2型SS-FJLMF株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022243。

2.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株均采用甲醛灭活。

3.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述疫苗是将含有灭活的副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株的水相和MONTANIDETM ISA206VG佐剂油相预热至30℃，按质量比1:1混合搅拌乳化制成。

4.根据权利要求3所述的二联疫苗，其特征在于，所述含有灭活的副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株的水相的制备方法为：副猪嗜血杆菌5型HPS-FJLMF株和猪链球菌2型SS-FJLMF株分别使用灭菌生理盐水稀释成1.0×10⁹CFU/ml和2.5×10⁹CFU/ml的菌液，分别加入菌液质量10％的甲醛水溶液，使甲醛终浓度为0.1％，37℃搅拌灭活24小时；所述甲醛水溶液中甲醛质量百分含量为0.4％。

5.根据权利要求3所述的二联疫苗，其特征在于，所述搅拌乳化条件为500r/min搅拌40分钟。

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