CN109055283B

CN109055283B - 一种猪肺炎支原体及其在制备灭活疫苗中的应用

Info

Publication number: CN109055283B
Application number: CN201811161922.5A
Authority: CN
Inventors: 谭臣; 张焱焱; 陈焕春; 王湘如; 宗冰冰
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN109055283A

Abstract

本发明公开了一种猪肺炎支原体及其在制备灭活疫苗中的应用，属于微生物与免疫技术领域。本发明猪肺炎支原体的分类命名为猪肺炎支原体ES‑2 Mycoplasma hyopneumoniae ES‑2，保藏编号为CCTCC NO：M 2018570。本发明的猪肺炎支原体具有生长速度快、生长滴度高(37℃培养2天可以达到10¹³CCU/mL)且免疫保护力强等特点，可用于制备猪支原体肺炎灭活疫苗。本发明的猪肺炎支原体用于制备灭活疫苗可大大的节约时间和成本，减少疫苗的生产成本。

Description

一种猪肺炎支原体及其在制备灭活疫苗中的应用

技术领域

本发明属于微生物与免疫技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体及其在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术

猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎，我国俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病，该病具有高传染性、高发病率和低死亡率的特点。其主要症状为咳嗽和喘气，病变的特征在肺、肺门淋巴结和纵膈淋巴结。肺尖叶、心叶、中间叶、膈叶的前下部，形成淡红色或灰红色，半透明状，界限明显，似鲜嫩肌肉样病变，俗称“肉变”。随病情加重，病变色泽变深，坚韧度增加，外观不透明，俗称“胰变”或“虾肉样变”。可造成带菌病猪生长发育缓慢、生长率降低、饲料转化率降低以及饲料和人力的浪费。此外，猪肺炎支原体是猪呼吸道疾病综合征的重要病原之一，可与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒并发，引起机体免疫抑制，从而导致多种疫苗接种失败，对养猪业造成重大经济损失，是当前常发生、流行广、难净化的重要疫病之一。该病在任何季节都能够发生，但在气候寒冷、突变、潮湿或者多雨的时候更容易发生。在自然感染情况下，该病只能够在猪群中发生，且不同品种、性别和年龄的猪只都能够感染该病，其中哺乳仔猪最容易感染，其次是处于妊娠后期的母猪和哺乳母猪，成年猪只往往呈隐性感染。在集约化养猪场，该病具有较高的发病率，一般在屠宰场能够发现有40％到80％的肺脏存在病变。

猪肺炎支原体是能够独立存活的细菌中染色体最小且不能合成细胞壁，由于其没有细胞壁，致使临床上很多抗生素对其引起的感染治疗无效，因此通过疫苗预防该病是最有效策略。目前，临床上针对该病应用的疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗。由于弱毒疫苗需要通过胸腔注射，致使免疫程序繁杂，同时在免疫接种过程中造成猪只应激，从而阻碍了弱毒疫苗的推广。灭活疫苗在应用中有使用安全，易于保存，无污染危险等优点，然而其缺点在于接种剂量大。在猪肺炎支原体灭活疫苗的生产过程中，其生长速度慢生长滴度低的特性增加了生产成本。为了降低猪肺炎支原体的生产成本，分离出生长速度快生长滴度高的猪肺炎支原体尤为重要。

由于猪肺炎支原体的分离工作程序复杂，目前NCBI上报道的体外分离菌株共有8株，另外，猪肺炎支原体对营养要求高、生长缓慢且滴度不高，因此可供疫苗生产的菌株极为有限。鉴于猪肺炎支原体的发展现状，本发明的目的在于分离出生长速度快生长滴度高，且免疫保护力强的猪肺炎支原体。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种生长速度快、生长滴度高且免疫保护力强的猪肺炎支原体菌株及其在制备灭活疫苗中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种猪肺炎支原体，为猪肺炎支原体ES-2株，该菌株于2018年8月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为猪肺炎支原体ES-2Mycoplasma hyopneumoniae ES-2，保藏编号为CCTCC NO：M 2018570。

