CN107468707B - 二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 - Google Patents
二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107468707B CN107468707B CN201710750967.5A CN201710750967A CN107468707B CN 107468707 B CN107468707 B CN 107468707B CN 201710750967 A CN201710750967 A CN 201710750967A CN 107468707 B CN107468707 B CN 107468707B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chlorine dioxide
- prrsv
- virus
- ear disease
- blue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- OSVXSBDYLRYLIG-UHFFFAOYSA-N dioxidochlorine(.) Chemical compound O=Cl=O OSVXSBDYLRYLIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 278
- 239000004155 Chlorine dioxide Substances 0.000 title claims abstract description 139
- 235000019398 chlorine dioxide Nutrition 0.000 title claims abstract description 139
- 208000032625 disorder of ear Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 claims abstract description 39
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 19
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 abstract description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003640 drug residue Substances 0.000 abstract description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 35
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 23
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 18
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000003253 viricidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 2
- 241001292005 Nidovirales Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 208000031320 Teratogenesis Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N Chlorine Chemical compound ClCl KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101001066778 Enterobacteria phage HK97 Portal protein Proteins 0.000 description 1
- 101000619174 Enterobacteria phage HK97 Prohead protease Proteins 0.000 description 1
- 101150034914 GP2a gene Proteins 0.000 description 1
- 101150061218 GP2b gene Proteins 0.000 description 1
- -1 GP5a Proteins 0.000 description 1
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 description 1
- 101000777658 Homo sapiens Platelet glycoprotein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001033026 Homo sapiens Platelet glycoprotein V Proteins 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- SPEFJYZGXZENAF-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-1-(2,4-dichlorophenyl)-6-methyl-4H-indeno[1,2-c]pyrazole-3-carboxamide Chemical compound C=1C(C)=CC=C(C2=3)C=1CC=3C(C(=O)NC1CCCCC1)=NN2C1=CC=C(Cl)C=C1Cl SPEFJYZGXZENAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910001919 chlorite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052619 chlorite group Inorganic materials 0.000 description 1
- QBWCMBCROVPCKQ-UHFFFAOYSA-N chlorous acid Chemical compound OCl=O QBWCMBCROVPCKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
- A61K33/20—Elemental chlorine; Inorganic compounds releasing chlorine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了二氧化氯在防治蓝耳病中的应用，尤其是高纯度二氧化氯液体在制备抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病药物中的应用。本发明首次通过各个层面、各个阶段的实验证明了二氧化氯对蓝耳病病毒，尤其是对高致病型毒株HP‑PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，为研制抗蓝耳病的新型药物奠定了基础。而且，本发明所用二氧化氯为高纯度的二氧化氯液体，安全、无毒，无三致效应，可口服，对机体无刺激、无毒性，不会引起药物残留，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子，为二氧化氯对蓝耳病病毒的抗病毒药物的研发提供了先决条件，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于兽用医药技术领域。更具体地，涉及二氧化氯在防治蓝耳病中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse，PRRSV）引起，PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以Lelystad Virus（LV）毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse，HP-PRRSV），目前，高致病性蓝耳病（Highly pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome，HP-PRRS）是对养猪业损害最大的疾病之一，由于该病毒具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、病毒血症维持时间长等特点，目前尚没有很好的疫苗和药物可以防控蓝耳病。
PRRSV属于尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5′和3′非编码区，中间为10个开放阅读框（openreading frame，ORF），其中ORF2-7分别翻译病毒糖蛋白（glycoprotein GP）GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。
PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：（1）嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞（Porcinealveolar macrophages，PAMs），PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；（2）抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；（3）疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；（4）抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；（5）病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；（6）混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上加难。
目前PRRS防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点：（1）需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；（2）不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；（3）产生完全免疫力需要2～3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；（4）存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有蓝耳病防治技术的缺陷和不足，提供一种新的能够防治蓝耳病的物质—二氧化氯。本发明研究发现，二氧化氯对PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是针对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
本发明的目的是提供二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，尤其是抗HP-PRRSV药物中的应用。
本发明另一目的是提供二氧化氯在制备防治蓝耳病药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用。
进一步地，尤其是指在制备抗高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV药物中的应用。
本发明还提供了二氧化氯在制备防治蓝耳病药物中的应用。
进一步地，所述蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的蓝耳病。
优选地，上述二氧化氯是指纯度95%～99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
更优选地，所述二氧化氯是指纯度99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
该纯度99.9%二氧化氯溶液由上海碧珈圣科技有限公司提供。
另外，优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为20%～60%。
二氧化氯溶液的浓度是指二氧化氯气体溶于水后，溶液中二氧化氯气体的质量浓度。
更优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%～48%。
更优选地，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24%～36%。
另外，本发明还提供一种抗PRRSV病毒和/或防治蓝耳病的药物，该药物含有有效量的上述纯度95%～99.9%的二氧化氯气体或由纯度95%～99.9%的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
该药物的剂型可以制备成不同的所需剂型。如注射制剂或口服制剂等。
本发明首次研究发现二氧化氯对蓝耳病病毒具有显著的抗病毒作用，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。而且，本发明使用的二氧化氯为：纯度为99.9%的新型安全二氧化氯气体溶于水（由上海碧珈圣科技有限公司提供）。这种纯度为99.9%二氧化氯液体无三致效应（致癌、致畸、致突变），高效、安全。与其他市面上的二氧化氯产品相比，具有显著的优势，市面上其他的二氧化氯产品主要是以亚氯酸盐的形式存在，经活化剂活化后，才能放出含有次氯酸钠的二氧化氯，而且活化后生成的二氧化氯含量不稳定，杀菌消毒能力与纯二氧化氯溶液有很大差距；更重要的是，这种类型的产品二氧化氯纯度低，含有大量的次氯酸钠与氯气，具有三致效应（致癌、致畸、致突变）。
本发明首先通过HP-PRRSV不同感染复数、感染时间分析二氧化氯对HP-PRRSV抗病毒作用，然后通过流式细胞术、Western-Blot方法研究二氧化氯与HP-PRRSV在Marc-145细胞上不同处理顺序二氧化氯抗病毒作用，接着分析二氧化氯对HP-PRRSV直接杀病毒作用，最后通过研究其在病毒吸附过程中作用阐述其抗病毒机制。通过各个层面各个阶段的实验证明了，本发明使用的二氧化氯能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次证明了二氧化氯的抗PRRSV病毒的作用。本发明通过多种方法研究证实了二氧化氯对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，尤其是对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，为研制抗蓝耳病的新型药物奠定了基础，在蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
本发明为了确证二氧化氯具有抗PRRSV作用，通过前处理（先加二氧化氯后接毒）、共处理（二氧化氯与HP-PRRSV同时加入）以及后处理（先接毒后加二氧化氯）试验充分证明了二氧化氯抗HP-PRRSV活性。以上试验也说明在PRRSV预防和治疗过程中，二氧化氯均有作用。
本发明还对二氧化氯抗HP-PRRSV作用的机制进行了研究，在病毒吸附过程阐述了二氧化氯抗病毒机制，为其应用奠定了坚实的基础。
另外，二氧化氯优选纯度为99.9%二氧化氯液体，安全、无毒，无三致效应，可口服，对机体无刺激、无毒性，不会引起药物残留，有望成为新型的防治蓝耳病的生物活性分子，为二氧化氯对蓝耳病病毒的抗病毒药物的研发提供了先决条件，而且为二氧化氯的推广应用提供了理论基础。
附图说明
图1为AlamarBlue检测二氧化氯对Marc-145细胞毒性。
图2为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞，经36 μg/ml 二氧化氯作用36h后，Western blot检测N蛋白表达水平。
图3为HP-PRRSV不同感染复数MOI的Marc-145细胞，经36 μg/ml 二氧化氯作用36h后，免疫荧光检测N蛋白表达水平。
图4为HP-PRRSV不同感染时间的Marc-145细胞，经36 μg/ml 二氧化氯作用36 h后，Western blot检测N蛋白表达水平。
图5为二氧化氯加入Marc-145细胞培养3 h，然后以MOI=0.1的HP-PRRSV感染细胞36 h，流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图6为二氧化氯和HP-PRRSV同时加入Marc-145细胞培养36 h后，流式和Westernblot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图7为MOI=0.1的HP-PRRSV感染Marc-145细胞3 h，然后加入二氧化氯培养36 h，流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图8为HP-PRRSV与二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后，加到Marc-145细胞上培养24 h，流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图9为HP-PRRSV与二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后，加到Marc-145细胞上培养24 h，免疫荧光检测PRRSV感染数量。
