CN107338208B

CN107338208B - 一种猪萎缩性鼻炎d型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株及其应用

Info

Publication number: CN107338208B
Application number: CN201710721091.1A
Authority: CN
Inventors: 郝成武; 何传雨; 何海; 韩瑞; 贺笋; 李延涛
Original assignee: Tecon Biological Co ltd
Current assignee: Tiankang biopharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2017-08-17
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2037-08-17
Also published as: CN107338208A

Abstract

本发明涉及动物疾病防治技术领域，具体而言，涉及一种猪萎缩性鼻炎D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株及其应用。该菌株为多杀巴斯德氏菌TK‑MD8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10394，保藏日期：2015年01月27日。本发明提供的D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株制备的单价疫苗，生产简单、疫苗安全高效。

Description

一种猪萎缩性鼻炎D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及动物疾病防治技术领域，具体而言，涉及一种猪萎缩性鼻炎D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株及其应用。

背景技术

D型产毒多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocid，Pm)是猪萎缩性鼻炎主要病原之一，由该菌引起的猪萎缩性鼻炎称为进行性萎缩性鼻炎(Progressive AtrophicRhinitis，PAR)。该病的主要特征为慢性鼻炎、颜面部变形和鼻甲骨萎缩。哺乳仔猪感染本病后，除引起鼻甲骨甚至鼻腔变形、萎缩或消失外，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓、饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡。

PAR是一种隐性疾病，临床上一般不表现明显的全身症状或引起死亡，但是可以引起胴体等级降低或污染，生产速度下降、产生僵猪，可损害呼吸道的正常结构和功能，使机体抵抗力降低，极易感染其他病原，诸如支原体、嗜血杆菌、猪流感病毒、猪繁殖呼吸综合征病毒等，引起猪呼吸道疾病，增加猪的死亡率。目前猪萎缩性鼻炎的主要防治措施是疫苗和药物，随着细菌耐药性的增加，有效的药物较缺乏。因此，进行该病的疫苗研制将为本病的预防和控制具有重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪萎缩性鼻炎疫苗菌株，该疫苗菌株对猪有一定的致病性，具有良好的免疫原性。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一株细菌菌株，所述菌株为多杀巴斯德氏菌TK-MD8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10394，保藏日期：2015年01月27日。

该菌种拉丁学名为Pasteurella multocid，中文学名为多杀巴斯德氏菌，菌株名为TK-MD8，该菌株是发明人于2008年于新疆某猪场自行采集病样分离鉴定获得一株D型产毒多杀巴斯德氏菌。

分离的pmt基因的核苷酸序列，选自：

a).SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列的核苷酸序列；

b).保留多杀巴斯德氏菌类毒素合成能力的任何所述SEQ ID NO：1的片段；

c).与a)和b)中定义的核苷酸序列基本类似的核苷酸序列；和

d).与a)、b)、c)任一项互补的核苷酸序列。

在本说明书所用的意义上，单词“类似”意在包括任何至少具有类毒素合成能力的核苷酸序列。

典型的类似DNA序列：以SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列为基础可从任何产该类似序列的生物中分离得到，或以SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列为基础通过替换一或多个碱基，在序列中插入一或多个碱基，在序列的任一末端添加一或多碱基或，在任一末端或序列内部缺失一或多个碱基构建而得。如，类似的DNA序列可能是SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的子序列。

一般说来，类似的DNA序列与SEQ ID NO：1中定义的核苷酸序列基本同源。从本说明书的意义来看，“基本同源”意即在核苷酸水平所讨论的核苷酸序列至少有60％的同一性，优选至少85％或更优选至少95％，或更优选至少97％、98％或99％。

本发明的核苷酸序列可源于包含它的任一生物，例如来自多杀巴斯德氏菌或来自该DNA序列转化的宿主生物。本发明的核苷酸序列可用传统技术分离，应用本发明核苷酸序列的信息制备寡聚核苷酸探针从任何其他物种的DNA中起始。

