CN108707587A - 一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用 - Google Patents

一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明“一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用”，属于微生物技术领域。所述欧洲型PRRSV HLJB1‑M毒株的保藏号为CGMCC No.12989。基于所述毒株，本发明还提供一种用于预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒所致疾病的疫苗组合物；一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株和/或诊断猪繁殖与呼吸综合征的试剂；以及一种用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒亚型的试剂盒。所述欧洲型PRRSV HLJB1‑M毒株具有一定强度的毒性和致病性，攻毒后使动物表现出典型的欧洲型PRRS症状，可诱导机体产生良好的免疫反应，获得高水平的抗体。

Description

一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)俗称“猪蓝耳病”，是困扰全球生猪养殖业的重要疾病之一，主要引起仔猪和育成猪呼吸道疾病以及母猪的繁殖障碍。该病的原发性病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus,RRSV)，与马动脉炎病毒(Equinearteritis virus,EAV)、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(Lactate dehydrogenase-elevatingvirus,LDV)和猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)同属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属(Arterivirus)(Dea,et al.,2000；Snijder,et al.,1998)。
该病1987年首次在美国发生，1991年分离到病原(Wensvoort,et al.,1991；Collins,et al.,1992)，此后在全球蔓延的速度非常快，给全球养猪业造成了极其严重的经济损失。1996年我国首次分离到PRRSV(郭宝清等，1996)，此后流行呈上升趋势。2006年高致病性PRRSV快速席卷我国大部分生猪养殖地区，给我国养猪业带来深重灾难。目前，PRRS呈世界性分布，是危害全球养猪业的主要疫病之一。
PRRS病毒分为北美型(North American type)和欧洲型(European type)两个亚型(Allende,et al.,1999；Meng,2000；Meulenberg,et al.,1993)。当前，PRRSV已传遍了世界主要养猪国家，我国流行的PRRSV毒株几乎都为北美型(郭宝清等，1996；杨汉春等，2001；Jiang,et al.,2000)。2006年5月，在我国江西省暴发了“猪高热病”，主要表现为高热、高发病率和高死亡率。该病自首次暴发后便在我国主要养猪省份迅速传播，导致超过100万头猪死亡，给我国养猪业造成了极大的经济损失。经研究证实，引起此次疫病的主要病原是变异的北美型PRRSV，称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)(Tian,et al.,2007；Tong,et al.,2007；Li,et al.,2007)，由其引起的疾病被称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome)。对PRRSV的分子流行病学调查表明，从1996年我国发现PRRS以来，流行毒株主要是北美型PRRSV，而欧洲型PRRSV则非常少见。
因此，本领域亟需分离出新的欧洲型PRRSV毒株用于研制对抗PRRS的新疫苗。
发明内容
基于上述需求，本发明从临床样品经过细胞培养，分离得到一株欧洲型PRRSV毒株，命名为PRRSV HLJB1-M毒株。本发明涉及一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)。从临床组织病料用细胞培养方法分离到一株PRRSV；该分离株属于欧洲型毒株；该毒株可以此研究为基础开发相应的RT-PCR检测/诊断方法(试剂)，也可研制用于本病临床预防用疫苗等生物制品。
本发明的技术方案如下：
