CN114053279A - 利福平在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利福平在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。本发明发现利福平对猪繁殖与呼吸综合征的高致病型病毒HP‑PRRSV具有显著的抗病毒作用，可将其用于制备抗猪繁殖与呼吸综合征的药物。此外，利福平具有很强的抗菌活性，对需氧型革兰式阳性菌和部分需氧型革兰式阴性菌亦有良好的抗菌作用，可以做到一药治多病，也可以联合用药增强疗效。且利福平口服吸收效果好，用药方便，有望成为新型的防治猪繁殖与呼吸综合征的生物活性分子，在猪繁殖与呼吸综合征的防治方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于兽用医药技术领域。更具体地，涉及利福平在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveandrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍及各年龄段猪呼吸道疾病为主要特征的猪传染病，对养猪业的危害极大。除PRRSV外，还有一新变种，高致病性PRRSV(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndromevirus，HP-PRRSV)，其引起的非典型PRRS对养猪业的危害也极大。而由于猪繁殖与呼吸综合征病毒及其变种具有抗体依赖增强性和免疫抑制性，以及病毒血症维持时间长，持续性感染等特点，尚没有很好的疫苗和药物可以防控猪繁殖与呼吸综合征。
目前，PRRS的防控主要依赖于灭活疫苗和弱毒疫苗，随着这两种疫苗的推广使用，其缺点也渐渐显现。其中，灭活疫苗很难引起细胞免疫，要求接种剂量大，免疫期短，通常需要强化接种，且产生完全免疫力所需时间长，紧急预防接种作用小，生产疫苗费用成本高；生产不规范的灭活疫苗还可能存在灭活不彻底和散毒的情况。而弱毒疫苗则存在容易毒力返强，存在潜在感染等缺点，以及与野生毒株重组的风险。疫苗防治暴露出的问题日益增多，亟需寻找开发用于治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物。
利福平是利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，应用广泛。利福平对结核杆菌有较强抗菌作用，可与其他抗结核药合用起协同作用，延缓耐药菌株产生。利福平对其它革兰氏阳性或阴性细菌也有疗效，主要用于治疗结核病、脑膜炎和金黄色葡萄球菌感染，外用可治疗沙眼，或与其他抗生素联用用于防治禽畜呼吸道疾病等。利福平还可用于农业害虫的防治，例如，中国专利CN103478140A公开了利福平在制备烟粉虱杀虫剂中的应用。
发明内容
本发明的目的在于拓展利福平的应用范围，提供利福平在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征中的应用。
本发明的第一个目的是提供利福平在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供利福平在制备预防和/或治疗由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供利福平在制备抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供利福平在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒感染或增殖的药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明发现利福平对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)具有显著的抗病毒作用。具体地，本发明通过对HP-PRRSV不同感染复数、感染时间，分析利福平对HP-PRRSV的抗病毒作用，利用Western-Blot、qRT-PCR和免疫荧光等技术，在各个层面证明了利福平能够显著抑制HP-PRRSV的感染和复制，具有显著的抗HP-PRRSV病毒的作用。而HP-PRRSV和PRRSV中仅有两种病毒蛋白不同，后续发现利福平抑制HP-PRRSV的作用机制不牵涉这两个蛋白，故推断利福平对PRRSV同样有抗病毒作用。综上，利福平的抗病毒效果使其有望成为新型的防治猪繁殖与呼吸综合征的生物活性分子，在猪繁殖与呼吸综合征的防治方面具有很好的应用前景。
因此，本发明申请保护以下应用：
利福平在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。
利福平在制备预防猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。
利福平在制备治疗由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。
利福平在制备预防由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。
利福平在制备抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。
利福平在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。
利福平在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的药物中的应用。
利福平在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的药物中的应用。
利福平在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的药物中的应用。
利福平在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的药物中的应用。
优选地，所述利福平的使用终浓度为75～200μM，见实施例2。
本发明具有以下有益效果：
本发明发现利福平对猪繁殖与呼吸综合征的高致病型病毒HP-PRRSV具有显著的抗病毒作用，可将其用于制备抗猪繁殖与呼吸综合征的药物。此外，利福平具有很强的抗菌活性，对需氧型革兰式阳性菌和部分需氧型革兰式阴性菌亦有良好的抗菌作用，可以做到一药治多病，也可以联合用药增强疗效。且利福平口服吸收效果好，用药方便，有望成为新型的防治猪繁殖与呼吸综合征的生物活性分子，在猪繁殖与呼吸综合征的防治方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为利福平对Marc-145细胞毒性的检测结果。
图2为浓度为0～200μM的利福平处理HP-PRRSV感染的Marc-145细胞24h后，N蛋白表达水平的Western blot检测结果。
图3为浓度为150μM的利福平处理HP-PRRSV感染的Marc-145细胞24、30h、36h后，N蛋白表达水平的Western blot检测结果。
图4为浓度为150μM的利福平处理HP-PRRSV感染的Marc-145细胞24、30h、36h后，N蛋白基因表达水平的qRT-PCR检测结果。
图5为浓度为150μM的利福平处理HP-PRRSV感染的Marc-145细胞24、30h、36h后，N蛋白与nsp4蛋白表达水平的免疫荧光检测结果。
图6为浓度为150μM的利福平处理HP-PRRSV感染的Marc-145细胞24、30h、36h后，TCID50的检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