所述的猪肺炎支原体ES-2株具有生长速度快、生长滴度高且免疫保护力强等特点，其可用于制备猪支原体肺炎灭活疫苗。

一种猪肺炎支原体灭活疫苗，包含所述的猪肺炎支原体ES-2株，还可以包含其药学上可接受的佐剂。

本发明具有如下优点和有益效果：相较于已报道的猪肺炎支原体，本发明的猪肺炎支原体有生长速度快、生长滴度高(37℃培养2天可以达到10¹³CCU/mL)且免疫保护力强等特点。免疫保护力强，可作为理想的抗原，对临床上猪肺炎支原体引起猪肺炎疾病起到更加有效的防治；生长速度快且生长滴度高，可大大的节约时间和成本，减少疫苗的生产成本。

附图说明

图1是P36基因的PCR扩增结果图。图中，M：DL 2000marker；1：通过引物对P1/P2扩增基因P36；2：阴性对照；3：阳性对照。

图2是16sRNA基因的PCR扩增结果图。图中，M：DL 2000marker；1：通过引物对P3/P4扩增基因16sRNA；2：阴性对照；3：阳性对照。

图3是感染猪肺炎支原体ES-2株的猪肺部出现典型肉变图。

图4是猪肺炎支原体ES-2株对一元猪免疫保护实验的结果图。A：未免疫攻毒组猪的肺部出现典型“肉变”；B：免疫攻毒猪肺部未出现典型“肉变”。

生物材料保藏信息

猪肺炎支原体ES-2株保藏日期2018年8月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名为猪肺炎支原体ES-2Mycoplasma hyopneumoniae ES-2，保藏编号为CCTCC NO：M 2018570。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本发明的猪肺炎支原体分离自一头形体消瘦、咳嗽喘气明显的恩施土猪肺部，其分离过程为：1)选取形体消瘦长期咳嗽和喘气的长年育肥猪；2)现场解剖后，立即将肺取出后保藏于干冰，以便长途运输；3)将病料从干冰中拿出，放于超净台中解冻；4)取肺部典型虾样肉变和正常肺组织交叉处样品，放于无菌EP管中，并加入1mL灭菌PBS，放于研磨仪中研磨；5)使用60赫兹研磨300秒后，放于4℃离心机中5000rpm/min离心5min；6)使用0.45μm滤器除去离心后组织上清液中的细菌，将过滤后的上清液放于无菌试管中，随后加入四倍体积的Friis培养基；7)放于含5％CO₂培养箱中37℃培养3天后，将培养物稀释涂到Friis固体培养基上；8)放于含5％CO₂培养箱中37℃培养5天后，挑取单克隆于新鲜的Friis培养基；9)放于含5％CO₂培养箱中37℃培养2天后，通过PCR鉴定其是否为猪肺炎支原体。

PCR鉴定方法为以猪肺炎支原体P36(特有基因)和16sRNA(保守基因)基因为模板设计引物，进行PCR扩增。其中引物序列如下：

P36-P1：CCTTAAATATTTTTAATTGCATCCTG，

P36-P2：CGCATGAAACCTATTAAAATAGCT，扩增片段948bp；

16sRNA-P3：GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA，

16sRNA-P4：TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC，扩增片段649bp。

PCR结果显示以本分离株基因组为模板扩增的P36和16sRNA片段大小与以阳性对照组(以猪肺炎支原体J株基因组为模板)扩增的片段大小一致(图1、图2)。

对扩增片段测序，将P36(SEQ ID NO.5)和16sNA(SEQ ID NO.6)的测序结果与GenBanK中的相应序列进行比对，比对结果见如表1。因此可判定该分离株为猪肺炎支原体，并将其命明为猪肺炎支原体ES-2。

表1猪肺炎支原体ES-2分离株P36、16sRNA扩增片段序列与Genbank中相应序列比对

猪肺炎支原体ES-2株于2018年8月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为猪肺炎支原体ES-2Mycoplasma hyopneumoniae ES-2，保藏编号为CCTCC NO：M 2018570。

实施例2

目前测定猪肺炎支原体生长滴度的方法主要是颜色变化单位(Colour ChangeUnit，CCU)滴度实验。因为猪肺炎支原体可以代谢葡萄糖产酸，因此用酚红作为指示剂使液体培养基的pH值发生变化便可应用于间接测定培养物中猪肺炎支原体的数量。将冻存的猪肺炎支原体ES-2株接入到Frris培养基中，于含5％CO₂的培养箱中37℃复苏3天；复苏后再按1:10(体积比)的比例转接到Frris培养基中，5％CO₂、37℃培养48h后根据颜色变化单位滴度实验测定猪肺炎支原体ES-2株的滴度，具体操作步骤如下：将4.5mL新配制的含酚红的Frris培养基(1L新的Frris培养基配制好后加入经0.22μm滤器过滤后的0.4％的酚红1.15mL)分装于25mL不透气细胞培养瓶，在第1个25mL不透气细胞培养瓶中加入菌液0.5mL，混匀后取0.5mL加入到第2个25mL不透气细胞培养瓶中，依次做递减稀释至10^-16，放于5％的CO₂培养箱中37℃培养14天；同时设空白对照(未转接培养物的Frris培养基)；每隔24h观察一次，总共观察14天，以Frris培养基颜色最后一个发生变化的稀释倍数为最终判定结果，如最后一个变色的稀释度为10^-13，则其生长滴度为10¹³CCU/mL。2011年，华中农业大学邹浩勇的博士论文《猪肺炎支原体的分离鉴定及基因工程疫苗的研究》中报道了一株猪肺炎支原体的分离培养，其生长滴度最大可以达到10⁷CCU/mL且需要七天，显然由于其生长速度慢生长滴度低，无法满足疫苗的大规模生产需求。本实施例通过使用Frris培养基测定猪肺炎支原体ES-2株的生长滴度，猪肺炎支原体ES-2株的生长滴度在第2天可以达到10¹³CCU/mL(表2)，相比之前的报道提高了5-6个梯度且时间缩短5天。

表2

实施例3

猪肺炎支原体是引起猪流行性肺炎的主要病原之一，该病原致死率低但致病率极高，一旦感染该病原则很难根除。1996年，Friis在《Rev.sci.tech.Off.int.Epiz.》期刊上发表的论文《Swine mycoplasmoses》报道了强致病性的猪肺炎支原体引起肺部支气管炎症，引起的病灶一般出现在尖叶、心叶和副叶，同时肺大叶上边缘也可发生病变，典型病变为“肉变”。弱毒的猪肺炎支原体不引起肺部病变。本发明的猪肺炎支原体ES-2株可引起猪肺部心叶典型虾样肉变(图3)，表明猪肺炎支原体ES-2株是一株强毒株。

猪肺炎支原体ES-2株生长速度快生长滴度高，而且毒力强，因此可作为猪肺炎支原体疫苗生产的候选菌株。为了研究其作为疫苗的保护效果，本实施例进行了对一元猪的免疫保护实验，具体实验步骤如下：选取没有携带猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和猪肺炎支原体一元仔猪为实验对象。在培养2天后的猪肺炎支原体ES-2株培养物中加入0.2％的甲醛溶液，放入37℃灭活48h后，用生理盐水稀释灭活的猪肺炎支原体ES-2株并加入14％的氢氧化铝佐剂制备成猪肺炎支原体ES-2株灭活疫苗(5×10⁷/mL)，同时鉴定灭活后的猪肺炎支原体ES-2株灭活是否完全。经过培养法证明猪肺炎支原体ES-2株被完全灭活后，通过颈部肌肉对七日龄仔猪免疫注射2mL猪肺炎支原体ES-2株灭活疫苗，一免14天后对其二免(二免免疫剂量及注射部位同一免)，同时设定空白组；二免14天后对其攻毒，通过气管感染7×10⁷CCU猪肺炎支原体ES-2株，攻毒45天后对其解剖观察其肺部病变。结果(图4)显示，猪肺炎支原体ES-2株作为疫苗的免疫保护效果非常显著，相比于空白攻毒组肺部出现典型虾样肉变(图4A)，免疫攻毒组的肺部没有出现典型的虾样肉变(图4B)。

上述结果表明本发明的猪肺炎支原体Es-2株作为疫苗株不仅可以降低成本，而且其免疫保护效果也很好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种猪肺炎支原体及其在制备灭活疫苗中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccttaaatat ttttaattgc atcctg 26

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcatgaaac ctattaaaat agct 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagccttcaa gcttcaccaa ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgttagtg acttttgcca cc 22

<210> 5

<211> 891

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 5

ggggggtctg gatgtcggaa ttccttcctt tatgcagcaa tgaatcaagg acttgcatcc 60

gagtatggaa ttattgatat taaccctgat tttgccgatg gtaatgcttt tgattttgaa 120

gatgcctcag cttctttacc ttttccgatt agtgtctcac gttatgaata taaagatcta 180

aaagatgctg attttattgt aattacagcg ggaagaccac aaaaaccggg tgaaactcgg 240

cttgaattag tagctgataa catccgaatt atccgggaaa ttgcactaaa agtcaaagaa 300

agtggcttta gtggaataag tattattgtt gctaatcctg ttgatataat tacaagggct 360

taccgggatg catctggatt ttccgatcaa aaagttatcg gtagtggaac tgttttagat 420

acagcaaggc ttcaatttgc aatcgcaaaa agagcaaaag tatctcctaa ttcggttcag 480

gcctacgtaa tgggtgaaca tggtgattca tcttttgttg cttattcaaa tattaaaatt 540

gccggtgaat gtttctgtgc ttattctaaa ctaaccggaa ttgatagctc aaattacgaa 600

aaagaacttg aatatccagt ttctcgccgg gcttatgaaa ttattaatcg taaaagggca 660

acattttatg gaattggtgc agctattgcc aaaatagttt ctaatattat caaagataca 720

aaaaatatta tgattgccgg agcaaattta cgaggagaat acggatttca cggagtaaat 780

atcggagttc cagttgtttt aggagcaaac ggaattgaaa aaattattga gattagtctt 840

aatgataaag aaaaagaaaa atttgccaaa tcagtgcaat catttttaaa t 891

<210> 6

<211> 612

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 6

agaaatgggg gtgcgcaaca ttagttagtt ggtagggtaa aagcctacca agacgatgat 60

gtttagcggg gccaagaggt tgtaccgcca cactgggatt gagatacggc ccagactcct 120

acgggaggca gcagtaagga atattccaca ataagcgaaa gcttgatgga gcgacacagc 180

gtgcaggatg aagtctttcg ggatgtaaac tgctgttgta agggaagaaa aaactagata 240

ggaaatgctc tagtcttgac ggtaccttat tagaaagcga cggcaaacta tgtgccagca 300

gccgcggtaa tacataggtc gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgtccgta 360

ggttttttgt taagtttaaa gttaaatgct aaagctcaac tttagtccgc tttagatact 420

ggcaaaatag aattatgaag aggttagcgg aattcctagt ggagtggtgg aatacgtaga 480

tattaggaag aacaccaata ggcgaaggca gctaactggt catatattga cactaaggga 540

cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgat 600

cattagttgg tg 612

Claims

1.一种猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)，其特征在于：所述猪肺炎支原体的命名为猪肺炎支原体ES-2，保藏编号为CCTCC NO：M 2018570。

2.权利要求1所述的猪肺炎支原体在制备猪支原体肺炎灭活疫苗中的应用。

3.一种猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的猪肺炎支原体。

4.根据权利要求3所述的猪肺炎支原体灭活疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述猪肺炎支原体药学上可接受的佐剂。