本发明一方面提供一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M，其保藏号为CGMCC No.12989。
所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗方面的应用。
所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断试剂方面的应用。
所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M在制备用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒亚型的试剂盒方面的用途。
所述的用途包括，根据权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSVHLJB1-M的特异性序列片段设计特异性引物。
所述特异性序列片段由所述PRRSV HLJB1-M毒株经测序得到的PRRSV HLJB1-M基因组序列与其它已知亚型的PRRSV毒株的基因组序列比对得到。
本发明的另一方面提供一种用于预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒所致疾病的疫苗组合物，其特征在于，包括减毒的、和/或弱毒的、和/或灭活的权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M。
所述疫苗组合物还包括可与所述欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSVHLJB1-M混合的药用载体，和/或，药学上可接受的佐剂。
本发明的第三个方面还提供一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株和/或诊断猪繁殖与呼吸综合征的试剂，其特征在于，包括以权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M为免疫原获得的抗体。
所述试剂还包括检测诊断领域的常规抗体，和/或，检测诊断领域的其它常规试剂。
本发明分离到一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome virus,PRRSV)毒株PRRSV HLJB1-M，其保藏号为CGMCC No.12989。本发明通过分子生物学分析、基因组序列比对，发现PRRSV HLJB1-M与Amervac PRRS、SHE、Esp-1991-Olot91等欧洲型毒株的核苷酸序列同源性最高，说明PRRSV HLJB1-M是一株欧洲型PRRSV毒株；同时将PRRSV HLJB1-M与现有已知的欧洲型毒株进行了ORF1a、ORF1b和ORF3编码的氨基酸序列比对，发现本发明的PRRSV HLJB1-M在ORF1a编码氨基酸残基417位后存在5个氨基酸残基的插入，在ORF3的羧基末端265位后有4个氨基酸残基的插入，这一结果证实了本发明的PRRSV HLJB1-M毒株是一株不同于现有已知毒株的全新毒株。
另外，本发明还通过动物致病性试验，发现注射了PRRSV HLJB1-M毒株的仔猪在体温、临床症状、脏器、组织切片方面都表现出与阴性对照仔猪明显不同的病理变化，同时在注射了PRRSV HLJB1-M毒株的仔猪体内可检测到阳性抗体以及病毒抗原，这些结果充分表明，本发明提供的PRRSV HLJB1-M毒株具有一定强度的毒性和致病性，攻毒后使动物表现出典型的欧洲型PRRS症状，但毒性不致死，可诱导机体产生良好的免疫反应，获得高水平的抗体，是一株良好的可用于开发PRRSV疫苗的毒株。
综上所述，与其他经典的欧洲1型PRRSV分离株一样，中国新的1型PRRSV HLJB1-M毒株也诱导了轻度的仔猪实验性感染发热、呼吸困难等临床表现。肺、淋巴结和脾脏临床表现及病理改变均与以往报告的欧洲1型PRRSV相似，表现出了典型的欧洲型PRRS临床症状，建立了欧洲型PRRS的动物感染模型。此外，PRRSV HLJB1-M毒株引起的病毒血症的猪只持续时间长，作为较高的和长期的病毒血症是一个突出的特点。该毒株攻毒后仔猪接种PRRSVHLJB1-M毒株后，能诱导感染猪产生良好的免疫应答，产生了高水平的抗体，提示1型PRRSVHLJB 1作为候选疫苗的潜力。分离株经细胞传代进一步弱化毒力后，可用于研制欧洲型PRRS疫苗。
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M已送保藏，其保藏信息如下：
菌种保藏名称：PRRSV HLJB1-M
保藏号：CGMCC No.12989
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年9月21日
附图说明
图1.仔猪攻毒后的体温变化曲线图。
图2.本发明所述的HLJB1-M毒株攻毒猪的显微病理变化；其中：
A：肺脏20×，肺泡壁增生，巨噬细胞活化增生，炎性细胞浸润；有出血灶，间质中混有大量的红细胞；
B：脾脏40×，局部区域淋巴细胞流失，可见大量红细胞；
C：淋巴结40×，淋巴细胞流失，皮质内淋巴小结坏死，大量红细胞和炎性细胞浸润；
D：肾脏40×，肾小管上皮细胞变性坏死，间质细胞活化增生，间质中大量红细胞浸润；
E：心肌40×，心肌水肿、变性，横纹消失，单核细胞活化增生吞噬坏死的心肌纤维，纤维之间有红细胞浸润；
F：肝脏40×，肝细胞变性坏死，窦状隙炎性细胞和红细胞浸润。
G：脑10×，脑充血，出血。
图3.攻毒后猪血清抗体消长曲线图。
图4.攻毒后猪血清抗体长期变化曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
生物材料的来源及记载出处
实施例1中毒株分离来源病料采集自北京某养猪场的发病猪；肺泡巨噬细胞(PAM)由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司制备和保存。
实施例3使用的健康仔猪来自北京清泉湾养猪有限公司。
本文中的“病理组织切片”、“S/P值”、“弱毒”、“减毒”、“灭活”、“PRRSV”、“猪繁殖与呼吸综合征病毒”、“分离株”、“细胞传代”、“毒株”、“病毒株”、“攻毒”、“DMEM”等术语、缩略语都具备本领域常规的技术含义。
本文中的“欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株”、“猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株”、“欧洲型PRRSV毒株”、“PRRSV欧洲株”均具有本领域技术人员可常规理解的一致的技术含义。
实施例1、本发明PRRSV HLJB1-M毒株的分离获得
1材料和方法
1.1材料
1.1.1病料采集自北京某养猪场的发病猪。
1.1.2肺泡巨噬细胞(PAM)，北京世纪元亨动物防疫技术有限公司制备和保存，按常规方法培养。
1.2分离方法
1.2.1病毒的分离取发病猪血清并稀释后，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-70℃保存备用。
1.2.2病毒的培养过滤后的发病猪血清以5％含量接入接种猪肺泡巨噬细胞，37℃吸附1h，加入含2％犊牛血清的DMEM维持液，37℃静止培养，同时设正常细胞对照。每天观察有无致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)，若无CPE，则于培养5d收获病毒，反复冻融3次，连续盲传至5代仍无病变视为阴性。出现细胞病变达80％时收获病毒液，经-20℃冻融2次后置-70℃保存备用。
1.2.3连续传代培养，病毒培养液的2％含量接入的接种用猪肺泡巨噬细胞细胞，37℃吸附1h，加入含2％犊牛血清的DMEM维持液，37℃静止培养5d。第二代培养72h，观察病变。
2结果与结论
病料接种猪肺泡巨噬细胞后出现明显细胞病变(CPE)，感染病毒的细胞表现为细胞折光度度变低，继而开始脱落，崩解。对分离的病毒进一步传代，扩繁，置-70℃保存，用以鉴定分离病毒的种类。将本实施例分离得到的病毒株命名为PRRSV HLJB1-M，并将其送保藏，其保藏信息如下：
菌种保藏名称：PRRSV HLJB1-M
保藏号：CGMCC No.12989
分类命名：动脉炎病毒
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年9月21日
实施例2、PRRSV病毒的全基因组序列测定与分析
一、PRRSV病毒株HLJB1-M的全基因组序列测定
根据PRRSV欧洲型毒株的全基因组序列，用Primer Premier 5软件设计设计覆盖全基因组序列的引物。按照病毒RNA提取试剂盒的说明书，以每个片段的下游引物为反转录引物，合成cDNA第一链。PCR扩增按照Ex-TaqDNA聚合酶的说明书进行，退火温度和延伸时间以每对引物的Tm值及扩增片段的长度做出相应的调整。扩增的片段与克隆载体PMD19-T连接，将经菌液PCR鉴定为阳性的样品送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。
测序结果经过DNAMAN软件拼接后，获得该欧洲型毒株的全基因组序列。
二、PRRSV病毒HLJB1-M毒株的基因组序列分析
新分离欧洲株HLJB1-M的基因组全长15 116bp(不含3′末端的poly A)，包含有7个主要开放性阅读框，即ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7，其中ORF1a、ORF1b主要编码病毒的非结构蛋白，ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7编码病毒的结构蛋白。对HLJB1-M株的基因组核苷酸序列分析显示，其与Amervac PRRS(GenBank accessionNo.GU067771)、SHE(GenBank accession No.GQ461593)、Esp-1991-Olot91(GenBankaccession No.KC862570)核苷酸序列同源性最高，均为92％。
编码蛋白的氨基酸序列分析比对表明，HLJB1-M的ORF1a与Amervac PRRS和Esp-1991-Olot91的同源性最高为91％；其ORF1b与SHE、Esp-1991-Olot91同源性最高为95％；ORF2与NVDC-NM1-2011(GenBank accession No.AGH12417)、BJEU06-1(GenBank accessionNo.ACY56790)的同源性最高均为94％；ORF3与株L2(GenBank accession No.AA802090)的同源性最高为91％，与SD-02-10(AAR33011)的同源性为90％；ORF4与株SO-36a(AEM00504)的同源性最高为93％，与株SHE的同源性为92％；ORF5、ORF6和ORF7在欧洲株之间相对保守，同源性在95-98％。
与已知的其它欧洲株比较发现，HLJB1-M在ORF1a、ORF1b和ORF3编码的氨基酸序列上有其独有的特征，其在ORF1a编码氨基酸残基417位后存在5个氨基酸残基的插入，在ORF3的羧基末端265位后有4个氨基酸残基的插入。
综上，HLJB1-M是一株显著不同于现有已知毒株的新欧洲型毒株。
实施例3、PRRSV HLJB1-M毒株的动物致病性试验
一、PRRSV HLJB1-M毒株的动物致病性试验
试验选用PRRSV抗体阴性的健康仔猪，随机分为2组，攻毒组颈后肌肉注射PRRS-E病毒液，对照组在相同部位注射1ml 2％MDEM培养液作为对照，观察攻毒后临床症状、病理及生理变化等，留取病变组织，收集动物血清，并详细记录实验结果。具体试验结果如下：
1体温反应
根据体温测量结果绘制试验组和对照组体温平均值变化曲线图1。接种病毒后攻毒组的7头仔猪有六头仔猪的体温第1天都有所升高，且高于40℃，其中有4头仔猪体温升高高于40℃的持续时间超过3天以上。另外三头仔猪体温高于40℃的持续时间不到3天，但体温高于40℃的累积时间均超过3天。对照组平均体温无升高现象。总体结果可以看出，本试验室分离的这株病毒能够引起接种猪体温升高，且体温升高达到40℃以上。
2攻毒后临床症状观察
攻毒后猪的临床症状不是特别明显，主要表现为：一过性耳朵和皮肤发绀，持续时间达2～3天，之后耳朵发绀恢复至正常和轻微的呼吸道症状。对照组无临床症状。
3攻毒后大体解剖结果
肉眼观察大体解剖病变主要表现为：肺脏病变，肺脏病变主要为间质性肺炎，为实变病灶；淋巴结病变，淋巴结主要变化为肿大和充血，有些淋巴结肿大倍数明显，达3～5倍；脾脏病变，脾脏主要变化为肿大和梗死，且肿大多为脾头部肿大；其他脏器的变化不明显。对照组猪大体解剖无明显病变。
4病理组织切片结果
对照组猪组织基本正常，攻毒组猪主要的组织显微病理变化见图2。
肺脏：肺泡壁增生，肺间质增宽，结缔组织水肿，巨噬细胞活化增生，炎性细胞浸润，严重者有出血，间质中混有大量的红细胞。
脾：局部区域淋巴细胞流失，巨噬细胞和网状细胞活化增生，在白髓和红髓均可见大量红细胞浸润。
淋巴结：淋巴细胞流失，淋巴结出血，皮质区组织间大量红细胞浸润。
肾脏：肾小管上皮细胞变性坏死，间质细胞活化增生，间质中大量红细胞浸润。
心脏：心肌水肿，变性，严重者心肌横纹消失，单核细胞活化增生吞噬坏死的心肌纤维，纤维之间有红细胞浸润。
肝：肝细胞弥漫性变性坏死，肝脏小叶间质细胞增生，红细胞浸润。
脑：部分攻毒猪出现软化灶，坏死灶，嗜神经现象。神经细胞变性坏死，坏死灶。脑充血，出血。
5抗体检测
本次动物试验抗体水平检测采用IDEXX蓝耳试剂盒进行。
IDEXX蓝耳抗体试剂盒检测结果及感染后抗体消长规律分析：见图3和图4，攻毒后14天全部抗体检测结果为阳性。检测150天内的抗体水平，其中有两头猪6号和9号的抗体水平在攻毒后60天达到峰值，之后下降。2号在攻毒后75天达到峰值，之后开始下降。抗体阳性结果可以一直持续到免疫后150天。
6血清病毒血症检测
分析不同阶段采集的血清病毒血症结果表明：最早在攻毒后7天就可以检测到血液中有病毒抗原，因为没有进行攻毒后逐日采血，因此该结果只是证明攻毒后7天可以检测到抗原，病毒血症持续到攻毒后21天，到攻毒后30天病毒血症消失，抗原检测结果转阴，分析该结果是由于猪体内抗体水平逐渐上升使得体内的病毒血症消失。病毒血症的检测结果在一定程度上指示该病毒在体内存在的时间。
实施例4、本发明所述的疫苗组合物
本实施例提供一种用于预防和/或治疗PRRSV所致疾病的疫苗组合物，其包括减毒的、和/或弱毒的、和/或灭活的实施例1-3任一所述的PRRSV HLJB1-M毒株。
本实施例所提供的疫苗组合物还包括可与所述PRRSV HLJB1-M毒株混合的药用载体，和/或，药学上可接受的佐剂。
所述药用载体是指对实验动物基本无毒并且对疫苗组合物中包含的PRRSVHLJB1-M毒株活性基本无影响的载体，其可以为固体、液体或凝胶形式，并通常为无菌的。
合适的水性和非水性载体包括水；乙醇；多元醇如丙二醇、聚乙二醇、甘油等，以及它们的合适混合物；植物油如橄榄油；上述载体可随着疫苗剂型的不同而变化，例如，注射剂所使用的载体可以是：可注射有机酯如油酸乙酯。为保持合适的流动性，可使用包衣如卵磷脂等载体；还可以使用表面活性剂如十二烷基硫酸钠。所述载体还包括稳定剂，如蔗糖、EDTA、EGTA和抗氧化剂。还包括本领域常用的缓冲剂、粘合剂、崩解剂、保湿剂、填充剂、保湿剂、吸收加速剂、；润湿剂、吸附剂、润滑剂、防腐剂、稳定剂等等。
所述佐剂为本领域技术人员所熟知的，例如弗氏佐剂、氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、皂角甙、葡聚糖如DEAE-葡聚糖，植物油(如花生油、橄榄油和/或维生素E醋酸酯)、矿物油、细菌脂多糖、肽聚糖和蛋白聚糖等。
实施例5、本发明所述的检测诊断试剂
一种用于检测PRRSV欧洲株和/或诊断PRRS的试剂，其特征在于，包括以实施例1-3任一所述的PRRSV HLJB1-M毒株为免疫原获得的抗体。
本实施例提供的检测诊断试剂可具体为一种检测试纸，试纸上设置有检测线和对照线；检测线上包被有上述以PRRSV HLJB1-M毒株为免疫原获得的抗体；而对照线上包被有检测诊断领域的常规抗体，如，羊抗鼠IgG抗体。同时，所述检测试纸还包括，在包被、制备时用到的检测诊断领域的其它常规试剂，例如，BSA、CBS或PBS缓冲液等。

Claims (10)

1.一株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M，其保藏号为CGMCCNo.12989。
2.权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗方面的应用。
3.权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断试剂方面的应用。
4.权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M在制备用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒亚型的试剂盒方面的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，包括，根据权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M的特异性序列片段设计特异性引物。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述特异性序列片段由所述PRRSVHLJB1-M毒株经测序得到的PRRSV HLJB1-M基因组序列与其它已知亚型的PRRSV毒株的基因组序列比对得到。
7.一种用于预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒所致疾病的疫苗组合物，其特征在于，包括减毒的、和/或弱毒的、和/或灭活的权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M。
8.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，还包括可与所述欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M混合的药用载体，和/或，药学上可接受的佐剂。
9.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株和/或诊断猪繁殖与呼吸综合征的试剂，其特征在于，包括以权利要求1所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒株PRRSV HLJB1-M为免疫原获得的抗体。
10.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，还包括检测诊断领域的常规抗体，和/或，检测诊断领域的其它常规试剂。
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