图10为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入不同浓度二氧化氯，4℃孵育2 h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5% CO2、37℃培养箱中继续培养24 h，流式和Western blot检测PRRSV感染数量和N蛋白表达水平。
图11为以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入不同浓度二氧化氯，4℃孵育2 h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5% CO2、37℃培养箱中继续培养24 h，免疫荧光检测PRRSV感染数量。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
实施例1 二氧化氯的细胞毒性
1、材料
二氧化氯溶液（纯度为99.9%的二氧化氯气体溶于水），由上海碧珈圣科技有限公司提供）。
AlamarBlue（购自Invitrogen公司）作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。
2、试验方法
用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞或者PAMs细胞至60～70%，弃去培养液，分别加入含二氧化氯倍比稀释的营养液作用36 h，设定PBS对照组，然后加入10%（v/v）比例AlamarBlue继续培养3 h，使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作二氧化氯细胞毒性图（如附图1所示）。
以PBS对照组细胞活性作为100%，倍比稀释的二氧化氯处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下二氧化氯相对细胞活性。
3、结果
由附图1可知，当二氧化氯浓度为60 μg/ml及以下时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100%。故后续实验二氧化氯浓度不高于60 μg/ml。
实施例2 不同感染复数、感染时间二氧化氯抗病毒试验
1、HP-PRRSV不同感染复数二氧化氯抗病毒试验
（1）Western blot检测
在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同感染复数MOI接毒HP-PRRSV，同时加入二氧化氯（终浓度36 μg/ml）培养36 h，并设不加二氧化氯对照组，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot。
结果如附图2所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着感染复数MOI升高，也具有显著抑制效果。表明二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。
（2）免疫荧光检测
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同感染复数MOI接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养5 h，PBS洗3遍，将二氧化氯（终浓度36 μg/ml）加入细胞37℃培养36h，并设PBS对照组，PBS洗3遍，在荧光显微镜下观察二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图3所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着感染复数MOI升高，也具有显著抑制效果。进一步表明了二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。
2、HP-PRRSV不同感染时间二氧化氯抗病毒试验
在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI = 0.1接毒HP-PRRSV，同时加入二氧化氯（终浓度36 μg/ml）培养0、12、24、36、48 h，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测。结果如附图4所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白表达，且随着感染时间升高，也具有显著抑制效果。表明二氧化氯能够明显抑制病毒蛋白表达。
实施例3 二氧化氯前处理Pre-treatment抗病毒试验
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同浓度（0、36、48 μg/ml）二氧化氯加入细胞培养3 h，然后以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h，PBS洗3遍，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图5所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明先加二氧化氯后接毒（前处理）能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。
实施例4 二氧化氯共处理Co-treatment抗病毒试验
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，分别以不同浓度（0、36、48 μg/ml）二氧化氯加入细胞，同时以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃培养36 h，PBS洗3遍，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图6所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明二氧化氯和HP-PRRSV同时加入（共处理）能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。
实施例5 二氧化氯后处理Pro-treatment抗病毒试验
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI=0.1接毒HP-PRRSV培养3 h，然后以不同浓度（0、36、48 μg/ml）二氧化氯加入细胞，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h，PBS洗3遍，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot检测二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图7所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明先接毒后加二氧化氯（后处理）能够显著抑制HP-PRRSV感染和复制。
实施例6 二氧化氯直接杀病毒活性
在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次。HP-PRRSV分别与不同浓度（0、24、30、36 μg/ml）二氧化氯在37℃培养箱中孵育6 h后，将孵育后的混合液体加入Marc-145细胞，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养36 h，PBS洗3遍，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot和免疫荧光检测二氧化氯抗病毒效果。
结果如附图8和9所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。表明二氧化氯具有直接地杀病毒作用。
实施例7 二氧化氯的抗病毒机制研究—HP-PRRSV吸附抑制试验
本实验的目的是研究二氧化氯是否通过影响HP-PRRSV吸附Marc-145细胞从而达到抗HP-PRRSV目的。
1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入浓度为0、24、30、36 μg/ml 二氧化氯，4℃孵育2 h。孵育完后，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5% CO2、37℃培养箱中继续培养24 h，弃去培养液，PBS洗3次，收集细胞在流式细胞仪上分析或做Western-Blot和免疫荧光检测二氧化氯抗病毒效果。
2、结果如附图10和11所示：二氧化氯能够明显抑制HP-PRRSV 感染和N蛋白表达。
以上结果表明，二氧化氯能够显著抑制HP-PRRSV复制。说明在病毒吸附过程中，二氧化氯能够显著地抑制其吸附于细胞表面。
Claims (7)
1.二氧化氯在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，其特征在于，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。
2.二氧化氯在制备预防和/或治疗蓝耳病药物中的应用，其特征在于，所述蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的蓝耳病。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述二氧化氯是指纯度95％～99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述二氧化氯是指纯度99.9％的二氧化氯气体溶于水所得的二氧化氯溶液。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为20％～60％。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24％～48％。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述二氧化氯溶液的质量浓度为24％～36％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710750967.5A CN107468707B (zh) | 2017-08-28 | 2017-08-28 | 二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710750967.5A CN107468707B (zh) | 2017-08-28 | 2017-08-28 | 二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107468707A CN107468707A (zh) | 2017-12-15 |
| CN107468707B true CN107468707B (zh) | 2020-01-10 |
Family
ID=60604007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710750967.5A Active CN107468707B (zh) | 2017-08-28 | 2017-08-28 | 二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107468707B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111956661B (zh) * | 2020-08-12 | 2023-06-16 | 中山大学 | 二氧化氯在防治非洲猪瘟中的应用 |
-
2017
- 2017-08-28 CN CN201710750967.5A patent/CN107468707B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DISINFECTION EFFECT OF CHLORINE DIOXIDE ON VIRUSES, ALGAE AND ANIMAL PLANKTONS IN WATER;HUANG JUNLI等;《Wat. Res.》;19971231;第31卷(第3期);参见全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107468707A (zh) | 2017-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2561595C2 (ru) | Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs) | |
| TWI579297B (zh) | 用於預防豬病感染之混合疫苗 | |
| JP2008526921A (ja) | 改善されたｐｒｒｓワクチン | |
| Gao et al. | Cryptoporus volvatus extract inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in vitro and in vivo | |
| EP2658570B1 (en) | Bovine viral diarrhea virus type 1b vaccine compositions and methods | |
| CN102488895A (zh) | 一种猪圆环病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒三联病毒样颗粒疫苗及其制备方法 | |
| CN101695570A (zh) | 一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法 | |
| KR101502360B1 (ko) | 신규한 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 | |
| CN103725651A (zh) | 一株猪流行性腹泻病毒及其应用 | |
| CN101928782B (zh) | 同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物和试剂盒 | |
| WO2015056850A1 (ko) | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 | |
| CN114053279A (zh) | 利福平在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用 | |
| CN107468707B (zh) | 二氧化氯在防治蓝耳病中的应用 | |
| CN103908665A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN114767682A (zh) | 利福平联合白藜芦醇在制备治疗蓝耳病药物中的应用 | |
| KR101430223B1 (ko) | 면역유도능이 증가된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 | |
| CN112336717B (zh) | 尹奎色亭在制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用 | |
| EP4272755A1 (en) | Combined vaccine for preventing hand, foot and mouth disease, preparation method therefor and use thereof | |
| CN105802919B (zh) | 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用 | |
| CN109602899B (zh) | 一种增强病毒抗原免疫原性的皮内注射技术及其在手足口病疫苗研究中的应用 | |
| CN102727882A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、伪狂犬病的三联活疫苗及其制备方法 | |
| CN105477011B (zh) | 卡拉胶Carrageenan在防治猪蓝耳病中的应用 | |
| CN114224891B (zh) | 氯法齐明在制备预防、治疗蓝耳病以及抗prrsv的药物中的应用 | |
| CN104248759A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| RU2806601C1 (ru) | Штамм "Борз" вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней Betaarterivirus suid 1 рода Arterivirus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200615 Address after: Room A216, A217, A218, 2 / F, 37 Gaoke Road, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province 510000 Patentee after: Guangzhou Yuanhua Biotechnology Co., Ltd Address before: 510275 Xingang West Road, Guangdong, Guangzhou, No. 135, No. Patentee before: SUN YAT-SEN University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |