CN101280292A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株、其弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株HuN4以及由该强毒株HuN4传代致弱的弱毒疫苗株HuN4－F112(微生物保藏号是：CGMCC No.2484)，本发明还公开了该弱毒疫苗株在预防或治疗高致病性猪蓝耳病中的应用，属于生物医药领域。本发明弱毒疫苗株HuN4－F112可制备成单苗或联苗(活疫苗或灭活疫苗)等，可有效预防或治疗高致病性猪蓝耳病，也可将其制备成诊断高致病性猪蓝耳病的诊断试剂。本发明弱毒疫苗株HuN4－F112具有安全性好、保护效率高等优点。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株、其弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及一株病毒强毒株以及由其传代致弱的弱毒疫苗株，尤其涉及一株猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株HuN4、由该强毒株HuN4传代致弱的弱毒疫苗株HuN4-F112，本发明还涉及弱毒疫苗株在预防或治疗高致病性猪蓝耳病中的应用，该属于生物医药领域。

背景技术

2006年春夏之际，我国南方部分地区发生以发热、皮肤发红、高发病率和高死亡率为主要特征的猪“高热病”，随后逐渐蔓延至全国大部分省份。经大量的病原分离鉴定、动物试验证实，猪“高热病”的主要病原为高致病性猪蓝耳病病毒变异株，该病也被称为“高致病性猪蓝耳病”。直至今日，疫病形势依然严峻，生猪饲养是我国广大农民赖以增收的主要产业，如何防控该病已经成为目前最为关心的问题。

高致病性猪蓝耳病(高致病性猪繁殖与呼吸综合征)有以下特点：高热，体温可达41℃以上，并伴有高发病率和死亡率，通常情况下发病率高达50％以上，死亡率约40％～90％。其中，感染猪、康复猪及其污染物是本病的主要传染源。不同日龄、不同品种的猪均可发生。本病主要通过呼吸道或通过公猪的精液经生殖道在同猪群间进行水平传播，也可以进行母子间的垂直传播。病毒可通过鼻、眼分泌物、胎儿及子宫甚至公猪的精液排出，感染健康猪只。此外，风媒传播在本病流行中具有重要的意义，通过气源性感染可以使本病在3km以内的猪群中传播，传播速度极快。

高致病性猪蓝耳病有以下症状：病猪精神沉郁，采食量下降，发病严重者食欲废绝，嗜睡，呕吐，拉稀，流鼻涕，呼吸困难。病死猪耳尖多因发绀而呈蓝紫色，体表常有出血尤其皮表、肢体远端出血；有的臀部、腹部及后肢皮肤出现纽扣状溃疡或结痂。起初个别猪只发烧，随后迅速传播至大部分猪，体温升高至40～41.5℃，出现个别猪突然死亡。病猪呼吸困难，喜伏卧，部分猪出现严重的腹式呼吸，有的表现喘气或呈不规则呼吸。部分患猪眼分泌物增多，出现结膜炎症状。部分猪伴有腹泻。发病猪群死亡率很高，有的猪场高达50％以上，其中以保育肥猪最为严重。部分母猪在怀孕后期(100～110天)出现流产、死胎。病程稍长的病猪全身苍白，出现贫血现象，被毛粗乱，部分病猪后肢无力，个别病猪濒死前不能立，最后全身抽搐而死。

剖检病理变化：病猪的淋巴结一般均有肿大、出血，其中以腹股沟淋巴结、颌下淋巴结和肠系膜淋巴结出血严重，有的腹股沟淋巴结只是肿大，无出血现象；肺有不同程度的实变；喉头气管基本正常，个别喉头有黏液；大部分猪心内膜和心外膜有出血点；脾脏基本正常，个别边缘有坏死；肝脏基本正常；肾脏多数有条状出血斑；胃基本正常，个别有胃底溃疡和出血；小肠多数管壁透明，个别猪肠道卡他出血。

高致病性猪蓝耳病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)变异株。通过对全国各地分离的PRRSV变异株进行完整的ORF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现，来自不同猪场的PRRSV高度同源，而且在Nsp2基因上都有两个相同位点的缺失，Nsp2基因的第483位和533-561位氨基酸发生缺失。而与2005年以前的PRRSV的Nsp2同源性仅为69.8-86.2％。新分离毒株的GP5基因相互之间也是高度同源(98.5％-100.0％)，与以前的PRRSV毒株相比变异也比较大。

同其它病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于PRRS的治疗，免疫接种是防制该病的最有效方法。目前商品化的PRRS疫苗主要是由经典株制备的弱毒苗和由变异株制备的灭活苗。经由经典株制备的弱毒苗免疫后，在变异株的攻击下多数猪会发病、增重减慢，部分猪发生死亡；经由变异株制备的灭活苗免疫猪后，在变异株的攻击下绝大多数猪会发病、死亡。由此可见目前的PRRS疫苗虽然种类繁多，但没有任何一种疫苗可对猪体产生足够的保护作用。面对依然十分严峻的疫情，开发新型高效的PRRS疫苗已是迫在眉睫。

发明内容

本发明目的之一是提供一株猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株。

本发明目的之二是提供一株由该猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株传代致弱的弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对于高致病性猪蓝耳病具有良好的保护效力。

本发明目的之三是提供一种预防或治疗高致病性猪蓝耳病的疫苗组合物。

本发明的上述目的分别是通过以下技术方案来实现的：

猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株的分离：从我国湖南省暴发“高热综合症”猪场的病猪的脏器为病料，将所采集的病料研磨，离心、过滤取滤液冻存待用，Marc-145细胞在37℃下培养48～72h形成单层后，每瓶接种1ml滤过的病料悬液上清，吸附2～4h后，换含4％胎牛血清的MEM培养液继续在37℃下培养，观察4～5天有无细胞病变产生。当60～70％细胞出现CPE变化时收毒，将有病变的毒株传2～3代后用PRRSV的N、GP5引物进行PCR扩增；用PRRSV CH-1a株的N、GP5特异单抗通过间接免疫荧光方法进行鉴定。试验证明，该分离毒株为PRRS病毒，命名为PRRSV HuN4株；通过对HuN4株的毒力的测定发现该株病毒对仔猪具有较强的致死性。对HuN4株进行全序列测定，其序列结果为SEQ ID NO：1所示。

PRRSV HuN4株与PRRSV-N、GP5蛋白特异性单克隆抗体呈阳性反应，而与HCV、PRV、PPV、TGEV、PEDV和HEV无交叉反应。采用RT-PCR技术对我国分离的HuN4株的ORF7和ORF5基因进行进行了扩增，分别扩增出2个目的基因片段，在此基础上对分离到的PRRSV HuN4株做了PRRSV Nsp2和GP5的序列分析，证明HuN4株属于北美洲型，与已分离鉴定的JXA-1具有较高的同源性。

本发明PRRSV弱毒株HuN4-F112的培育：将所分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株HUN4在Marc-145细胞上连续传代，经3次蚀斑克隆，对传代过程中不同代次病毒的培养特性、纯粹性和生物学特性进行了检测，结果表明各代次病毒无外源病毒、细菌和霉菌污染，且能被高致病性猪蓝耳病病毒特异性的阳性血清中和。根据以上结果并结合不同代次病毒的序列分析结果比较，本发明选择猪繁殖与呼吸综合征病毒HUN4株第112代细胞毒(命名为HuN4-F112)作为高致病性猪蓝耳病活疫苗(HUN4株-F112)的基础种子代次。

本发明PRRSV弱毒株HuN4-F112的分类命名为：猪繁殖与呼吸综合征病毒，其保藏号是：CGMCC NO.2484；保藏时间是：2008年5月8日；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明HUN4-F112株的安全性和免疫原性试验结果表明，本发明弱毒株的安全性好，本发明弱毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪只均安全、无副反应。

对本发明HuN4-F112株进行全序列测定，其序列结果为SEQ ID NO：2所示。

本发明弱毒株HuN4-F112的形态学观察：传至80代以后其病毒滴度达到最高并保持稳定，电镜观察发现低代次病毒与高代次的病毒粒子形态有所改变，蚀斑形态比较发现低代次病毒的蚀斑大小不一，而高代次病毒形成的蚀斑大小均一。电镜负染观察发现HuN4-F112病毒粒子以圆形为主，直径为40-100nm。

将本发明弱毒株HuN4-F112与药学上可接受的佐剂相配伍，可得到一种预防或治疗高致病性猪蓝耳病的疫苗组合物。

具体的，本发明疫苗组合物可参考以下方法制备得到：

选用生长良好的Marc-145细胞，倒掉培养液后，换以含1％病毒种子液的新鲜培养液(DMEM培养液)，置于37℃继续培养；接本发明弱毒株HuN4-F112后，每日观察；发现生长异常、污染的细胞应废弃；培养2-3天后，约有80％的细胞出现病变，并于对照细胞差异显著时，即可收获，经3次冻融后，置-20℃保存；将收获的病毒取样进行无菌检验，应无细菌生长；效价均应≥10^6.5TCID₅₀/ml；将检验合格的病毒液与蔗糖明胶保护剂(蔗糖280g，明胶49g，加去离子水700ml加热溶解后，分装，110-116℃灭菌30-60分钟)按照7∶1混合(病毒液保持在10-20℃，保护剂40-50℃)，充分摇匀后分装，边分装边摇动，每只疫苗瓶分装量为2ml，迅速进行冷冻真空干燥，得到本发明疫苗组合物。

本发明疫苗组合物的使用方法：

(1)、接种途径：颈部肌肉注射。

(2)、接种剂量：哺乳仔猪0.5头份，断奶仔猪及架子猪1头份。

附图说明

图1用单克隆抗体通过间接免疫荧光试验检测新分离的PRRSV：A为PRRSV CH-1a N蛋白单抗；B为PRRSV CH-1a GP5蛋白单抗。PRRSV聚集在感染细胞的胞浆区(400×)。

图2不同代次病毒蚀斑大小；高代次病毒蚀斑大小均一，低代次病毒蚀斑大小不一。

图3猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株F5和F112在Marc-145细胞上形成的病变结果。

图4猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株不同代次的病毒滴度。

图5猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株F5和F112代电镜负染照片。F5代病毒粒子以椭圆形为主，F112病毒粒子以圆形为主，直径40-100nm。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株HuN4的分离与鉴定

1.材料与方法

1.1Marc-145细胞、抗PRRSV-N、GP5蛋白的单克隆抗体由哈尔滨兽医研究所保存。

1.2病料采集和处理  采集南方某市猪场发生高热病猪的抗凝血、肺、肾脏和淋巴结。

1.3Marc-145细胞培养  从液氮中取出冻存的Marc-145细胞2～3个安瓶，在37℃水浴中迅速解冻。将每个安瓶用1000r/min离心5～10min，弃去上清液，用2～3ml含有100IU/ml青霉素、80μg/ml链霉素、6％犊牛血清和0.5％水解乳蛋白的DMEM重新悬浮细胞，然后吸入装有10ml培养液的培养瓶中摇匀，置37℃、5％CO₂的培养箱中静止培养，72h后待其形成良好单层细胞后扩大培养，每隔72～96h传代1次。

1.4病毒分离  将采集的病料研磨，离心、过滤取滤液冻存待用，Marc-145细胞在37℃下培养48～72h形成单层后，每瓶接种1ml滤过的病料悬液上清，吸附2～4h后，换含4％胎牛血清的MEM培养液继续在37℃下培养，观察4～5天有无细胞病变产生。当60～70％细胞出现CPE变化时收毒，将有病变的毒株传2～3代后用PRRSV的N、GP5引物进行PCR扩增；用PRRSV CH-1a株的N、GP5特异单抗通过间接免疫荧光方法进行鉴定。

1.5病毒鉴定

1.5.1间接荧光试验  将出现CPE变化的细胞培养物接种Marc-145细胞，培养48h后刮取涂片，冷丙酮固定10min，用PBS冲洗后，分别滴加抗PRRSV-N、GP5蛋白的单克隆抗体，设立的PRRSV VR-2332毒株感染的Marc-145细胞作阳性对照，未接毒的Marc-145细胞作阴性对照也作同样处理，37℃作用45min，用PBS冲洗后，分别滴加荧光二抗于37℃作用45min，PBS冲洗后荧光显微镜下观察。

1.5.2致病性试验

1.5.2.1对仔猪的毒力  将经蚀斑克隆纯化过的PRRSV HuN4株强毒稀释为每ml病毒含量为10^5.0TCID₅₀，用60日龄健康易感PRRSV阴性(IFA抗体效价≤1∶4)仔猪5头，每头滴鼻接种2ml，连续观察21日。

1.5.2.2理化特性试验  分离毒株的3代细胞毒悬液(1×10^5.0TCID₅₀/ml)5ml，平均分装于5试管中，试管1于56℃水浴作用45min；试管2加20％的乙醚震荡10min后，4℃过夜，无菌挥去乙醚；试管3先用0.1MHCl调pH至3.0，于4℃作用2h后用0.1NaOH调pH至7.2；试管4加5-碘脱氧尿核苷(5-IUDR)50μl，4℃作用12h；试管5作未处理的正常对照，分别测定TCID₅₀。

1.5.3红细胞凝集试验  采用微量板法，分别用0.5％的鸡、豚鼠、大鼠、兔和绵羊的红细胞悬液测定PRRSV的HA滴度，以50％红细胞凝集的最高稀释度作为判定终点。

1.5.4形态学观察  分离毒株的3代细胞毒悬液60ml反复冻融3次，5000r/min离心20min取上清(S1)待用；将沉淀用0.01M的PBS(pH7.2)5ml悬浮，用超声波反复裂解沉淀3次，100W，30S/次，再用6000r/min离心20min取上清(S2)，将S1和S2混合，27000r/min(SW28转子)离心3h，沉淀用2ml的TNC缓冲液悬浮，取1ml悬浮液用5g/L的磷钨酸复染；另1ml悬浮液与等量的1∶80的胶体金标记的PRRSV抗体在37℃作用30min，分别取小样作电镜观察。

1.5.5交叉反应试验  用猪瘟病毒(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的抗血清分别作1∶40稀释，然后将上述血清分别与出现CPE变化的细胞培养物(HuN4株)和未感染Marc-145细胞反应。

1.6分离毒株基因扩增及序列分析

对检测到PRRSV(HuN4株)扩增其Nsp2(扩增区域是2535nt-3307nt)、ORF7和GP5全基因(引物序列见表1)，克隆并测序。并与GenBank中的PRRSV对应序列进行比较并绘制系统进化树。

表1分离毒株基因扩增使用的引物

2、试验结果

2.1病毒分离  将处理好的病料接种于生长良好的Marc-145细胞，3～4天左右，可见病变细胞发生聚丛成堆现象，并且越来越严重。将该毒传2～3代，经RT-PCR可扩增出PRRSV的N、GP5基因；用PRRSV CH-1a株的N、GP5单抗进行间接免疫荧光试验，可见感染细胞的胞浆有特异性的荧光(图1)。细胞分离物用PCR或RT-PCR检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒均为阴性。该分离株在Marc-145细胞上传1～2代后，产生的CPE变化规律、典型，一般在接种48h产生明显CPE变化，细胞呈灶状变化、突起；72h后，细胞皱缩、呈灶状脱落，接种后4～5天细胞病变发展迅速，80％～100％细胞产生CPE变化。

2.2病毒鉴定

2.2.1间接免疫荧光染色方法  用抗PRRSV-N、GP5蛋白的单克隆抗体对PRRSV HuN4毒株感染的Marc-145细胞进行间接免疫荧光染色，未接种的Marc-145细胞作为阴性对照。结果感染该分离株和Marc-145细胞胞浆均呈现强阳性荧光，而对照细胞则呈阴性(见表2)。因此证明该分离毒株为PRRS病毒，命名为PRRSV HuN4株。PRRSV HuN4株的细胞培养物用PCR或RT-PCR检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒均为阴性。

表2PRRSV-N、GP5蛋白的单抗对PRRSV HuN4株感染细胞的间接荧光染色结果

2.2.2对仔猪的毒力试验  5头仔猪攻毒后第4天体温开始升高，并持续到死亡前1-2天体温才下降，体温最高均超过40.5℃，其中两头超过41℃，攻毒猪还表现出精神沉郁、厌食、消瘦、眼圈发黑、眼睑水肿、体表有大量脂溢性皮炎状红斑。从攻毒后第7天开始有猪死亡，至攻毒后21天全部死亡，死亡猪的体表皮肤由于末梢血管中的血液循环发生障碍而表现出皮肤变红变紫，耳朵发绀。

病理剖检显示，死亡最主要的原因是由于肺部感染引发炎症反应，肺实变导致呼吸衰竭。体表淋巴结肿大，部分猪胃部有出血和溃疡，心、肝、脑、脾脏、肾脏眼观病变不明显。病理组织变化结果显示：1)全身性的免疫系统损伤；2)全身性的血管炎、血栓和淤血；3)呼吸系统的肺脏以淋巴细胞浸润为主造成肺泡隔增宽而形成的间质性肺炎；而肾脏在死亡早期的猪表现为部分肾小球富核、核浓缩进而形成肾小球坏死，随着死亡时间的延长表现为肾间质有大量淋巴细胞浸润形成严重的间质性肾炎。脑组织血管由于大量的淋巴细胞浸润形成严重的血管套并有严重的血栓和淤血，部分神经细胞液化坏死。肝脏的汇管区内有淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润，肝小叶内有淋巴细胞和红细胞浸润并有小灶状坏死。

2.2.3理化特性试验  分别测定经过处理和未经处理的细胞毒悬液的TCID₅₀，结果见表3。

表3  HuN4株理化特性试验结果

2.2.4红细胞凝集试验  经微量板法检测细胞毒悬液对0.5％的鸡、豚鼠、大鼠、兔和绵羊的红细胞均无凝集作用。

2.2.5形态学观察  纯化后的PRRSV，经磷钨酸复染的电镜观察结果为，在镜下可见大量直径42～78nm呈球型的病毒粒子，经胶体金标记的PRRSV抗体作用后的电镜观察结果为，在镜下可见有大量的金颗粒吸附在病毒粒子周围。

2.2.6交叉反应试验  用HCV、PRV、PPV、TGEV、PEDV、HEV抗血清对HuN4株感染的Marc-145细胞间接免疫荧光染色结果(见表4)表明该分离毒株与HCV、PPV、TGEV、PEDV、HEV之间无交叉抗原。

表4  各种病毒的阳性血清对HuN4株感染Marc-145细胞间接免疫荧光染色结果

2.2.7序列分析  本发明强毒株的基因组全长15297个碱基，Nsp2基因的第483位和535-563位氨基酸发生缺失。对其它省市发病猪场PRRSV阳性样品中扩增的Nsp2序列分析发现，它们都有和HuN4株完全一致缺失特征。这48株PRRSV的Nsp2序列相互之间高度同源，同源性为98.2％～100％，而与2005年以前的PRRSV的Nsp2同源性仅为69.8～86.2％。PRRSV HuN4株与其他新分离毒株间的GP5基因相互之间也是高度同源(98.5％～100.0％)，与以前的PRRSV毒株相比变异也比较大，尤其是第151位氨基酸的改变被认为是与毒力增强有关。HuN4株的Nsp2基因、GP5基因和全基因组核苷酸与JXA1株相比同源性分别为99.7％、99.8％和99.6％，两个病毒全基因组氨基酸同源为99.4％。

试验结论：

(1)本发明PRRSV HuN4株的细胞适应能力与2005年前的毒株相比显著提高，先前毒株很难直接适应Marc-145细胞，往往需适应原代肺泡巨噬细胞后才能适应Marc-145细胞，且细胞病变不显著。而新分离的毒株第1代即可适应Marc-145细胞，并且产生明显的细胞病变，正是因为这个特点，本发明人短时间内在10个省份分离到15株病毒，这种现象在以前PRRSV分离中是很罕见的。

(2)临床症状和病理变化比以往毒株严重，例如本发明以PRRSV CH-1a毒株攻击仔猪临床症状只表现为中等程度的发热，体温一般不超过40.5℃，其他临床症状并不明显，同样的饲养环境也没发生继发细菌感染的症状，攻毒猪几乎没有致死情况的发生。而PRRSV HuN4株攻猪后临床症状明显，并具有显著的致死能力，病理变化中的脑部海马区血管细胞肿大增厚明显，这是否与现地许多发病猪出现神经症状有关，这也说明新分离的毒株具有感染脑组织的能力，这可能也是毒力增强的一种表现，另外胃部有出血和溃疡这也是以往PRRSV攻毒试验所未见到的。

(3)PRRSV HuN4株与其他新分离毒株间分子特征高度一致，而与先前毒株又有显著差异，尤其是Nsp2基因的缺失和结构蛋白基因序列的突变，这些变化中哪些对毒力的改变起决定作用还有待进一步的研究。综上所述，2006年从爆发所谓“高热综合症”的猪场分离到的PRRSV分离株有一个显著特征就是在Nsp2基因上有两处缺失，分子流行病学分析发现在不同省市猪场流行的PRRSV相互之间高度同源，与以往PRRSV有很大的区别，尤其是致病能力大大增强，因此，可以初步认定这种新的PRRSV变异株是南方猪“高热综合症”流行的主要病因(可能有部分猪场发病是由其它原因引起的)。

实施例2  猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的培育

1.材料方法

1.1病毒细胞培养及克隆化  进行病毒培育的Marc-145细胞用DMEM细胞培养液培养，其中含8％灭活犊牛血清、100U/ml的青霉素、80μg/ml的链霉素，并用NaHCO₃调整pH值至7.2左右，过滤除菌。用此细胞培养液复苏Marc-145细胞或使之传代至容量为100ml的灭菌的细胞培养瓶里，待长成良好细胞单层后用于接种病毒。

1.2种毒的克隆化  将实施例1所分离的高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株在Marc-145细胞上传代，分别在传至3、15、20代时进行病毒蚀斑克隆，并选取直径1mm的蚀斑继续传代培养。

1.3种毒的毒价测定，选取不同代次的种毒按常规方法测定TCID₅₀。

1.4病毒粒子形态观察  取HuN4株F5和F112代毒的细胞培养物，3000转离心15分钟，与PRRSV CH-1a N蛋白单抗作用1小时，12000转离心20分钟，取沉淀悬浮后，电镜负染观察。

1.5理化特性试验  取分离毒株的5、20、40、65、84、112代细胞毒悬液(10^5.0～10^8.0TCID₅₀/ml)5ml，平均分装于5支试管中，试管1于56℃水浴作用45min；试管2加20％的乙醚震荡10min后，4℃过夜，无菌挥去乙醚；试管3先用0.1MHCl调pH至3.0，于4℃作用2h后用0.1MNaOH调pH至7.2；试管4加5-碘脱氧尿核苷(5-IUDR)50μl，4℃作用12h；同时设未做任何处理的正常对照，分别测定TCID₅₀。

1.6无菌检验  取分离毒株的84、90、112代细胞毒悬液(10^7.0～10^8.0TCID₅₀/ml)按照按《中国兽药典》进行。

1.7支原体检验  取分离毒株的84、90、112代细胞毒悬液(10^7.0～10^8.0TCID₅₀/ml)按《中国兽药典》进行。

1.8外源病毒检测按《中国兽药典》进行。

2试验结果

2.1传代毒的克隆纯化  在致弱毒种的过程中进行了3次克隆纯化，每次克隆均选择1mm蚀斑。高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株低代次病毒蚀斑大小不一，而高代次病毒蚀斑大小均一(图2)，高、低代次病毒的病变形态也不同：低代次点状、聚丛，高代次均匀、整体病变(图3)。

2.2理化特性试验  测定经处理和未经处理的细胞毒悬液的TCID₅₀，结果见表5。

表5  理化特性试验结果

2.3红细胞凝集试验  经微量板法检测80、90、100、112代细胞毒悬液对0.5％的鸡、豚鼠、大鼠、兔和绵羊的红细胞均无凝集作用。

2.4种毒的培育及其滴度测定  当HuN4株在Marc-145细胞系传代时，其病毒滴度在低代次时病变速度较快，48小时即可收毒毒价在10^5.0-6.0TCID₅₀/ml左右，然后病毒毒价下降、病变速度变慢，30代以后病变速度加快，毒价也升高，70代以后病变速度和毒价保持稳定，毒价达到10^7.5-8.5TCID₅₀/ml(图4)。

2.6病毒粒子形态  高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株F5和F112代电镜负染观察发现，F5代病毒粒子以椭圆形为主，F112病毒粒子以圆形为主，直径40-100nm(图5)。

2.7无菌检验  通过对分离毒株的80、90、100、112代细胞毒悬液进行无菌检验，结果无杂菌污染。

2.8支原体检验  通过对分离毒株的80、90、100、112代细胞毒悬液进行支原体检验，结果无支原体污染。

2.9外源病毒检测  利用猪三价(HCV、PPV、BVDV)荧光抗体、猪伪狂犬荧光抗体检测，均未检测到80、90、100、112代细胞毒感染细胞有特异性荧光；采用细胞病变(CPE)方法检测，未见Vero细胞出现CPE；采用红细胞吸附法检测，未见Vero细胞出现血细胞吸附现象出现。试验证明，高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株种毒，未检测到外源病毒污染。

高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株在Marc-145细胞上经蚀斑克隆和连续传代后，其病变速度和病毒滴度有很大的提高，病毒粒子形态也有所改变，传至80代以后病毒的生物学特性保持稳定，结合病毒序列分析，我们选择高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株第110～120代细胞毒作为高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)的基础种子代次，并以此为基础研究其安全性和免疫原性。

试验例1  高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株致弱过程中不同代次病毒的分子特征

1、材料与方法

1.1毒株及细胞：

高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株(实施例1所分离)、传代细胞Marc-145由本研究室分离和保存。

1.2亲本毒HuN4株的传代致弱：

将HuN4株种毒100倍稀释后接种其传代细胞Marc-145，于37℃CO₂培养箱中培养，观察细胞病变，当病变达到80％时，收获病毒，以传代获取的病毒作为种毒继续在Marc-145细胞上传代培养，一直传至100代以上。

1.3HuN4株全长基因扩增引物设计  根据本研究室分离的高致病性PRRSV HuN4株(GenBank no.EF635006)的全长基因序列，将HuN4株的全长基因分为八个相互重叠的基因片段，设计合成了八对引物(见表6)。

表6  高致病性PRRSV亲本毒HuN4株及其不同代次毒株

       全基因RT-PCR扩增引物、位置及片段大小

利用RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)，分别提取亲本毒HuN4株及其传代毒HuN4-F20、HuN4-F40、HuN4-F65、HuN4-F84、HuN4-F100、HuN4-F112的病毒RNA，-80℃保存备用。

1.5亲本毒HuN4株及其传代毒株RT-PCR扩增及全基因克隆

以提取的HuN4株及其不同代次病毒的RNA反转录产物为模板，利用合成的8个片段引物分别对不同代次的病毒进行RT-PCR扩增，通过PCR产物胶回收试剂盒分别回收8个片段的PCR产物，克隆于pMD18-T载体上，各基因片段连接产物经PCR鉴定后，分别随机选取8-10个阳性克隆，送测序。

1.6亲本毒HuN4株及其传代毒株全基因序列分析

将8个基因片段测序结果经序列分析软件比对后进行全长基因拼接，以获得各代次病毒的全基因组序列，然后利用分子生物学软件对各个代次病毒结构蛋白和非结构蛋白基因的核苷酸和氨基酸序列进行序列比较分析。

2、试验结果

2.1亲本毒HuN4株及不同代次毒株全基因RT-PCR扩增

选取亲本毒HuN4株及其Marc-145细胞上传代致弱的不同代次的病毒HuN4-F20、HuN4-F40、HuN4-F65、HuN4-F84、HuN4-F100、HuN4-F112，提取病毒RNA，反转录后，利用8片段PCR扩增引物，对亲本毒HuN4株及选取的不同代次病毒进行RT-PCR扩增，均可以获得特异性的PCR产物，与预期大小相一致(见图1)。

2.2不同代次毒株与亲本毒的基因序列分析

利用DNAStar软件对亲本毒HuN4株及其不同代次病毒各个结构基因及其非结构基因的氨基酸进行序列比较，结果发现亲本毒HuN4经传代后不同代次的病毒在非结构蛋白区和结构蛋白区都有不同数量的氨基酸发生突变，其数量统计结果见表8和表3。

表7  亲本毒HuN4株及其不同代次毒株在不同开放阅读框中氨基酸突变的数量

表8  亲本毒HuN4及其不同代次病毒氨基酸突变数量统计

通过对高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株及其不同代次病毒全基因进行克隆测序及遗传演化分析，结果发现亲本毒HuN4株在Marc-145细胞中进行连续传代过程中，在非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区均有氨基酸的突变，但是发生突变的氨基酸比较分散，其中突变最多的主要集中在ORF1a和ORF1b复制酶基因区域，其中ORF1a基因中发生突变的氨基酸主要在NSP2蛋白，占ORF1a基因突变氨基酸的61.5％，ORF1b基因发生突变的氨基酸主要在NSP9、NSP11和NSP12蛋白。在结构蛋白区域氨基酸突变较少，ORF2基因在F65代以前仅有1个氨基酸发生突变，到了F84代以后却出现4个或5个氨基酸突变；ORF3基因在F65代以前都未发生突变，但是到了F84代以后开始出现突变；ORF4-6也都出现了1-4个氨基酸的突变。其中氨基酸稳定遗传的是ORF7编码的核衣壳蛋白，即使传至100代以上，也未发生氨基酸的突变或缺失、插入等现象。

原始种毒HuN4株与F20至F112代的传代病毒在以前报道的与毒力相关的氨基酸处，都保持了和野毒株相一致的氨基酸特性，未发生突变，暗示以前所报道和毒力相关的氨基酸与高致病性分离株致弱似乎并不相关。从不同代次病毒氨基酸变化结果来看，亲本毒HuN4株传至F20时有14个氨基酸发生突变，F40代有20个氨基酸发生突变，F65代氨基酸发生突变达到25个，突变率达到0.49％，F84代发生突变的氨基酸达到了35个，突变率达到0.68％，在整个过程中突变率达到了最高，从F85代以后氨基酸遗传性能基本趋于稳定，当亲本毒HuN4株传至F100、F112代以后，氨基酸遗传性能基本稳定，从F100代到F112代仅发生2个氨基酸的突变，其氨基酸突变率仅为0.03％。

从以上研究中可以看出，高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株在传代致弱过程中，F84代以前中间代次的各个毒株氨基酸仍然可以继续发生突变，具有遗传性能的不稳定性，F84代以后其氨基酸突变率降低，基本趋于平衡，而经过传代致弱F100代以后的毒株其生物学遗传性能更加趋于稳定，适合作为弱毒疫苗的种毒。

试验结论：

1、高致病性猪蓝耳病病毒HuN4株在连续传代过程中，整个基因组未发生缺失和插入现象，但存在氨基酸的点突变，且发生突变的氨基酸比较分散，其中突变最多的主要集中在ORF1a和ORF1b复制酶基因区域。

2、亲本毒HuN4株在细胞传代致弱过程中，F84代以前中间代次的各个毒株氨基酸仍然可以继续发生突变，具有遗传的不稳定性。F84代以后其氨基酸突变率降低，基本趋于平衡。经过传代致弱F100代以后的毒株其生物学遗传性能更加趋于稳定，适合作为弱毒疫苗的种毒。

试验例2  高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)的保护效力试验

1材料和方法：

1.1高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)为HuN4株第112代细胞毒，病毒滴度10^7.75TCID₅₀/ml。

1.2动物试验：30头40日龄PRRS病毒和抗体均为阴性，PRV、PCV2和CSFV阴性的健康仔猪，随机分成6组每组5头，1-5组，分别接种高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)接种剂量为10^2.0TCID₅₀、10^3.0TCID₅₀、10^4.0TCID₅₀、10^5.0TCID₅₀、10^6.0TCID₅₀，第6组为对照组，免疫后21天，所有试验猪每头攻击HuN4F5强毒3×10^4.0TCID₅₀，攻毒后每天测温，7、10、14、21采血，分离病毒和检测抗体。

2试验结果

2.1临床症状：免疫后各组猪均正常，无发烧、厌食等临床症状，攻毒后24小时1和6组的猪体温就达到41℃以上最高达42.2℃，41℃以上最多累计达10天，而第2组1头猪体温41℃以上累计2天，并且消瘦，试验结束时病理剖检符合临床发病标准，另外2组还有3头猪体温达到41℃以上1天，其它各组猪体温都没有超过41℃，病理剖检结果全部保护。1和6组临床表现有厌食、咳嗽、呼吸困难、腹泻和后肢麻痹等症状，大部分猪体重表现为负增长，攻毒后10天开始死亡，至试验结束时1组死亡3头，6组死亡2头，剩余猪病理剖检全部符合临床发病标准。

2.2抗体变化：免疫后10天3-5组ELISA抗体开始阳转，免疫后21天2-5组所有猪LISA抗体阳转，1和6组均为阴性。

2.3病毒分离：免疫后21天除4和5组各有一头猪可以分离到疫苗毒外，其余各组均为阴性。攻毒后7天3、4、5组全部产生中和抗体并分离不到病毒，而1和6组剩余猪到攻毒后14天仍能分离到病毒。

表9高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)不同接种剂量对仔猪免疫保护试验的结果

	第1组	第2组	第3组	第4组	第5组	第6组
							发病率	100％	20％	0％	0％	0％	100％
死亡率	60％	0％	0％	0％	0％	40％
							保护率	0％	80％	100％	100％	100％	0％

试验结果表明，高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)对仔猪的最小免疫剂量是10^3.0TCID₅₀。

试验例3高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)对仔猪的安全性试验

1、材料与方法

1.1试验用疫苗：高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)为HuN4株第112代细胞毒(实施例2所分离)，病毒滴度10^7.75TCID₅₀/ml。

1.2实验动物：选取14头40日龄左右PRRS病毒和抗体均为阴性的健康仔猪。PRRS病毒检测方式为RT-PCR，分别使用针对ORF5和ORF7基因的2对引物进行检测。抗体检测采用IDEXX公司生产的PRRSV ELISA试剂盒。14头仔猪随机分成3组，第一组6头为安全性试验组，第二组4头为空白对照。空白对照组与安全性试验组分圈饲养，自由采食。第三组4头不接种，与安全试验组饲养于同一圈中，作为同居感染组。

1.3动物试验：安全性试验组免疫剂量为2×10^7.0TCID₅₀/头，接种方式为颈部肌肉注射。临床监测方式与指标：接种疫苗后观察疫苗注射部位有无红肿、溃烂等炎症反应，并每日观察猪只的临床表现，如采食量、精神状态、生长状况、耳部眼睑以及体表有无异常。于每日清晨饲喂后进行一次直肠测温，直至剖杀。

1.4组织病理变化：于接种后第7、14和21天各剖杀疫苗组2头和对照组1头，取剖杀动物的心、肝、肺、肾、脑、胃、肠、脾、扁桃体、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结做病理组织学检查。

2.试验结果

2.1试验猪的临床表现

试验猪接种高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)后采食量以及精神状态正常，与空白对照组无明显差别。接种部位无炎症反应。耳部及体表无淤血或溃疡斑、眼睑无肿胀，眼分泌物无明显增多。空白对照组无临床症状、无体温升高。试验猪无发热，仅在接种后第2天、第3天有一过性的体温升高，最高时达到40.3℃(体温超过41℃即为发热)，第4天全部回落，直至剖杀体温始终在40.3℃以下。

2.2组织病理变化

试验猪分别于接种后第7、14、21天各剖杀2头，解剖学检查结果显示高剂量高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)接种后仔猪的各实质脏器与淋巴结均没有肉眼可见的病变。进一步的组织病理学检查显示各种实质脏器(心、肝、脾、肺、肾、小肠、大脑、胃)均没有明显的病理损伤，对淋巴系统(腹股沟淋巴结、颌下淋巴结以及肠系膜淋巴结)也没有发现明显的病理损伤，仅在腹股沟淋巴结有少量的嗜酸性粒细胞浸润，而肠系膜、颌下淋巴结无病理损伤。

2.3同居感染组病毒含量与抗体的检测

4头健康仔猪与肌注高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)10^7.0TCID₅₀组混养，采集3、5、7、10、14、21天的血清，经Real-Time PCR方法检测血清中的病毒，结果未发现有病毒。同时利用IDEXX ELISA试剂盒也未检测到抗体。

另外，本发明在其它试验中，累计以10^5.0TCID₅₀接种7日龄仔猪10头，断奶仔猪75头，所有被接种动物在一个月内的观察期内无体温升高、无咳嗽和厌食等临床症状，接种部位无炎症反应，以上结果表明本发明高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)对各年龄段的猪都是安全的。

试验结果表明，高剂量接种高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)后对仔猪的各种脏器均没有明显的损伤；同居感染结果显示高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112)水平传播能力极低。

                    序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株、其弱毒疫苗株及其应用

<130>KLPI0789

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15352

<212>RNA

<213>Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HuN4 strain

<400>1

augacguaua gguguuggcu cuaugccacg gcauuuguau ugucaggagc ugugaccauu    60

ggcacagccc aaaacuugcu gcacgggaac acccuccugu gacagcccuc uucaggggga    120

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<210>2

<211>15323

<212>RNA

<213>Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HuN4-F112 strain

<400>2

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cgugaggcuu gugaugcguc caagcuuggu gauccugcua cgcaggagug gcucucucgc    3300

augugggaua ggguugacau gcugacuugg cgcaacacgu cugcuuacca ggcguuucgc    3360

aucuuaagug gcagguuuga guuucuccca aagaugauuc ucgagacacc gccgccccac    3420

ccgugcgggu uugugauguu accucgcacg ccugcaccuu ccgugagugc agagagugac    3480

cucaccauug guucaguggc caccgaggau guuccacgca uccucgggaa aauaggagac    3540

acugacgagc ugcuugaccg gggucccucg gcacccucca agggagaacc ggucagugac    3600

caaccugcca aagauccccg gaugucgccg cgggagucug acgagagcau gauagcuccg    3660

cccgcagaua cagguggugu cggcucauuc acugauuugc cgucuucaga ugguguggau    3720

guggacgggg gggggccguu aagaacggua aaaacaaaag cggggaggcu cuuagaccaa    3780

cugagcugcc agguuuuuag ccucguuucc caucucccua uuuucuucuc acaccucuuc    3840

aaaucugaca gugguuauuc uccgggugau ugggguuuug cagcuuuuac ucuauuuugc    3900

cucuuucuau guuacaguua cccauucuuc gguuuugcuc cccucuuggg uguauuuucu    3960

gggucuucuc ggcgugugcg aauggggguu uuuggcugcu gguuggcuuu ugcuguuggu    4020

cuguucaagc cuguguccga cccagucggc acugcuugug aguuugacuc gccagagugu    4080

aggaacguac uucauucuuu ugagcuucuc aaaccuuggg acccuguccg cagccuuguu    4140

gugggccccg ucggucucgg ccuugccauu cuuggcaggu uacugggcgg ggcacgcuau    4200

aucuggcacu uuuugcuuag gcuuggcauu guuacagacu guaucuuggc uggagcuuau    4260

gugcuuucuc aagguaggug uaaaaagugc uggggaucuu guguaagaac ugcuccuaau    4320

gagaucgccu ucaacguguu cccuuuuaca cgugcgacca ggucgucacu caucgaccug    4380

ugcgaucggu uuugcgcacc aaaaggcaug gaccccauuu uucucgccac uggguggcgu    4440

gggugcugga ccggccggag ucccauugag caaccuucug aaaaacccau cgcguucgcc    4500

cagcuggaug agaagaggau uacggcuaga acuguggucg cucagccuua ugaucccaac    4560

caggccguaa agugcuugcg gguauuacag gcgggugggg cgaugguggc cgaggcaguc    4620

ccaaaagugg ucaaaguuuc cgcuauucca uuccgagcuc cuuucuuucc cgcuggagug    4680

aaaguugauc cugagugcag aaucgugguu gaucccgaua cuuuuacuac agcccuccgg    4740

ucuggcuauu ccaccgcgaa ccucguccuu gguacggggg acuuugccca gcugaaugga    4800

cuaaagauca ggcaaauuuc caagccuuca gggggaggcc cacaccucau ugcugccuug    4860

cauguugccu gcucgauggc guuacacaug cuugcuggug uuuauguaac ugcagugggg    4920

uccugcggua ccggcaccaa cgauccgugg ugcacuaacc cguuugccgu cccuggcuac    4980

ggaccuggcu cucuuugcac gucuagauug ugcaucuccc aacacggccu caccuugccc    5040

uugacagcac uuguggcggg auucggccuu caagagauug ccuuggucgu uuugauuuuu    5100

gucuccaucg gaggcauggu ucauagguug aguuguaagg cugacauguu gugcaucuua    5160

cucgcaaucg cuaguuaugu uuggguaccu cuuaccuggu ugcuuugugu guuuccuugu    5220

ugguugcgcu gguucucuuu gcacccccuc accauccugu gguugguguu uuucuugauu    5280

ucuguaaaua uacccucggg aaucuuggcc gugguguuau ugguuucucu cuggcuuuua    5340

ggucguuaua cuaacauugc uggucucguc acccccuaug acauucauca uuacaccagu    5400

gguccccgcg gugucgccgc cuuggccacc gcaccagaug gaaccuacuu ggcugccguc    5460

cgccgugcug cgcugacugg ucguaccaug cuguucaccc cgucucagcu cgggucccuc    5520

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cauguccuua cggguaacuc agcuaggguu ucuggggucg gcuucaauca aaugcuugac    5700

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cugagcgagu ugagugaauu cuucgcugga ccuaaggucc cgcucgguga ugugaaaauu    6060

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gucaaacccg aacuggaagg aggccuuucc acaguucaac uucugugugu guuuuuccuc    6180

cuguggcgaa ugauggggca ugccuggacg cccuugguug cugugggguu uuucauccug    6240

aaugagauuc ucccagcugu ccugguccgg aguguuuucu ccuuugggau guuugugcua    6300

ucuuggcuca caccaugguc ugcacaaguc cugaugauca ggcuucugac agcagcccuu    6360

aacagaaaca gauggucucu ugguuuuuac agccuuggug caguaaccag uuuugucgca    6420

gaucuugcgg uaacucaagg gcauccguua caggugguaa ugaacuuaag caccuaugcc    6480

uuccugcccc ggaugauggu ugugaccucg ccagucccag ugaucgcgug ugguguugug    6540

caccuccuug ccauaauuuu guacuuguuu aaguaccgcu gccuucacaa uguccuuguu    6600

ggcgaugggg uguucucuuc ggcuuucuuc uugcgauacu uugccgaggg aaaguugagg    6660

gaaggggugu cgcaauccug cgggaugagu caugagucgc ugacuggugc ccucgccaug    6720

agacucacug acgaggacuu ggauuuccuu acgaaaugga cugauuuuaa gugcuuuguu    6780

ucugcgucca acaugaggaa ugcagcgggc caauuuaucg aggcugcuua ugcaaaagca    6840

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cucgaggcuu uugccgauac cguggcaccc caacucucgc ccggugacau uguuguugcc    6960

cuuggccaca cgccuguugg cagcaucuuc gaccuaaagg uugguagcac caagcauacu    7020

cuccaagcca uugagacuag aguccuugcc ggguccaaaa ugacuguggc gcgugucguu    7080

gacccaaccc ccgcaccccc acccguaccu gugcccaucc cucucccacc gaaaguucug    7140

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auggaagccg ucggcauuuu ugucauggac gggaaaaagu accagaaauu uugggacaag    7260

aauuccggug auguguuuua ugaggagguc cauauuagca cagacgagug ggagugccuu    7320

agaacuggcg acccugucga cuuugauccu gagacaggga uucagugugg gcauaucacc    7380

auugaagaua agguuuacaa ugucuucacc uccccaucug gcaggagauu cuuggucccc    7440

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cuugguauga ugaacgucga cggcgaacug acugccaaag aacuggagaa acugaaaaga    7560

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aauuucacaa ccggaccuuc acccuaggac cugugaacuu aaaaguggcc agugagguug    7740

agcuaaaaga cgcgguugag cacaaccaac auccgguugc cagaccgguu gaugguggug    7800

uugugcuccu gcgcucugca guuccuucgc uuauagaugu cuugaucucc ggcgcugaug    7860

caucuccuaa guuacucgcc cgccacgggc cgggaaacac ugggauugau ggcacgcuuu    7920

gggauuuuga ggccgaggcu acuaaagagg aaguugcacu cagugugcaa auaauacagg    7980

cuugugauau uaggcgcggc gacgcgccug aaauuggucu cccuuauaag uuguacccug    8040

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cuuacaaaac cccuagugac acuggaagcc cggugcacgc ggcugccugc cucacgccua    8160

augcuacucc ggugacugau gggcgcuccg ucuuggcuac aaccaugccc ucuggcuuug    8220

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gcccuaaaca guuaacagag cacgguugug aggaugcugc auuaagagac cucuccaagu    8340

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uuauugcguu ggcccaucgg gcagcguuga gugguguuac ccagggcuuc augaaaaaag    8700

cguucaacuc gcccaucgcc cucgggaaaa acaaauuuaa ggagcuacaa gccccggucc    8760

uaggcaggug ccuugaagcu gaucuugcgu ccugcgaucg auccacaccu gcaauugucc    8820

gcugguuugc cgccaaucuu cuuuaugaac ucgccugugc ugaggagcau cuaccgucgu    8880

acgugcugaa cugcugccac gacuuacugg ucacgcaguc cggcgcggug acuaagagag    8940

guggccuguc gucuggcgac ccgauuaccu cugugucaaa caccauuuac agcuuaguga    9000

uauaugcaca gcacauggug cucaguuacu ucaaaagugg ucacccucau ggccuucugu    9060

uucugcaaga ccagcuaaag uuugaggaca ugcucaaggu ucaaccccug cucgucuauu    9120

cggacgaccu uguguuguau gccgagucuc ccuccaugcc aaacuaccac ugguggguug    9180

aacaucugaa ucuuaugcug gguuuccaga cggacccaaa gaagacaacc aucacagacu    9240

caccaucauu ccuagguugc aggauaauaa augggcgcca gcuagucccu aaccgugaca    9300

ggauccucgc ggcccuugcc uaccauauga aggcaaguaa uguuucugaa uacuacgccu    9360

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caccguucuu cuuguccaug ugggaaaaac ucagguccaa ucaugagggg aagaagucca    9540

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ggcguggcau caggggaaau gaagucgacc uaccagacgg ugauuacgcu aguaccgccu    9900

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gguuuaucau cggcccaccc ggugcuggga aaacacacug gcuucuucaa caaguccagg    10020

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ggguuucgag ccccgggaaa gccgcgaaag caguuugcac auugacggau guguaccucc    11400

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agaaccaugc ggccguaauu aaa                                            15323

Claims (6)

1、一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus)强毒株HuN4，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2、由权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株HuN4传代致弱所得到的弱毒疫苗株HuN4-F112，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

3、按照权利要求2所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC NO.2484。

4、一种治疗或预防高致病性猪蓝耳病的疫苗组合物，其特征在于：由权利要求2或3所述的弱毒疫苗株HuN4-F112和药学上可接受的佐剂组成。

5、权利要求2或3所述的弱毒疫苗株HuN4-F112在制备预防或治疗高致病性猪蓝耳病药物中的用途。

6、权利要求2或3所述的弱毒疫苗株HuN4-F112在制备诊断或检测高致病性猪蓝耳病药物中的用途。

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