CN107468707B - 二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 - Google Patents

二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了二氧化氯在防治蓝耳病中的应用,尤其是高纯度二氧化氯液体在制备抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病药物中的应用。本发明首次通过各个层面、各个阶段的实验证明了二氧化氯对蓝耳病病毒,尤其是对高致病型毒株HP‑PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用,为研制抗蓝耳病的新型药物奠定了基础。而且,本发明所用二氧化氯为高纯度的二氧化氯液体,安全、无毒,无三致效应,可口服,对机体无刺激、无毒性,不会引起药物残留,有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子,为二氧化氯对蓝耳病病毒的抗病毒药物的研发提供了先决条件,在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

Description

二氧化氯在防治蓝耳病中的应用
技术领域
本发明属于兽用医药技术领域。更具体地,涉及二氧化氯在防治蓝耳病中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse,PRRSV)引起,PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状,特征性病变为间质性肺炎,死亡率极高,是一种高度接触性的全球性的重要传染病。该病最早于1987年在美国爆发,随后蔓延到欧洲,我国于1996年分离到该病毒。目前,根据基因组序列和抗原性差异,将PRRSV分为两种基因型,一种以Lelystad Virus(LV)毒株为代表的欧洲型,另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国,PRRSV主要以美洲型为主,但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年,我国爆发了猪高热病,对养猪业造成严重的经济损失,后来将此毒株定义为高致病型毒株(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse,HP-PRRSV),目前,高致病性蓝耳病(Highly pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome,HP-PRRS)是对养猪业损害最大的疾病之一,由于该病毒具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、病毒血症维持时间长等特点,目前尚没有很好的疫苗和药物可以防控蓝耳病。
PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员,电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形,有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA,全长约为15Kb,含有5′和3′非编码区,中间为10个开放阅读框(openreading frame,ORF),其中ORF2-7分别翻译病毒糖蛋白(glycoprotein GP)GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白,它们不仅是病毒粒子的主要组成部分,而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。
PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面:(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病,PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages,PAMs),PAMs是免疫细胞,破坏PAMs,从而破坏机体免疫系统,从而引起免疫抑制;(2)抗原变异性,目前PRRSV变异较快,弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因,最近有文献报道,美国出现了蓝耳新毒株NADC30,而我国也分离到类似美国的新毒株,命名为NADC30-like,而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株,且毒力增强,分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒;(3)疫苗没有交叉保护力,目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力,不同毒株间不交叉保护力;(4)抗体依赖性增强,PRRSV的感染会刺激机体产生抗体,但低效价的抗体不但不能中和病毒,反而对病毒的增殖有促进作用;(5)病毒持续性感染,PRRSV感染后,能够长时间在猪体内检测到病毒血症,PRRSV在体内持续时间长达5个月;(6)混合感染,目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染,特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染,使PRRSV的防控难上加难。
目前PRRS防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗,临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点:(1)需要大剂量接种或应用浓缩抗原,免疫期短,常需强化接种;(2)不能引起局部免疫,以致细胞免疫的作用弱;(3)产生完全免疫力需要2~3周,不利于紧急预防接种与降低疫苗费用;(4)存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有蓝耳病防治技术的缺陷和不足,提供一种新的能够防治蓝耳病的物质—二氧化氯。本发明研究发现,二氧化氯对PRRSV有很好的抗病毒作用,尤其是针对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用,在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
本发明的目的是提供二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用,尤其是抗HP-PRRSV药物中的应用。
本发明另一目的是提供二氧化氯在制备防治蓝耳病药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用。
进一步地,尤其是指在制备抗高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV药物中的应用。
本发明还提供了二氧化氯在制备防治蓝耳病药物中的应用。
进一步地,所述蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的蓝耳病。
优选地,上述二氧化氯是指纯度95%~99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
更优选地,所述二氧化氯是指纯度99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
该纯度99.9%二氧化氯溶液由上海碧珈圣科技有限公司提供。
另外,优选地,所述二氧化氯溶液的质量浓度为20%~60%。
二氧化氯溶液的浓度是指二氧化氯气体溶于水后,溶液中二氧化氯气体的质量浓度。
更优选地,所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%~48%。
更优选地,所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%~36%。
另外,本发明还提供一种抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病的药物,该药物含有有效量的上述纯度95%~99.9%的二氧化氯气体或由纯度95%~99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
该药物的剂型可以制备成不同的所需剂型。如注射制剂或口服制剂等。
本发明首次研究发现二氧化氯对蓝耳病病毒具有显著的抗病毒作用,在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。而且,本发明使用的二氧化氯为:纯度为99.9%的新型安全二氧化氯气体溶于水(由上海碧珈圣科技有限公司提供)。这种纯度为99.9%二氧化氯液体无三致效应(致癌、致畸、致突变),高效、安全。与其他市面上的二氧化氯产品相比,具有显著的优势,市面上其他的二氧化氯产品主要是以亚氯酸盐的形式存在,经活化剂活化后,才能放出含有次氯酸钠的二氧化氯,而且活化后生成的二氧化氯含量不稳定,杀菌消毒能力与纯二氧化氯溶液有很大差距;更重要的是,这种类型的产品二氧化氯纯度低,含有大量的次氯酸钠与氯气,具有三致效应(致癌、致畸、致突变)。
本发明首先通过HP-PRRSV不同感染复数、感染时间分析二氧化氯对HP-PRRSV抗病毒作用,然后通过流式细胞术、Western-Blot方法研究二氧化氯与HP-PRRSV在Marc-145细胞上不同处理顺序二氧化氯抗病毒作用,接着分析二氧化氯对HP-PRRSV直接杀病毒作用,最后通过研究其在病毒吸附过程中作用阐述其抗病毒机制。通过各个层面各个阶段的实验证明了,本发明使用的二氧化氯能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制,有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子。
本发明具有以下有益效果:
本发明首次证明了二氧化氯的抗PRRSV病毒的作用。本发明通过多种方法研究证实了二氧化氯对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果,尤其是对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用,为研制抗蓝耳病的新型药物奠定了基础,在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
本发明为了确证二氧化氯具有抗PRRSV作用,通过前处理(先加二氧化氯后接毒)、共处理(二氧化氯与HP-PRRSV同时加入)以及后处理(先接毒后加二氧化氯)试验充分证明了二氧化氯抗HP-PRRSV活性。以上试验也说明在PRRSV预防和治疗过程中,二氧化氯均有作用。
本发明还对二氧化氯抗HP-PRRSV作用的机制进行了研究,在病毒吸附过程阐述了二氧化氯抗病毒机制,为其应用奠定了坚实的基础。
另外,二氧化氯优选纯度为99.9%二氧化氯液体,安全、无毒,无三致效应,可口服,对机体无刺激、无毒性,不会引起药物残留,有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子,为二氧化氯对蓝耳病病毒的抗病毒药物的研发提供了先决条件,而且为二氧化氯的推广应用提供了理论基础。
附图说明
图1为AlamarBlue检测二氧化氯对Marc-145细胞毒性。
图2为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞,经36 μg/ml 二氧化氯作用36h后,Western blot检测N蛋白表达水平。
图3为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞,经36 μg/ml 二氧化氯作用36h后,免疫荧光检测N蛋白表达水平。
图4为HP-PRRSV不同感染时间的Marc-145细胞,经36 μg/ml 二氧化氯作用36 h后,Western blot检测N蛋白表达水平。
图5为二氧化氯加入Marc-145细胞培养3 h,然后以MOI=0.1的HP-PRRSV感染细胞36 h,流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图6为二氧化氯和HP-PRRSV同时加入Marc-145细胞培养36 h后,流式和Westernblot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图7为MOI=0.1的HP-PRRSV感染Marc-145细胞3 h,然后加入二氧化氯培养36 h,流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图8为HP-PRRSV与二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后,加到Marc-145细胞上培养24 h,流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图9为HP-PRRSV与二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后,加到Marc-145细胞上培养24 h,免疫荧光检测PRRSV感染数量。
图10为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV,并分别加入不同浓度二氧化氯,4℃孵育2 h,PBS洗3次,将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉,然后在5% CO2、37℃培养箱中继续培养24 h,流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图11为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV,并分别加入不同浓度二氧化氯,4℃孵育2 h,PBS洗3次,将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉,然后在5% CO2、37℃培养箱中继续培养24 h,免疫荧光检测PRRSV感染数量。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明以下实施例的统计学分析:所有试验至少3次独立重复,结果采用平均值和标准误表示,使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准,分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
实施例1 二氧化氯的细胞毒性
1、材料
二氧化氯溶液(纯度为99.9%的二氧化氯气体溶于水),由上海碧珈圣科技有限公司提供)。
AlamarBlue(购自Invitrogen公司)作为活细胞代谢指示剂,在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物,通过测定其荧光强度可监测细胞活性。
2、试验方法
用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞或者PAMs细胞至60~70%,弃去培养液,分别加入含二氧化氯倍比稀释的营养液作用36 h,设定PBS对照组,然后加入10%(v/v)比例AlamarBlue继续培养3 h,使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值,制作二氧化氯细胞毒性图(如附图1所示)。
以PBS对照组细胞活性作为100%,倍比稀释的二氧化氯处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下二氧化氯相对细胞活性。
3、结果
由附图1可知,当二氧化氯浓度为60 μg/ml及以下时,其对Marc-145细胞没有毒性,细胞活性100%。故后续实验二氧化氯浓度不高于60 μg/ml。
实施例2 不同感染复数、感染时间二氧化氯抗病毒试验
1、HP-PRRSV不同感染复数二氧化氯抗病毒试验
(1)Western blot检测
在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时,弃去培养液,PBS洗3次,分别以不同感染复数MOI接毒HP-PRRSV,同时加入二氧化氯(终浓度36 μg/ml)培养36 h,并设不加二氧化氯对照组,PBS洗3遍,0.25%胰酶消化,裂解细胞,测蛋白浓度,Western-Blot。
结果如附图2所示:二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达,且随着感染复数MOI升高,也具有显著抑制效果。表明二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。
(2)免疫荧光检测
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时,弃去培养液,PBS洗3次,分别以不同感染复数MOI接毒HP-PRRSV,在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养5 h,PBS洗3遍,将二氧化氯(终浓度36 μg/ml)加入细胞37℃培养36h,并设PBS对照组,PBS洗3遍,在荧光显微镜下观察二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图3所示:二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达,且随着感染复数MOI升高,也具有显著抑制效果。进一步表明了二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。
2、HP-PRRSV不同感染时间二氧化氯抗病毒试验
在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时,弃去培养液,PBS洗3次,以感染复数MOI = 0.1接毒HP-PRRSV,同时加入二氧化氯(终浓度36 μg/ml)培养0、12、24、36、48 h,PBS洗3遍,0.25%胰酶消化,裂解细胞,测蛋白浓度,Western-Blot检测。结果如附图4所示:二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达,且随着感染时间升高,也具有显著抑制效果。表明二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。
实施例3 二氧化氯前处理Pre-treatment抗病毒试验
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时,弃去培养液,PBS洗3次,分别以不同浓度(0、36、48 μg/ml)二氧化氯加入细胞培养3 h,然后以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV,在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h,PBS洗3遍,收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图5所示:二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明先加二氧化氯后接毒(前处理)能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。
实施例4 二氧化氯共处理Co-treatment抗病毒试验
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时,弃去培养液,PBS洗3次,分别以不同浓度(0、36、48 μg/ml)二氧化氯加入细胞,同时以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV,在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃培养36 h,PBS洗3遍,收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图6所示:二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明二氧化氯和HP-PRRSV同时加入(共处理)能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。
实施例5 二氧化氯后处理Pro-treatment抗病毒试验
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时,弃去培养液,PBS洗3次,以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV培养3 h,然后以不同浓度(0、36、48 μg/ml)二氧化氯加入细胞,在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h,PBS洗3遍,收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图7所示:二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明先接毒后加二氧化氯(后处理)能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。
实施例6 二氧化氯直接杀病毒活性
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时,弃去培养液,PBS洗3次。HP-PRRSV分别与不同浓度(0、24、30、36 μg/ml)二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后,将孵育后的混合液体加入Marc-145细胞,在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h,PBS洗3遍,收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot和免疫荧光检测二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图8和9所示:二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明二氧化氯具有直接地杀病毒作用。
实施例7 二氧化氯的抗病毒机制研究—HP-PRRSV吸附抑制试验
本实验的目的是研究二氧化氯是否通过影响HP-PRRSV吸附Marc-145细胞从而达到抗HP-PRRSV目的。
1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次,然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV,并分别加入浓度为0、24、30、36 μg/ml 二氧化氯,4℃孵育2 h。孵育完后,PBS洗3次,将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉,然后在5% CO2、37℃培养箱中继续培养24 h,弃去培养液,PBS洗3次,收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot和免疫荧光检测二氧化氯抗病毒效果。
2、结果如附图10和11所示:二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。
以上结果表明,二氧化氯能够显著抑制HP-PRRSV复制。说明在病毒吸附过程中,二氧化氯能够显著地抑制其吸附于细胞表面。

Claims (7)

1.二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用,其特征在于,所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。
2.二氧化氯在制备预防和/或治疗蓝耳病药物中的应用,其特征在于,所述蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的蓝耳病。
3.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述二氧化氯是指纯度95%~99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
4.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述二氧化氯是指纯度99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
5.根据权利要求3或4所述应用,其特征在于,所述二氧化氯溶液的质量浓度为20%~60%。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%~48%。
7.根据权利要求6所述应用,其特征在于,所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%~36%。
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DISINFECTION EFFECT OF CHLORINE DIOXIDE ON VIRUSES, ALGAE AND ANIMAL PLANKTONS IN WATER;HUANG JUNLI等;《Wat. Res.》;19971231;第31卷(第3期);参见全文 *

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