CN112143666B - 一种猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用 - Google Patents

一种猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用，属于微生物与免疫技术领域。本发明的猪肺炎支原体弱毒株分类命名为猪肺炎支原体ES‑2L Mycoplasma hyopneumoniae ES‑2L，保藏编号为CCTCC NO：M 2020313，该猪肺炎支原体弱毒株具有生长速度快、生长滴度高，安全性好且免疫保护力强、可直接肌肉注射免疫等特点，其可用于制备猪肺炎支原体弱毒疫苗，基于其制备的猪支原体肺炎弱毒疫苗具有临床使用方便、安全性好、免疫效果好等优点。

Description

一种猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用
技术领域
本发明属于微生物与免疫技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用。
背景技术
猪肺炎支原体是一种呼吸道病原体，能够引起猪地方性肺炎，该病又称“猪气喘病”，是一种慢性呼吸道疾病，主要感染于猪，各个年龄阶段的猪都能够被感染，临床症状表现为咳嗽和气喘，消瘦，组织学病变主要表现为，气管中出现卡他性渗出物和肺组织的实质性“肉变”，该病灶一旦出现将难以恢复。在肺部，特别是尖叶﹑心叶﹑中间叶出现淡红色﹑灰红色的“肉变”。随着病程的进展，会出现灰白色，浅红色的“虾肉样实变”。该病具有很高的发病率，虽然气喘病死亡率并不高，但是猪肺炎支原体破坏宿主纤毛屏障后容易引起多种病原(圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、链球菌等)的混合感染，加剧了该病的防控难度，是当前常发生、流行广、难净化的重要疫病之一，给全世界养猪业带来极大威胁。
猪肺炎支原体属于柔膜体纲，其细胞大小介于细菌和病毒之间，形态多为球型或椭圆型，是一类缺乏细胞壁的原核生物。在支原体的进化过程中，由于其生物合成的相关基因的缺失，所以导致支原体生长所必需的营养物质必须从外界获取，因此，对支原体的分离培养鉴定一直是微生物学领域的难点之一。
由于猪肺炎支原体没有细胞壁，常规的作用于细胞壁类的抗生素对其是无效的，并且支原体对其它种类抗生素的耐药性也在逐渐增加。因此对于气喘病的控制，主要是以疫苗接种为主。目前，临床上主要使用的疫苗为灭活苗和弱毒苗。疫苗免疫的主要作用是：减轻临床症状，减轻肺部病变和减少药物使用，以及提高生产性能。越来越多的研究证明，灭活疫苗产生的保护效果不是很理想，灭活疫苗免疫后检测不到相应的血清抗体，因为猪肺炎支原体诱导的免疫机制以细胞免疫和粘膜免疫为主。而国内常用的弱毒疫苗，其免疫方式需要肺内注射，操作复杂，不易于临床应用；并且，地方种猪对支原体的易感性比商品猪要高很多，理想的菌株选择应该是地方分离株。
发明内容
本发明的目的在于克服现有弱毒疫苗的不足，提供一种临床使用方便、安全性好、免疫原性强的猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)弱毒株，命名为猪肺炎支原体ES-2L株，其于2020年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为猪肺炎支原体ES-2L Mycoplasma hyopneumoniae ES-2L，保藏编号为CCTCC NO：M 2020313。该菌株是基于临床分离强毒株ES-2株(保藏编号CCTCC NO：M2018570)体外连续传至200代而来。
所述的猪肺炎支原体ES-2L株具有生长速度快、生长滴度高，安全性好且免疫保护力强、可直接肌肉注射免疫等特点，其可用于制备猪肺炎支原体弱毒疫苗，基于其制备的猪支原体肺炎弱毒疫苗具有临床使用方便、免疫效果好的优点。
一种猪肺炎支原体弱毒疫苗，包含猪肺炎支原体ES-2L，还可以包含其药学上可接受的辅料。
所述的猪肺炎支原体ES-2L还可以与猪其他病原(如圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、链球菌等)中的一种或多种的免疫原联用制备猪多价型疫苗。
一种猪多价型疫苗，包含猪肺炎支原体ES-2L，还可以包含其药学上可接受的辅料或佐剂。
本发明具有如下优点和有益效果：相比于国内的弱毒疫苗株，猪肺炎支原体ES-2L株是基于地方临床分离强毒株ES-2株体外连续传至200代而来，生长速度快、生长滴度高，对地方猪具有更好的保护效果，并且临床使用非常方便(肌肉注射)，而现有已知的弱毒疫苗大多需要肺内注射，不易操作。
附图说明
图1：各个代次猪肺炎支原体PCR鉴定结果图。图中，M：DNA2000maker；1～6分别为：ES-2株P1代﹑P40代﹑P80代﹑P120代﹑P160代﹑P200代(ES-2L株)；7：阳性对照；8：阴性对照。
图2：猪肺炎支原体ES-2L株在固体培养基上的菌落形态图。
图3：猪肺炎支原体ES-2L株的CCU测定结果图。
