CN107468707A - 二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了二氧化氯在防治蓝耳病中的应用，尤其是高纯度二氧化氯液体在制备抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病药物中的应用。本发明首次通过各个层面、各个阶段的实验证明了二氧化氯对蓝耳病病毒，尤其是对高致病型毒株HP‑PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，为研制抗蓝耳病的新型药物奠定了基础。而且，本发明所用二氧化氯为高纯度的二氧化氯液体，安全、无毒，无三致效应，可口服，对机体无刺激、无毒性，不会引起药物残留，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子，为二氧化氯对蓝耳病病毒的抗病毒药物的研发提供了先决条件，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

Description

二氧化氯在防治蓝耳病中的应用

技术领域

本发明属于兽用医药技术领域。更具体地，涉及二氧化氯在防治蓝耳病中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse，PRRSV）引起，PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以Lelystad Virus（LV）毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse，HP-PRRSV），目前，高致病性蓝耳病（Highly pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome，HP-PRRS）是对养猪业损害最大的疾病之一，由于该病毒具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、病毒血症维持时间长等特点，目前尚没有很好的疫苗和药物可以防控蓝耳病。

PRRSV属于尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5′和3′非编码区，中间为10个开放阅读框（openreading frame，ORF），其中ORF2-7分别翻译病毒糖蛋白（glycoprotein GP）GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。

PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：（1）嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞（Porcinealveolar macrophages，PAMs），PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；（2）抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；（3）疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；（4）抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；（5）病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；（6）混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上加难。

目前PRRS防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点：（1）需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；（2）不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；（3）产生完全免疫力需要2～3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；（4）存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有蓝耳病防治技术的缺陷和不足，提供一种新的能够防治蓝耳病的物质—二氧化氯。本发明研究发现，二氧化氯对PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是针对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

本发明的目的是提供二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，尤其是抗HP-PRRSV药物中的应用。

本发明另一目的是提供二氧化氯在制备防治蓝耳病药物中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用。

进一步地，尤其是指在制备抗高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV药物中的应用。

本发明还提供了二氧化氯在制备防治蓝耳病药物中的应用。

进一步地，所述蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的蓝耳病。

优选地，上述二氧化氯是指纯度95%～99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。

更优选地，所述二氧化氯是指纯度99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。

该纯度99.9%二氧化氯溶液由上海碧珈圣科技有限公司提供。

另外，优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为20%～60%。

二氧化氯溶液的浓度是指二氧化氯气体溶于水后，溶液中二氧化氯气体的质量浓度。

更优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%～48%。

更优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%～36%。

另外，本发明还提供一种抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病的药物，该药物含有有效量的上述纯度95%～99.9%的二氧化氯气体或由纯度95%～99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。

该药物的剂型可以制备成不同的所需剂型。如注射制剂或口服制剂等。

本发明首次研究发现二氧化氯对蓝耳病病毒具有显著的抗病毒作用，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。而且，本发明使用的二氧化氯为：纯度为99.9%的新型安全二氧化氯气体溶于水（由上海碧珈圣科技有限公司提供）。这种纯度为99.9%二氧化氯液体无三致效应（致癌、致畸、致突变），高效、安全。与其他市面上的二氧化氯产品相比，具有显著的优势，市面上其他的二氧化氯产品主要是以亚氯酸盐的形式存在，经活化剂活化后，才能放出含有次氯酸钠的二氧化氯，而且活化后生成的二氧化氯含量不稳定，杀菌消毒能力与纯二氧化氯溶液有很大差距；更重要的是，这种类型的产品二氧化氯纯度低，含有大量的次氯酸钠与氯气，具有三致效应（致癌、致畸、致突变）。

本发明首先通过HP-PRRSV不同感染复数、感染时间分析二氧化氯对HP-PRRSV抗病毒作用，然后通过流式细胞术、Western-Blot方法研究二氧化氯与HP-PRRSV在Marc-145细胞上不同处理顺序二氧化氯抗病毒作用，接着分析二氧化氯对HP-PRRSV直接杀病毒作用，最后通过研究其在病毒吸附过程中作用阐述其抗病毒机制。通过各个层面各个阶段的实验证明了，本发明使用的二氧化氯能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次证明了二氧化氯的抗PRRSV病毒的作用。本发明通过多种方法研究证实了二氧化氯对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，尤其是对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，为研制抗蓝耳病的新型药物奠定了基础，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

本发明为了确证二氧化氯具有抗PRRSV作用，通过前处理（先加二氧化氯后接毒）、共处理（二氧化氯与HP-PRRSV同时加入）以及后处理（先接毒后加二氧化氯）试验充分证明了二氧化氯抗HP-PRRSV活性。以上试验也说明在PRRSV预防和治疗过程中，二氧化氯均有作用。

本发明还对二氧化氯抗HP-PRRSV作用的机制进行了研究，在病毒吸附过程阐述了二氧化氯抗病毒机制，为其应用奠定了坚实的基础。

另外，二氧化氯优选纯度为99.9%二氧化氯液体，安全、无毒，无三致效应，可口服，对机体无刺激、无毒性，不会引起药物残留，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子，为二氧化氯对蓝耳病病毒的抗病毒药物的研发提供了先决条件，而且为二氧化氯的推广应用提供了理论基础。

附图说明

图1为AlamarBlue检测二氧化氯对Marc-145细胞毒性。

图2为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞，经36 μg/ml 二氧化氯作用36h后，Western blot检测N蛋白表达水平。

图3为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞，经36 μg/ml 二氧化氯作用36h后，免疫荧光检测N蛋白表达水平。

图4为HP-PRRSV不同感染时间的Marc-145细胞，经36 μg/ml 二氧化氯作用36 h后，Western blot检测N蛋白表达水平。

图5为二氧化氯加入Marc-145细胞培养3 h，然后以MOI=0.1的HP-PRRSV感染细胞36 h，流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。

图6为二氧化氯和HP-PRRSV同时加入Marc-145细胞培养36 h后，流式和Westernblot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。

图7为MOI=0.1的HP-PRRSV感染Marc-145细胞3 h，然后加入二氧化氯培养36 h，流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。

图8为HP-PRRSV与二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后，加到Marc-145细胞上培养24 h，流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。

图9为HP-PRRSV与二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后，加到Marc-145细胞上培养24 h，免疫荧光检测PRRSV感染数量。

图10为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入不同浓度二氧化氯，4℃孵育2 h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5% CO₂、37℃培养箱中继续培养24 h，流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。

图11为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入不同浓度二氧化氯，4℃孵育2 h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5% CO₂、37℃培养箱中继续培养24 h，免疫荧光检测PRRSV感染数量。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。

实施例1 二氧化氯的细胞毒性

1、材料

二氧化氯溶液（纯度为99.9%的二氧化氯气体溶于水），由上海碧珈圣科技有限公司提供）。

AlamarBlue（购自Invitrogen公司）作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。

2、试验方法

用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞或者PAMs细胞至60～70%，弃去培养液，分别加入含二氧化氯倍比稀释的营养液作用36 h，设定PBS对照组，然后加入10%（v/v）比例AlamarBlue继续培养3 h，使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作二氧化氯细胞毒性图（如附图1所示）。

以PBS对照组细胞活性作为100%，倍比稀释的二氧化氯处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下二氧化氯相对细胞活性。

3、结果

由附图1可知，当二氧化氯浓度为60 μg/ml及以下时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100%。故后续实验二氧化氯浓度不高于60 μg/ml。

实施例2 不同感染复数、感染时间二氧化氯抗病毒试验

1、HP-PRRSV不同感染复数二氧化氯抗病毒试验

（1）Western blot检测

在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同感染复数MOI接毒HP-PRRSV，同时加入二氧化氯（终浓度36μg/ml）培养36 h，并设不加二氧化氯对照组，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot。

结果如附图2所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着感染复数MOI升高，也具有显著抑制效果。表明二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。

（2）免疫荧光检测

在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同感染复数MOI接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养5 h，PBS洗3遍，将二氧化氯（终浓度36 μg/ml）加入细胞37℃培养36 h，并设PBS对照组，PBS洗3遍，在荧光显微镜下观察二氧化氯抗病毒效果。

结果如附图3所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着感染复数MOI升高，也具有显著抑制效果。进一步表明了二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。

2、HP-PRRSV不同感染时间二氧化氯抗病毒试验

在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI = 0.1接毒HP-PRRSV，同时加入二氧化氯（终浓度36 μg/ml）培养0、12、24、36、48 h，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测。结果如附图4所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着感染时间升高，也具有显著抑制效果。表明二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。

实施例3 二氧化氯前处理Pre-treatment抗病毒试验

在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同浓度（0、36、48 μg/ml）二氧化氯加入细胞培养3 h，然后以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h，PBS洗3遍，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。

结果如附图5所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明先加二氧化氯后接毒（前处理）能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。

实施例4 二氧化氯共处理Co-treatment抗病毒试验

在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同浓度（0、36、48 μg/ml）二氧化氯加入细胞，同时以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃培养36 h，PBS洗3遍，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。

结果如附图6所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明二氧化氯和HP-PRRSV同时加入（共处理）能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。

实施例5 二氧化氯后处理Pro-treatment抗病毒试验

在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV培养3 h，然后以不同浓度（0、36、48μg/ml）二氧化氯加入细胞，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h，PBS洗3遍，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。

结果如附图7所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明先接毒后加二氧化氯（后处理）能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。

实施例6 二氧化氯直接杀病毒活性

在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次。HP-PRRSV分别与不同浓度（0、24、30、36 μg/ml）二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后，将孵育后的混合液体加入Marc-145细胞，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h，PBS洗3遍，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot和免疫荧光检测二氧化氯抗病毒效果。

结果如附图8和9所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明二氧化氯具有直接地杀病毒作用。

实施例7 二氧化氯的抗病毒机制研究—HP-PRRSV吸附抑制试验

本实验的目的是研究二氧化氯是否通过影响HP-PRRSV吸附Marc-145细胞从而达到抗HP-PRRSV目的。

1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入浓度为0、24、30、36 μg/ml 二氧化氯，4℃孵育2 h。孵育完后，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5% CO₂、37℃培养箱中继续培养24 h，弃去培养液，PBS洗3次，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot和免疫荧光检测二氧化氯抗病毒效果。

2、结果如附图10和11所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。

以上结果表明，二氧化氯能够显著抑制HP-PRRSV复制。说明在病毒吸附过程中，二氧化氯能够显著地抑制其吸附于细胞表面。

Claims (10)

1.二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。

3.二氧化氯在制备预防和/或治疗蓝耳病药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的蓝耳病。

5.根据权利要求1或3所述应用，其特征在于，所述二氧化氯是指纯度95%～99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。

6.根据权利要求1或3所述应用，其特征在于，所述二氧化氯是指纯度99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。

7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为20%～60%。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%～48%。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%～36%。

10.一种抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病的药物，其特征在于，含有有效量的二氧化氯，所述二氧化氯是指纯度95%～99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。