在具体的实施方案中，本发明的核苷酸序列是SEQ ID NO：1中所示的序列，并将其命名为pmt基因。

基于分子生物学技术普通知识，可以从其他微生物种类中获得与pmt基因同源的其他基因。所有与本发明中所述的一个序列同源，并基本保持特异的类毒素表达的能力的核苷酸序列构成本发明的一部分。

分离的kmt基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述pmt基因及kmt基因均分离自多杀巴斯德氏菌TK-MD8。

D型Pm可以分泌一种皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)。PMT是约146KDa的类毒素(toxoid)，可直接引起猪鼻炎、鼻梁变形、鼻甲骨萎缩甚至消失，全身代谢障碍，生产性能下降，是猪萎缩性鼻炎最重要的致病因子。因此，可将pmt基因表达得到多肽用于疫苗的制备。

kmt基因是Pm种特异的DNA片段，可用于Pm的鉴定与分型。

本发明提供的pmt基因和kmt基因的核苷酸序列，可以插入合适的载体。因此，本发明也涉及重组载体，本发明所提供的核苷酸序列及DNA构建物可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选表达载体，其含有如上所述的核苷酸序列。

本发明也提供细胞，其含有本发明提供的pmt基因和kmt基因的核苷酸序列，或含上文提及的载体。可以转化本发明核苷酸序列的宿主细胞可以是原核细胞。

本发明还涉及所述的pmt基因和kmt基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

如上所述的细菌菌株或如上所述的核苷酸序列在制备用于治疗猪萎缩性鼻炎的疫苗中的应用；

其中，优选的，所述猪萎缩性鼻炎为D型产毒多杀巴斯德氏菌引起的。

一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗，包含灭活的多杀巴斯德氏菌TK-MD8或灭活的如上所述的pmt基因的核苷酸序列表达的多肽及兽药学上可接受的佐剂。

优选的，如上所述的灭活疫苗，所述灭活的多杀巴斯德氏菌TK-MD8的灭活方法为使用甲醛灭活。

优选的，如上所述的灭活疫苗，所述灭活方法具体为：

将甲醛按照0.2～0.5v/v％的终浓度加入多杀巴斯德氏菌TK-MD8菌液中，36～38℃作用48～56小时；

更优选的，如上所述的灭活疫苗，所述灭活方法具体为：

将甲醛按照0.3～0.4v/v％的终浓度加入多杀巴斯德氏菌TK-MD8菌液中，37℃作用50～54小时。

优选的，如上所述的灭活疫苗，所述多杀巴斯德氏菌TK-MD8的含量为1×10^8～ ¹²CFU/mL；更优选为1×10^10～12CFU/mL，也可以选择1×10⁹CFU/mL、1×10¹¹CFU/mL等。

优选的，如上所述的灭活疫苗，所述兽药学上可接受的佐剂为水性佐剂和/或油性佐剂；

更优选的，所述兽药学上可接受的佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Montanide^TMGel、蜂胶、ISA206、ISA760VG、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种；

更优选的，所述兽药学上可接受的佐剂为水性、油性双相佐剂。

一种多价疫苗，其含有灭活的多杀巴斯德氏菌TK-MD8和/或灭活的如上所述的核苷酸序列表达的多肽以及灭活的其它猪疾病的病原体；

优选的，所述其它猪疾病的病原体包括猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、新菌株致病力强：本发明的D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株可通过鼻腔滴鼻方式攻毒，可成功复制出由产毒多杀巴斯德氏菌引起的猪萎缩性鼻炎病理变化。

2)、新菌株免疫原性好：本发明的D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株为从国内分离培养的新菌株，具有良好的免疫原性，免疫后可提供较高的巴氏杆菌毒素中和抗体水平，保证了疫苗的特异性和免疫效力。

3)、新菌株生产疫苗简便：本发明的D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株可在基础培养基中生长并获得高浓度滴度的抗原，减少了疫苗生产成本。

总之，本发明提供的D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株制备的单价疫苗，生产简单、疫苗安全高效，可为猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌和产毒多杀巴斯德氏菌二价疫苗的研制，提供基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为kmt基因PCR扩增鉴定结果图；

图2为dcb基因PCR扩增鉴定结果图；

图3为pmt基因PCR扩增鉴定结果图；

图4为多杀巴斯德氏菌TK-MD8株kmt基因与国内外序列比对结果图；

图5为多杀巴斯德氏菌TK-MD8株毒素pmt基因与国内外序列比对结果图。

本发明提供的多杀巴斯德氏菌(D型)(Pasteurella multocid)，菌株名为TK-MD8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2015年1月27日，保藏编号CGMCCNo.10394。经保藏中心于2015年1月27日检测为存活菌株。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

D型产毒多杀巴斯德氏菌TK-MD8株的分离鉴定。

1菌株分离培养：将采自患有猪萎缩性鼻炎症状猪的鼻腔棉拭子和肺脏组织，接种脑心浸液琼脂培养基，37℃培养18～24h后观察，挑取直径1～2mm、透明、光滑的菌落进行革兰氏染色。革兰氏染色呈红色的细小球杆菌为可疑菌落，对其传代纯化，进一步做生化及PCR鉴定。

2菌株鉴定

2.1生化鉴定：将分离的可疑菌株接种鲜血脑心浸液琼脂培养基上生长良好，呈水滴样小菌落，无溶血。将可疑菌株分别接种生化培养管，36～38℃培养24～48小时，该菌株发酵鸟氨酸、甘露醇、葡萄糖和蔗糖，不发酵麦芽糖和乳糖，吲哚、氧化酶和触酶试验阳性，脲酶阴性。由形态和生化特性的结果可知，这些特征与多杀巴斯德氏菌的特征相符，因此初步判断分离菌为多杀巴斯德氏菌。

2.2PCR鉴定：根据Genbank中报道的多杀巴斯德氏菌种鉴定kmt基因、D型鉴定dcb基因和毒素鉴定pmt基因的基因序列分别设计引物，经PCR扩增鉴定均为阳性。kmt基因PCR扩增片段为457bp、dcb基因PCR扩增片段为567bp和pmt基因PCR扩增片段为865bp。PCR结果见图1～3。

2.3基因序列比对：对D型产毒多杀巴斯德氏菌TK-MD8株kmt基因和pmt基因扩增。用凝胶回收试剂盒回收目的片段，将其克隆至PMD19-T载体中，构建重组质粒，经PCR鉴定后由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。基因序列与Genbank中已报道的基因序列进行ClustalW比对。比对结果，对于kmt基因，TK-MD8株与与国外已提交至GenBank中种鉴定kmt基因序列比对同源性在97.4％～97.8％之间，与国内已提交至GenBank中种鉴定kmt基因序列比对同源性在99.3％～100％之间，见图4。对于pmt基因与国内外已提交至GenBank中毒素pmt基因序列比对同源性均在99.9％～100％之间，见图5。pmt基因序列如SEQ ID NO：1所示，kmt基因序列如SEQ ID NO：2所示。

结果分析

经形态、生化、PCR及基因序列比对，分离获得了D型产毒多杀巴斯德氏菌TK-MD8株。

实施例2

多杀巴斯德氏菌灭活疫苗(TK-MD8株)的制备。

1制苗用菌液的制备

将多杀巴斯德氏菌TK-MD8株菌种无菌启封，用液体培养基溶解，接种于鲜血固体培养基，置36～38℃培养18～24小时，挑取呈水滴样小菌落，无溶血现象的菌落，接种液体培养基置36～38℃，培养18～24小时，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，检验合格作为种子液。取种子液接种液体培养基，置36～38℃恒温振荡培养箱培养16～24小时，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验和活菌计数。

2菌液的灭活

将甲醛按照0.2～0.5％的终浓度(v/v)加入多杀巴斯德氏菌菌液中，36～38℃作用48～56小时。

3菌液灭活检验

从灭活菌液中取样，接种于3支液体培养基，每支0.2ml，置36～38℃培养5～7日，应无菌生长。另取灭活菌液，背部皮内注射2只豚鼠，每只0.1ml，观察72小时，应无异常反应。

4配苗

将灭活菌液与一定比例水性佐剂混合，均匀搅拌1小时后，再与一定比例的油佐剂混合均匀搅拌30分钟后无菌定量分装，加盖密封，粘贴标签。

实施例3

多杀巴斯德氏菌灭活疫苗(TK-MD8株)的检验

1疫苗的检验

1.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

1.2安全检验

用3～4周龄健康易感猪5头，耳后颈部肌肉注射猪疫苗4ml/头。连续观察14日，每日定时测温，所有试验猪均应不出现由疫苗接种引起的任何不良反应。

1.3效力检验

用3～4周龄健康易感猪5头，各耳后颈部肌肉注射疫苗2ml，21日后以相同途径与相同剂量进行二免。二免后21日，免疫组和对照组各选取5头仔猪，分别滴鼻多杀巴斯德氏菌TK-MD8株，连续观察28日后剖检并对鼻甲骨进行评分；对照猪应至少4头发病，免疫猪应至少4头保护。按50分评分法对每头猪鼻甲骨进行评分，发病标准为鼻甲骨评分不高于20分；保护标准为鼻甲骨评分不低于40分。

2检验结果：

2.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

2.2安全检验

试验猪均未出现由接种疫苗引起的不良反应。

2.3效力检验结果

免疫保护效果见表1。

表1 疫苗效力检验结果

实施例4

多杀巴斯德氏菌灭活疫苗(TK-MD8株)免疫效果观察

疫苗：本发明多杀巴斯德氏菌灭活疫苗(TK-MD8株)，对照国外某公司生产的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗。

检验菌种：多杀巴斯德氏菌TK-MD8株由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司分离、鉴定、保管和供应。

试验动物：3～4周龄健康易感仔猪，购自新疆天康畜牧科技有限公司。

试验分组：试验分为三组，第一组和第二组试验动物分别肌肉注射国外某公司生产的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗、新疆天康生产的多杀巴斯德氏菌灭活疫苗(TK-MD8株)，2ml/头，第三组为对照组，不做任何处理；一免后14日按照相同条件和途径进行二免，二免后14日，连同对照组，每头猪滴鼻多杀巴斯德氏菌TK-MD8株。

抗体检测：二免后14日，将所有试验动物采血，分离血清，进行PMT中和抗体检测。抗体。

PMT中和抗体检测方法：在96孔细胞培养板内，将已灭活的待检血清做2倍连续稀释。在每孔内加入50μl经稀释的待检血清，再加入50μl的PMT，然后置37℃、5％CO₂恒温培养箱中1小时。向各孔中加入100μl Vero细胞(2×10⁵个/ml)，将细胞培养板置37℃、5％CO₂恒温培养箱中7天，观察结果。能够抑制结节样细胞病变出现的最高血清稀释倍数，即为该血清的中和抗体效价。

试验结果：

抗体对比试验：二免后14日，将所有试验动物采血，分离血清，进行PMT中和抗体检测，免疫国外某公司和多杀巴斯德氏菌灭活疫苗(TK-MD8株)，中和抗体效价分别为3.4±0.55和3.0±0.71，运用Prism 5.0统计分析软件进行t检验分析，两者没有显著差异(P﹥0.05)，结果见表2。

表2 试验猪PMT中和抗体效价(log2)

组别	PMT中和抗体(平均数±标准差)
		多杀巴斯德氏菌灭活疫苗(TK-MD8株)	3.0±0.71
进口猪萎缩性鼻炎灭活疫苗	3.4±0.55
		攻毒对照组	0

效力对比试验：攻毒后28日，将所有试验动物解剖，免疫国外某公司和新疆天康的疫苗，猪鼻甲骨评分分别为40.4±1.67和41.2±1.79，运用Prism 5.0统计分析软件进行t检验分析，两者没有显著差异(P﹥0.05)，