图4：猪肺炎支原体ES-2L株与其他株的基因组共线性比对结果图。
图5：猪肺炎支原体ES-2L株攻毒后各组体重变化图。图中，A：ES-2株P1代次攻毒组，B：ES-2L株攻毒组，C：空白对照组。
图6：猪肺炎支原体ES-2L株攻毒后各组肺脏剖解图。图中，A：ES-2株P1代次攻毒组，B：ES-2L株攻毒组，C：空白对照组，箭头表示：肉样或虾肉样”病变。
图7：猪肺炎支原体ES-2L株免疫攻毒后各组体重变化图。图中，A：ES-2L株肌肉注射免疫组；B：生理盐水免疫组(攻毒对照组)；C：空白对照组。
图8：猪肺炎支原体ES-2L株免疫攻毒后各组肺脏剖解图。图中，A：ES-2L株肌肉注射免疫组；B：生理盐水免疫组(攻毒对照组)；C：空白对照组，箭头表示“肉样或虾肉样”病变。
图9：细胞免疫因子检测结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明的猪肺炎支原体ES-2L株是基于地方临床分离强毒株ES-2株(保藏编号CCTCC NO：M 2018570)体外连续传至200代而来。具体传代过程如下：将冷冻保存的ES-2株进行复苏活化，复苏活化后的菌液作为P1代；将P1代菌液按照10％比例加入改良Friis液体培养基，在37℃、5％二氧化碳环境中培养2～3天后收获作为P2代；如此进行连续传代培养，当传至第197代时，将收获的菌液，涂于改良Friis固体培养基上，置于37℃、5％二氧化碳环境中培养7～10天后，在低倍镜下挑取单个菌落，接入Friis液体培养基进行培养；如此进行连续3次克隆纯化鉴定，将最后一次克隆纯化得到的菌液(P200代)，命名为ES-2L。在传代过程中，每隔40代进行PCR鉴定及菌落形态鉴定和颜色变化单位(Colour Change Unit，CCU)测定。
PCR鉴定方法为以猪肺炎支原体P36(特有基因)和16sRNA(保守基因)基因为模板设计引物，进行PCR扩增。其中引物序列如下：
P36-P1：CCTTAAATATTTTTAATTGCATCCTG，
P36-P2：CGCATGAAACCTATTAAAATAGCT，扩增片段948bp；
16sRNA-P3：GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA，
16sRNA-P4：TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC，扩增片段627bp。
PCR结果显示以各传代株基因组为模板扩增的P36和16sRNA片段大小与以阳性对照组(以猪肺炎支原体J株基因组为模板)扩增的片段大小一致(图1)。
菌落形态观察：将ES-2L菌株涂于改良Friis固体培养基上，置于37℃、5％二氧化碳环境中培养7～10天，进行菌落观察，结果显示ES-2L株菌落形态为边缘光滑的露滴样形态(图2)，符合NY/T 1186-2017标准。
颜色变化单位(CCU)测定：准备11个7mL的无菌西林瓶，每个瓶中加入1.8mL的改良Friis液体培养基，取长至稳定期的ES-2L株菌液200μL，进行连续10倍倍比稀释，放置培养箱中观察14天，以第14天不再变色的稀释梯度为最高的CCU。CCU测定表明，ES-2L在第11天时，其滴度即可达到1010CCU/mL，具有很快的生长速度和很高的滴度(图3)。
将ES-2L株进行全基因组测序，并与其他猪肺炎支原体菌株(168株、ES-2株、J株)基因组进行共线性比对，结果表明(图4)：ES-2L株与168株相比，共线性不是很好，存在大规模的基因倒位、插入、缺失等基因重排现象；ES-2L株与ES-2株相比，总体共线性良好，存在几处缺失、倒位等基因重排现象；ES-2L株与无毒力菌株J株总体共线性良好。
猪肺炎支原体ES-2L株于2020年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为猪肺炎支原体ES-2L Mycoplasma hyopneumoniaeES-2L，保藏编号为CCTCC NO：M 2020313。
实施例2
猪肺炎支原体ES-2株P1代、ES-2L株进行毒力评估。将12头25日龄大小的长白公猪与大白母猪二元杂交猪，分为A、B、C三组，每组4头，其中，A组气管内注射攻毒P1代猪肺炎支原体，B组气管内注射攻毒猪肺炎支原体ES-2L株，C组气管内注射生理盐水(空白对照组)。A组、B组攻毒剂量均为7×108CCU。攻毒后，观察42天后进行剖解，期间进行体温体重的测定及临床症状的观察。
毒力评估实验表明，各个组在攻毒后均没有体温的升高；体重测定并计算日平均增重，ES-2株P1代攻毒组相比于对照组，体重有明显的减轻，ES-2L株攻毒组与对照组没有差异(图5)。P1代组在攻毒后20天出现严重的咳嗽，ES-2L株组没有出现咳嗽。观察42天后进行剖解，观察肺损伤情况，并计算各个组的平均肺炎病变得分，ES-2株P1代组均有肺组织的“肉样或虾肉样”病变，ES-2L株组没有出现支原体典型病变(图6)。按照以下标准对每个肺叶进行病理损伤评分(总和共计28分，见表1)：0分：无病理变化；1分：1％～10％面积损伤；2分：11％～25％面积损伤；3分：26％～50％面积损伤；4分：51％～100％面积损伤，计算每个组的平均病变得分(表2)。综上，ES-2L株的毒力评估实验表明，ES-2L株相比于ES-2株P1代，其毒力有明显的下降，没有出现支原体样损伤。在选择活疫苗候选菌株时，要首先保证安全性，因此，选择ES-2L株可作为疫苗候选株。
表1肺部病变“28分”法评分表
Figure BDA0002669144800000041
Figure BDA0002669144800000051
Figure BDA0002669144800000052
实施例3
将猪肺炎支原体ES-2L株用改良Friis液体培养基在37℃、5％二氧化碳环境中培养至稳定期后，收获菌液，用改良Friis液体培养基将收获的菌液稀释调整滴度至1×107CCU/mL，制备成弱毒疫苗。将15头14日龄大小的长白公猪与大白母猪二元杂交猪分为A、B、C组，每组5头。A组为肌肉注射免疫组，14日龄颈部肌肉注射免疫一次，一免后14天，以同样剂量和程序进行加强免疫一次，每次2mL/头；B组为生理盐水免疫组(攻毒对照组)，C组为空白对照组。免疫剂量为2×107CCU，除空白对照组外，其他两组于一免后28天进行气管内注射7mL猪肺炎支原体ES-2株强毒菌液，攻毒剂量为4.9×108CCU，攻毒后42天进行剖解，期间进行体温体重的测定及临床症状的观察。
ES-2L免疫效果评估表明，各个组在攻毒后均没有体温的升高；体重测定并计算日平均增重，攻毒对照组相比于空白对照组，体重有明显的减轻，肌肉注射免疫组与对照组没有差异(图7)。攻毒对照组在攻毒后20天出现严重的咳嗽，肌肉注射免疫组没有出现咳嗽。观察42天后进行剖解，观察肺损伤情况，并计算各个组的平均肺炎病变减少率，攻毒对照组均有肺组织的“肉样或虾肉样”病变，肌肉注射免疫组没有出现典型病变(图8)。按照上述28评分法，计算每个组的平均病变得分及肺炎病变减少率(平均肺炎病变减少率＝攻毒对照组平均得分—免疫组平均得分/攻毒对照组平均得分)(表3)。肌肉注射免疫组能大幅度地降低支原体引起的肺损伤，其平均肺炎病变减少率为90.4％(一般认为肺炎病变减少率至少大于60％，具有免疫保护效果)。并于免疫前、免疫后15天、30天(dpi0、dpi15、dpi30)分别采集血清，采用IFN-γ、IL-6ELISA试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)进行细胞免疫因子检测，结果表明(图9)，IFN-γ、IL-6水平在免疫后15天、30天有明显的上升，说明ES-2L株免疫后，可以诱导机体产生高水平的细胞免疫。综上，猪肺炎支原体ES-2L株免疫效果评估表明，ES-2L株肌肉注射免疫可以对猪群产生较好的免疫保护效果，并且肌肉注射的使用方式更易于临床推广和使用。
表3ES-2L株免疫保护效果评估实验，各组平均肺炎病变减少率结果
Figure BDA0002669144800000061
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccttaaatat ttttaattgc atcctg 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcatgaaac ctattaaaat agct 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagccttcaa gcttcaccaa ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtgttagtg acttttgcca cc 22

Claims (8)

1.一种猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）弱毒株，其特征在于：所述的猪肺炎支原体弱毒株的命名为猪肺炎支原体ES-2L，保藏编号为CCTCC NO：M 2020313。
2.权利要求1所述的猪肺炎支原体弱毒株在制备猪肺炎支原体弱毒疫苗中的应用。
3.一种猪肺炎支原体弱毒疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的猪肺炎支原体弱毒株。
4.根据权利要求3所述的猪肺炎支原体弱毒疫苗，其特征在于：包含药学上可接受的辅料。
5.权利要求1所述的猪肺炎支原体弱毒株在制备猪多价型疫苗中的应用。
6.一种猪多价型疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的猪肺炎支原体弱毒株，以及猪其他病原中的一种或多种的免疫原。
7.根据权利要求6所述的猪多价型疫苗，其特征在于：包含药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求6所述的猪多价型疫苗，其特征在于：包含药学上可接受的佐剂。
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