统计学分析：本发明实施例中的所有试验至少独立重复3次，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<；0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 8。
实施例1利福平的细胞毒性
本发明利用CCK-8(翌圣生物科技股份有限公司)作为活细胞代谢指示剂进行细胞毒性检测。其工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，试剂盒中的WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比，使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，可间接反映活细胞数量。
试验方法：
用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至细胞汇合度为60～70％时，弃去培养液，分别加入含利福平倍比稀释的营养液(利福平的终浓度依次为0、10、25、50、75、100、125、150、175和200μM)作用24h，同时设置DMSO对照组和不含细胞的培养液作为空白对照，然后加入10％(v/v)比例的CCK-8继续培养1.5h，使用多功能酶标仪读取450nm的吸光度，制作利福平细胞毒性图。
以DMSO对照组细胞活性作为100％，不同浓度的利福平处理的细胞的吸光度与空白对照的吸光度的差值，比上DMSO对照组吸光度与空白对照的吸光度的差值，即为不同浓度下利福平相对细胞活性。
利福平的细胞毒性图如附图1所示，由图1可知，当利福平浓度≤200μM时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100％，故后续实验利福平浓度均为200μM以下。
实施例2不同浓度利福平的抗HP-PRRSV病毒试验
在含10％胎牛血清的DMEM培养液的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次。板中依次加入利福平(利福平终浓度分别为0、10、25、50、75、100、125、150、175和200μM)的维持培养基，取相同感染复数(MOI＝0.1)接毒HP-PRRSV培养24h，同时设不接毒对照组。24h后，PBS洗3遍，0.25％胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，利用Western-Blot检测HP-PRRSV N蛋白的表达情况。
结果如附图2所示，由图可知，浓度高于75μM的利福平能够明显抑制HP-PRRSV N蛋白的表达，且随着利福平浓度越高，抑制效果越好，表明利福平能够明显剂量依赖抑制病毒蛋白表达。
实例3HP-PRRSV不同感染时间的利福平抗病毒试验
(1)Western blot检测
在含10％胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中，培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝0.1接毒HP-PRRSV，同时加入利福平(终浓度150μM)培养24、30、36h，随后PBS洗3遍，0.25％胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，利用Western-Blot检测HP-PRRSV N蛋白的表达情况。
(2)qRT-PCR检测
在含10％胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中，培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝0.1接毒HP-PRRSV，同时加入利福平(终浓度150μM)培养24、30、36h，随后PBS洗3遍，提取细胞总RNA并反转录，利用qRT-PCR检测HP-PRRSV N蛋白基因的表达情况。
(3)免疫荧光检测
在含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中，培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝0.1接毒HP-PRRSV，同时加入利福平(终浓度150μM)培养24、30、36h，并设DMSO对照组，PBS洗3遍，然后固定、通透、孵育N蛋白和nsp4蛋白，孵育对应荧光二抗和DAPI，在荧光显微镜下观察利福平抗病毒效果。
(4)HP-PRRSV病毒滴度检测
在含10％胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中，培养Marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝0.1接毒HP-PRRSV，同时加入利福平(终浓度150μM)培养24、30、36h，随后吸取培养上清，进行TCID50检测，检测产生的有感染活力的HP-PRRSV的数量。
浓度为150μM的利福平分别处理HP-PRRSV感染的Marc-145细胞24、30h和36h后，N蛋白表达水平的Western blot检测结果如图3所示，图中**代表差异显著，P＜0.01；***代表差异极显著，P＜0.001；N蛋白基因表达水平的qRT-PCR检测结果如图4所示；N蛋白与nsp4蛋白表达水平的免疫荧光检测结果如图5所示；TCID50的检测结果如图6所示，图中**代表差异显著，P＜0.01；***代表差异极显著，P＜0.001。
由图3～6可知，利福平能够明显抑制HP-PRRSV中N蛋白和N基因的表达，且即使感染时间增长，也具有显著的抑制效果，表明利福平能够明显抑制HP-PRRSV蛋白的表达，抑制病毒的感染。同时，利福平还能显著降低活性病毒颗粒的产生(降低90％以上)，有效抑制HP-PRRSV的增殖。
以上结果表明，利福平具有显著的抗HP-PRRSV病毒作用，能够显著抑制HP-PRRSV感染和增殖。而HP-PRRSV和PRRSV中仅有两种病毒蛋白不同，后续发现利福平抑制HP-PRRSV的作用机制不牵涉这两个蛋白，故可以合理预期利福平对PRRSV同样有抗病毒作用，能有效抑制PRRSV的感染和增殖。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.利福平在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
2.利福平在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
3.利福平在制备治疗由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
4.利福平在制备预防由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
5.利福平在制备抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物中的应用。
6.利福平在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物中的应用。
7.利福平在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的药物中的应用。
8.利福平在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的药物中的应用。
9.利福平在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的药物中的应用。
10.利福平在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的药物中的应用。
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