鼻甲骨评分见表3。

表3 试验猪鼻甲骨评分

注：a-b表示每组之间两两比较，字母相同者表示差异不显著(P﹥0.05)，字母不相同者表示差异显著(P＜0.05)

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林冠界生物技术有限公司

<120> 一种猪萎缩性鼻炎D型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 865

<212> DNA

<213> Pasteurella multocid

<400> 1

cttagatgag cgacaaggtt taatgcatga actcatggag cttattgatc tttatgaaga 60

atcgcaacct tcttcagagc gtttgaatgc ttttcgtgaa ctgcgtactc aattagaaaa 120

agcgctttat cttcctgaaa tggaagcatt aaaaaaacaa atactacaga ttcctaacaa 180

aggttctggt gccgctcgat ttttacttcg tacagccatg aatgaaatgg ctggaaaaac 240

cagtgaaagc acggctgatt taatacgctt tgccttgcaa gatacagtaa tttcagcgcc 300

ttttcgcgga tatgctggtg cgattccaga ggcaatagac tttcctgtaa aatatgtaat 360

agaagacata tctgtatttg ataaaataca gacaaattac tgggaacttc ctgcttatga 420

aagctggaac gaaggaagta atagcgcatt actgcctggt ttgttacgtg aatcgcaaag 480

caaggggatg ttaagtaagt gtcgtatcat agaaaatagc ctttatattg gacatagcta 540

tgaagaaatg ttttacagca tttctccata ttcaaaccag gttggagggc cttatgaatt 600

atatcctttc acttttttca gtatgcttca agaagtacaa ggtgatttag gatttgagca 660

ggcctttgcc acacgtaact ttttcaatac tcttgtttct gatcgactat ccttaatgga 720

aaatacgatg ttacttacag aaagttttga ttatacacct tgggatgcta tttatggaga 780

tattaattat gatgaacaat ttgctgcaat gtctattaat gaacgcatag aaaaatgtat 840

gaatacctat agaggtgtgg cattc 865

<210> 2

<211> 457

<212> DNA

<213> Pasteurella multocid

<400> 2

gctgtaaacg aactcgccac tttttgtttc atttggactg acacgatcaa accgttgaac 60

acgaagaaaa agactaaaat aggtaaccaa tacacgataa ataaattaaa ccgctctgcc 120

gttaatggct tcaataatgg ccataagaaa cgtaactcaa catggaaata ttgataaatc 180

agactgacaa ggaaatataa accggcaaat aacaataagc tgagtaataa ataacgtcca 240

atcagttgcg ccgttgtcaa ggaagcagat tggctcaaca caccaaactc tgcccaacaa 300

aactgtgctt ttctttgcca caagccaaat aaaagactac cgacaagccc actcacaacg 360

agccataaaa taatgccatt tcccatttca agtggcataa aactcaattt cgcggcaatc 420

ggttcattcg caccgcccca ctgggtaaat agcggat 457

Claims

1.一株细菌菌株，其特征在于，所述菌株为多杀巴斯德氏菌TK-MD8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10394 ，保藏日期：2015年01月27日。

2.权利要求1所述的细菌菌株在制备用于治疗猪萎缩性鼻炎的疫苗中的应用。

3.一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗，其特征在于，包含灭活的权利要求1所述的多杀巴斯德氏菌TK-MD8及兽药学上可接受的佐剂。

4.根据权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于，多杀巴斯德氏菌TK-MD8的灭活方法为使用甲醛灭活。

5.根据权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活方法具体为：

将甲醛按照0.2~0.5 v/v %的终浓度加入多杀巴斯德氏菌TK-MD8菌液中，36~38℃作用48~56小时。

6.根据权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于，所述多杀巴斯德氏菌TK-MD8的含量为1×10^8~12CFU/mL。

7.根据权利要求3所述的灭活疫苗，其特征在于，所述兽药学上可接受的佐剂为水性佐剂和/或油性佐剂。

8.一种多价疫苗，其含有灭活的权利要求1所述的多杀巴斯德氏菌TK-MD8以及灭活的猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌。