CN105477011B - 卡拉胶Carrageenan在防治猪蓝耳病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了卡拉胶（Carrageenan，CG）在制备抗PRRSV病毒的药物中的应用，以及卡拉胶CG在制备防治猪蓝耳病的药物中的应用。本发明首次公开了卡拉胶CG对PRRSV病毒的抗病毒作用，尤其是对HP‑PRRSV有很好的抗病毒效果，有望成为一种新型的防治猪蓝耳病的药物，对猪蓝耳病的治疗提供了一种新的药物和药物基础。而且，CG对细胞及机体几乎无毒性，故在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。另外，本发明通过多种方法验证研究了CG对HP‑PRRSV的抗病毒作用，而且阐述了其在病毒吸附和进入细胞两个过程中的抗病毒机制，为CG在抗PRRSV病毒以及治疗猪蓝耳病方面的应用奠定了坚实的基础。

Description

卡拉胶Carrageenan在防治猪蓝耳病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及卡拉胶Carrageenan在防治猪蓝耳病中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse，PRRSV）引起。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以Lelystad Virus (LV) 毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse，HP-PRRSV）。PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔以及各年龄段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。PRRSV属于尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5′和3′非编码区，中间为10个开放阅读框（open readingframe，ORF），其中ORF2-7分别翻译病毒糖蛋白（glycoprotein，GP）GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。
PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：（1）嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞（Porcinealveolar macrophages，PAMs），PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；（2）抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；（3）疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；（4）抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；（5）病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；（6）混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染使PRRSV防控难上加难。
目前PRRSV防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点：（1）需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；（2）不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；（3）产生完全免疫力需要2-3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；（4）存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组、潜在感染的危险及无交叉保护力。因此，研制新型抗PRRSV药物迫在眉睫。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有猪蓝耳病防治技术和药物的缺陷和不足，提供一种能够防治猪蓝耳病的物质——卡拉胶（Carrageenan，CG）。所述卡拉胶CG对PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是针对高致病型毒株HP-PRRSV具有显著的抗病毒作用，且其已广泛运用于食品添加剂中，对细胞及机体几乎无毒性，故在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
本发明的目的是提供卡拉胶（Carrageenan，CG）在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，尤其是抗HP-PRRSV药物中的应用。
本发明另一目的是提供上述卡拉胶CG在制备防治猪蓝耳病的药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明公开了卡拉胶CG在制备抗PRRSV病毒的药物中的应用。
优选地，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。
本发明还公开了卡拉胶CG在制备防治猪蓝耳病的药物中的应用。
优选地，所述猪蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的猪蓝耳病。
另外，优选地，所述卡拉胶CG的使用剂量范围为10～30 μg/ml。
更优选地，所述卡拉胶CG的使用剂量范围为10～20 μg/ml。
另外，包括有效量的卡拉胶CG的抗PRRSV病毒药物，也应在本发明的保护范围之内。优选地，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。
优选地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。
优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂。
优选地，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。
卡拉胶（Carrageenan，CG）是从海洋红藻中提取出来的，现有技术中有报道其对多种病毒具有抗病毒作用。但是，CG对不同病毒的抑制作用存在差异，这种差异与病毒的血清型及宿主细胞本身有关，而且关于卡拉胶抗病毒作用机制的研究还十分欠缺，限制了卡拉胶在抗病毒方面的应用。现有技术中，尚未见有关于CG是否具有抗PRRSV病毒作用的研究和报道。
本发明首次研究发现了卡拉胶对PRRSV病毒的抗病毒作用，尤其是对HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，对猪蓝耳病的治疗提供了一种新的药物和药物基础。
同时，本发明还系统研究了CG对PRRSV的抗病毒机制。首先在Marc-145细胞水平上通过qRT-PCR、Western-Blot、细胞上清TCID50检测及免疫荧光（IFA）等多种方法研究证实了CG在Marc-145细胞和PAMs细胞水平对HP-PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，并阐述CG在病毒吸附和进入细胞两个过程中的抗病毒机制；接着在PRRSV自然宿主细胞PAMs上研究其对HP-PRRSV抗病毒作用，最后通过分析CG在Marc-145和PAMs上对细胞因子表达影响，初步阐明其是否通过抑制NF-κB通路来抗PRRSV。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次研究发现了卡拉胶（Carrageenan，CG）的抗PRRSV病毒作用，尤其是对HP-PRRSV有很好的抗病毒效果。本发明通过TCID50、qRT-PCR、IFA及Western-Blot等多种方法研究证实了CG在Marc-145细胞和PAMs细胞水平对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，结果表明CG能够显著性地降低N基因和N蛋白表达水平，且随着CG浓度的升高，抑制效果更明显，尤其是对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，为研制抗猪蓝耳病的新型药物奠定了基础。
本发明对猪蓝耳病的治疗提供了一种新的药物和药物基础，而且，CG已广泛运用于食品添加剂中，对细胞及机体几乎无毒性，故在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
而且CG应用于抗HP-PRRSV，有望成为一种新型的防治猪蓝耳病的药物，为CG提供了一种新的应用。
另外，本发明通过多种方法验证研究了CG对HP-PRRSV的抗病毒作用，而且阐述了其在病毒吸附和进入细胞两个过程中的抗病毒机制，为其应用奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为卡拉胶CG细胞毒性试验结果统计图。
图2为卡拉胶CG抗病毒试验中，分别经不同浓度CG作用36 h后，N基因相对于内参GAPDH的表达水平图（先接毒，后加CG）。
图3为卡拉胶CG抗病毒试验中，分别经不同浓度CG处理后的HP-PRRSV感染的Marc-145细胞上清中的病毒滴度图（先接毒，后加CG）。
图4为卡拉胶CG抗病毒试验中，经不同浓度CG处理36 h后，N蛋白表达水平图（先接毒，后加CG）。
图5为卡拉胶CG抗病毒试验中，分别经不同浓度CG作用36 h后，N基因相对于内参GAPDH的表达水平图（病毒与CG同时孵育）。
图6为卡拉胶CG抗病毒试验中，经不同浓度CG处理36 h后，N蛋白表达水平图（病毒与CG同时孵育）。
图7为卡拉胶CG抗病毒间接免疫荧光试验检测CG抗病毒效果图。
图8为卡拉胶CG抗病毒机制—病毒吸附细胞过程中，N基因相对于内参GAPDH的表达水平图。
图9为卡拉胶CG抗病毒机制—病毒吸附细胞过程中，N蛋白Western-Blot检测图。
图10为卡拉胶CG抗病毒机制—病毒吸附细胞过程中，细胞上清TCID50病毒滴度测定。
图11为卡拉胶CG抗病毒机制—病毒进入细胞过程中，N基因相对于内参GAPDH的表达水平图。
图12为卡拉胶CG抗病毒机制—病毒进入细胞过程中，N蛋白Western-Blot检测图。
图13为卡拉胶CG抗病毒机制—病毒进入细胞过程中，细胞上清TCID50病毒滴度测定。
图14为卡拉胶CG在PRRSV自然宿主细胞PAMs上抗病毒作用图。
图15为卡拉胶CG在PAMs细胞上对细胞因子IFN-α表达的影响。
图16为卡拉胶CG在PAMs细胞上对细胞因子IFN-β表达的影响。
图17为卡拉胶CG在Marc-145细胞上对细胞因子IFN-α表达的影响。
图18为卡拉胶CG在Marc-145细胞上对细胞因子IFN-β表达的影响。
图19为卡拉胶CG在Marc-145细胞上对细胞因子IL-6表达的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
实施例1 卡拉胶CG细胞毒性试验
1、AlamarBlue（购自Invitrogen公司）作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至60-70%，弃去培养液，加入含卡拉胶CG倍比稀释的营养液作用36 h，设定PBS对照组，然后加入10%（V/V）比例AlamarBlue继续培养3 h，使用多功能酶标仪分别读取540 nm激发光和590 nm发射光荧光值，制作卡拉胶CG细胞毒性图。
2、结果如附图1所示，以PBS对照组细胞活性作为100%，倍比稀释的卡拉胶CG处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下卡拉胶CG相对细胞活性，由图1可知，当卡拉胶CG浓度为50 μg/ml时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100%。
实施例2 卡拉胶CG抗病毒试验
1、第一种接毒方法：先接毒，后加CG。
在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次。以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养5 h。PBS洗3遍，分别将浓度为10、15、20 μg/ml卡拉胶CG的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37℃培养36 h，并设对照组。
2、卡拉胶CG另外一种抗病毒试验方法：CG与PRRSV同时孵育。
不同浓度10、15、20 μg/ml卡拉胶CG先与PRRSV 37℃孵育3 h，然后以MOI=0.1加入到Marc-145细胞中37℃培养2 h，弃去培养液，PBS洗3次，最后在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h，并设对照组。
3、收集以上两种方法处理后的细胞PBS洗3遍，每孔加700 μl Trizol，提RNA，做qRT-PCR检测。
结果如附图2（先接毒，后加CG）和5（CG与PRRSV同时孵育）所示，在转录水平上，在MOI=0.1的HP-PRRSV感染的Marc-145细胞，经卡拉胶CG作用36 h后，N基因相对于内参GAPDH的表达水平显著性地被卡拉胶CG抑制，表明卡拉胶CG能够抑制HP-PRRSV基因组复制。
4、同上以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养5h，PBS洗3遍，分别将浓度为10、15、20 μg/ml卡拉胶CG的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37℃培养36 h，并设对照组，收集1 ml上清做TCID50检测。50%组织细胞感染量（50% Tissueculture infection dose，TCID50）是指能使半数单层细胞管（孔）出现细胞病变的病毒稀释度。用此方法可以估计病毒感染性的强弱及病毒的含量。TCID50测定的具体方法是：取无菌EP管10支，各管分别加病毒稀释液0.9 mL，然后向第一管加病毒液0.1mL，反复混合3次，用另一新吸管从第一管内吸液0.1 mL加入至第二管内，反复混合3次，再换一新吸管，从第二管吸液0.1 mL加入第三管内，反复混合3次。以此类推将待测病毒液作连续10倍稀释，使病毒稀释度为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10，10-11等。吸弃微孔板各孔培养液，用灭菌PBS洗微孔板2次。用微量移液器将每个稀释度病毒液依次对号加入各个微孔中，每孔0.1mL，细胞对照不加病毒液，置37℃ CO2培养箱中培养3～4 d，在倒置显微镜下观察细胞病变情况。按Reed-Muench两氏法计算病毒TCID50。
结果如附图3所示。结果显示，卡拉胶CG能够使上清中病毒滴度下降，且随着卡拉胶CG浓度提高，抑制效果更明显，呈现浓度依赖性。表明卡拉胶CG能够降低病毒滴度，使HP-PRRSV毒力下降。
5、另外，弃去剩余培养液，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测。
结果如附图4（先接毒，后加CG）和6（CG与PRRSV同时孵育）所示。结果显示，卡拉胶CG能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着浓度升高，抑制效果更明显，呈现浓度依赖性。表明卡拉胶CG能够明显抑制病毒蛋白表达。
6、分别经不同浓度卡拉胶CG作用36 h后，N基因相对于内参GAPDH的表达水平，以及N蛋白表达水平，分别如附图5和图6所示。
7、在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养5h，PBS洗3遍，分别将浓度为10、15、20 μg/ml卡拉胶CG的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37℃培养36h，并设对照组，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗10 min，10% Triton-100穿孔15 min，PBS洗10 min，然后用PBS稀释的1% BSA封闭30 min，加入抗PRRSV N蛋白一抗（1：200稀释）4℃孵育过夜，抗鼠二抗作用（1：1000稀释）1 h，用DAPI染料染核5 min，PBS洗10 min，然后IFA检测，在荧光显微镜下观察卡拉胶CG抗病毒效果。
结果如附图7所示。结果显示，卡拉胶CG能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着浓度升高，抑制效果更明显，荧光越来越弱，呈现剂量依赖性。进一步表明了卡拉胶CG能够明显抑制病毒蛋白表达。
实施例3 卡拉胶CG抗病毒机制研究：病毒吸附抑制试验
1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入浓度为10、15、20 μg/ml CG，4℃孵育2 h。
2、PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5% CO2、37℃培养箱中继续培养24 h，弃去培养液，PBS洗3次，收集细胞，每孔加400 μL Trizol，提RNA，对N基因做qRT-PCR检测，结果如附图8所示。裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测，结果如附图9所示。收集细胞上清，做TCID50检测，结果如附图10所示。
以上结果表明，卡拉胶CG能够显著性地降低N基因和N蛋白表达水平，且随着卡拉胶CG浓度的升高，抑制效果更明显，说明在HP-PRRSV吸附细胞过程中，卡拉胶CG有抗病毒效果。
实施例4 卡拉胶CG抗病毒机制研究：病毒进入抑制试验
1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4℃孵育2 h。
2、PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后分别加入浓度为10、15、20μg/ml CG，在5% CO2、37℃培养箱中培养6 h。
3、PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24 h，弃去营养液，PBS洗3遍，收集细胞检测，结果如分别附图11、12、13所示，结果表明在HP-PRRSV进入细胞过程中，卡拉胶CG有很好的抗病毒效果。
实施例5 卡拉胶CG在PRRSV天然宿主细胞PAMs上的抗病毒作用
1、用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（加双抗）培养PAMs细胞至60～70%，弃去培养液，PBS洗3次，将含HP-PRRSV MOI=0.1的RPMI-1640培养液加入细胞37℃继续培养5 h，PBS洗3遍，将含20 μg/ml CG的RPMI-1640培养液加入细胞37℃培养24 h，收集细胞做qRT-PCR。
2、结果如附图14所示。结果表明，在PRRSV天然宿主细胞PAMs上，卡拉胶CG都能够显著地抑制HP-PRRSV复制。表明卡拉胶CG在PAMs细胞上能够抑制HP-PRRSV复制。
实施例6 卡拉胶CG在Marc-145和PAMs上对细胞因子影响
1、Marc-145细胞：在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养18 h，同时加入卡拉胶CG，同时设立阴性对照和不加任何处理的空白对照。
2、PAMs细胞：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（加双抗）培养PAMs细胞至60～70%，弃去培养液，PBS洗3次，将含HP-PRRSV MOI=0.1的RPMI-1640培养液加入细胞37℃继续培养18 h，同时加入卡拉胶CG，同时设立阴性对照和不加任何处理的空白对照。
3、收集细胞对细胞因子IL-6、IFN-α、IFN-β做qRT-PCR检测。
结果表明：在PAMs上，卡拉胶CG+PRRSV处理组与PRRSV处理组相比，卡拉胶CG+PRRSV处理组能够抑制IFN-α、IFN-β表达（如附图15、16所示）。
在Marc-145细胞上，卡拉胶CG+PRRSV处理组与PRRSV处理组相比，卡拉胶CG+PRRSV处理组能够抑制IFN-α、IFN-β及IL-6表达（如附图17、18、19所示）。
以上结果显示，卡拉胶CG通过抑制NF-κB介导的细胞因子上调来发挥抗病毒作用，即CG通过干扰NF-κB信号通路激活来抑制PRRSV复制。

Claims (2)

1.卡拉胶Carrageenan在制备抗PRRSV病毒的药物中的应用，其特征在于，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。
2.卡拉胶Carrageenan在制备防治猪蓝耳病的药物中的应用，其特征在于，所述猪蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的猪蓝耳病。
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