CN109847063B

CN109847063B - Rsk信号通路抑制剂在抑制沙眼衣原体感染中的应用

Info

Publication number: CN109847063B
Application number: CN201811605134.0A
Authority: CN
Inventors: 薛耀华; 郑和平; 荣知立
Original assignee: Dermatology Hospital Of Southern Medical University Guangdong Provincial Dermatology Hospital Guangdong Skin Disease Prevention Center China Leprosy Control Research Center
Current assignee: Dermatology Hospital Of Southern Medical University Guangdong Provincial Dermatology Hospital Guangdong Skin Disease Prevention Center China Leprosy Control Research Center
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109847063A

Abstract

本发明公开了RSK信号通路抑制剂在抑制沙眼衣原体感染中的应用。本发明研究发现RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308能够抑制沙眼衣原体的感染，且对不同细胞类型、不同血清型衣原体均有效，首次将RSK信号通路抑制剂应用到衣原体感染中，有望成为衣原体靶向宿主治疗的新药物；同时研究还发现，RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308与阿奇霉素联合应用有协同作用，在衣原体感染后LJH685和LJI308能促进阿奇霉素的抗感染作用，对治疗衣原体感染有重要应用价值。本发明为沙眼衣原体感染新药物的开发和寻找辅助宿主治疗的新靶点具有重要的意义。

Description

RSK信号通路抑制剂在抑制沙眼衣原体感染中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及RSK信号通路抑制剂在抑制沙眼衣原体感染中的应用。

背景技术

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）感染严重危害人类生殖健康，是全球范围内流行最广的性传播疾病之一，已成为全球性的公共卫生问题。Ct感染如不及时治疗，可引起严重并发症，如男性附睾炎和前列腺炎，女性宫颈炎、盆腔炎、输卵管炎、异位妊娠和不孕症等；也可通过产道传播，引起新生儿眼结膜炎和肺炎。此外，Ct感染还是人类乳头瘤病毒致宫颈癌的协同因子，以及HIV感染的重要协同因素。因此，Ct感染与广泛传播已成我国乃至全球性的公共卫生问题。

目前Ct感染治疗失败已成为临床上不可忽视的问题。Ct属于原核细胞微生物，由于自身不能产生三磷酸腺苷，必须严格寄生在宿主细胞内，形成类似病毒的独特发育周期。Ct在整个感染过程中，原体(elementary body, EB)和网状体(reticulate body, RB)两种形态交替形成。治疗Ct感染的抗生素主要包括大环内酯类、喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类等。WHO、美国和我国等均推荐阿奇霉素、多西环素为首选治疗药物。但近年来，临床上Ct感染治疗失败的报道越来越多，英国报道16-24岁女性中每年复发感染率为29.9%，美国则达34%。澳大利亚对1116名年轻女性治疗进行随访，三个月后18%治疗女性再次出现 Ct阳性。进一步排除重复感染，Golden 等人发现尽管使用推荐治疗方案且患者治疗期间无性行为，依然有8%患者出现治疗失败。对于直肠Ct感染的队列研究报道阿奇霉素治疗失败率高达22%。因此，Ct感染治疗失败已成为临床上不可忽视的问题。

辅助性靶向宿主治疗策略可能是衣原体治疗的新途径。病原微生物与宿主的相互作用是感染性疾病发生的基础，涉及病原微生物在宿主体内的生存、复制、传播及致病等多个过程。以往传染病的防治主要针对病原，但因基因变异所产生的耐药性等成为临床上治疗传染性疾病面临的严重问题。目前，国际上药物研究开始从靶向病原转为靶向宿主。虽然靶向宿主治疗策略在HIV、结核和真菌感染治疗方面取得了一定进展，但尚未见衣原体感染辅助靶向宿主治疗的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有沙眼衣原体治疗方案的缺陷和不足，提供一种新的治疗靶点，以及新的用药方案。

本发明的目的是提供RSK信号通路抑制剂在抑制衣原体感染方面的应用。

本发明另一目的是提供RSK信号通路抑制剂与阿奇霉素联用在抑制衣原体感染方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明为了探究RSK信号通路抑制剂在沙眼衣原体感染中的作用及机制，主要的研究及成果包括以下内容：

（1）LJH685和LJI308能显著抑制衣原体的感染：培养Hela细胞，接种D型沙眼衣原体，发现LJH685和LJI308能显著抑制衣原体感染，碘染色法和免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少，衣原体的感染率降低。SPG收集培养物复种后，传染性衣原体的数量减少。电镜观察衣原体包涵体变小。

（2）LJH685和LJI308在不同细胞系中的作用相似：建立鼠成纤维McCoy细胞和绿猴肾Vero细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308在不同细胞系中均能抑制衣原体的感染。碘染色法和免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少，衣原体的感染率降低。SPG收集培养物复种后，传染性衣原体的数量减少。

（3）LJH685和LJI308在不同血清型衣原体感染的作用相似：选用E、F和L1血清型沙眼衣原体感染Hela细胞，发现LJH685和LJI308能抑制不同血清型衣原体的感染。碘染色法和免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少，衣原体的感染率降低。SPG收集培养物复种后，传染性衣原体的数量减少。

（4）RSK特异性干扰RNA（siRNA）能抑制衣原体的感染：设计合成RSK特异的siRNA，Western blot检测发现RSK表达降低。碘染色法和免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少，衣原体的感染率降低。SPG收集培养物复种后，传染性衣原体的数量减少。

（5）LJH685和LJI308与阿奇霉素联合使用有协同作用：在衣原体感染后0小时和22小时分别加入LJH685、LJI308、阿奇霉素、LJH685+阿奇霉素、 LJI308+阿奇霉素和DMSO，发现LJH685和LJI308与阿奇霉素有协同作用，衣原体的感染率降低，包涵体变小，数量减少，复种后产生的传染性衣原体的数量减少。

经过大量的研究探索验证，本发明得出如下结论：利用siRNA干扰RSK的表达使得RSK蛋白表达降低，衣原体感染受到抑制；同时研究发现RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308能够抑制沙眼衣原体的感染；首次将RSK信号通路抑制剂应用到衣原体感染中。因此，RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308有望成为衣原体靶向宿主治疗的新药物。另外，研究还发现，RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308与阿奇霉素联合应用有协同作用，对治疗衣原体感染有重要应用价值。

因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

RSK信号通路抑制剂在制备抑制衣原体感染的药物方面的应用。

RSK信号通路抑制剂与阿奇霉素联用在制备抑制衣原体感染的药物方面的应用。

优选地，所述RSK信号通路抑制剂为LJH685和/或LJI308。

优选地，所述衣原体为沙眼衣原体。

另外，基于上述研究，本发明还提供一种抑制衣原体感染的药物，该药物含有RSK信号通路抑制剂。

优选地，所述RSK信号通路抑制剂为LJH685和/或LJI308。

更优选地，所述药物还含有阿奇霉素。

另外，还可包括一种或多种药学上可接受的辅料，制备成不同的剂型。

另外优选地，RSK信号通路抑制剂与阿奇霉素的比例为10～100μM：0.02μg/ml。

具体优选地，抑制剂LJH685：阿奇霉素=60～100μM：0.02μg/ml。

更优选地，抑制剂LJH685：阿奇霉素=80μM：0.02μg/ml。

优选地，抑制剂LJI308：阿奇霉素=10～30μM：0.02μg/ml。

更优选地，抑制剂LJI308：阿奇霉素=20μM：0.02μg/ml。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次将RSK信号通路抑制剂应用到衣原体感染中，研究发现RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308能够抑制沙眼衣原体的感染；而且通过建立鼠成纤维McCoy细胞和绿猴肾Vero细胞衣原体感染模型进行实验发现，LJH685和LJI308在不同细胞类型中能抑制衣原体的感染；此外，选用不同血清型衣原体，如E、F和L1型，发现LJH685和LJI308能抑制不同血清型衣原体的感染。因此，小分子抑制剂LJH685和LJI308有望成为衣原体靶向宿主治疗的新药物。

同时，本发明研究RSK信号通路抑制剂在沙眼衣原体感染中的作用及机制，发现衣原体辅助宿主治疗的新靶点，为衣原体临床治疗的转化奠定基础。

另外，研究还发现，RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308与阿奇霉素联合应用有协同作用，在衣原体感染后0小时和22小时分别加入RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308，能促进阿奇霉素的抗感染作用，对治疗衣原体感染有重要应用价值。

附图说明

图1：LJH685和LJI308抑制D型衣原体感染荧光图。

图2：LJH685和LJI308作用后衣原体感染率降低。

图3：LJH685和LJI308作用后衣原体面积变小。

图4：LJH685和LJI308作用后传染性衣原体的数量减少。

图5：LJH685和LJI308抑制衣原体感染电镜图。

图6：LJH685和LJI308抑制衣原体感染有时间效应。

图7：LJH685和LJI308在McCoy细胞系中的作用。

图8：LJH685和LJI308在McCoy细胞作用后衣原体感染率降低。

图9：LJH685和LJI308在McCoy细胞作用后包涵体面积变小。

图10：LJH685和LJI308在McCoy细胞作用后传染性衣原体数量减少。

图11：LJH685和LJI308在Vero细胞系中的作用。

图12：LJH685和LJI308在Vero细胞作用后衣原体感染率降低。

图13：LJH685和LJI308在Vero细胞作用后包涵体面积变小。

图14：LJH685和LJI308在Vero细胞作用后传染性衣原体数量减少。

图15：LJH685和LJI308在L1型衣原体感染中的作用。

图16：LJH685和LJI308在F型衣原体感染中的作用。

图17：RSK siRNA作用后Western blot检测RSK蛋白的表达。

图18：RSK siRNA 干扰衣原体感染荧光图。

图19：RSK siRNA作用后衣原体感染率降低。

图20：RSK siRNA作用后包涵体面积变小。

图21：RSK siRNA作用后传染性衣原体的数量减少。

图22：LJH685和LJI308与阿奇霉素联合使用有协同作用。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明利用衣原体感染细胞模型研究发现了RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308能显著抑制衣原体的感染，二者与阿奇霉素联合使用具有协同作用。建立鼠成纤维McCoy细胞和绿猴肾Vero细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308在不同细胞类型中能抑制衣原体的感染。选用E、F和L1血清型沙眼衣原体感染Hela细胞，发现LJH685和LJI308能抑制不同血清型衣原体的感染。设计合成特异的siRNA干扰RSK的表达，能够抑制衣原体感染。RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308有可能成为衣原体靶向宿主治疗的药物，对治疗衣原体感染有重要应用价值。具体研究如下实施例所述。

实施例1 LJH685和LJI308抑制衣原体的感染

本实施例的目的是明确RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308在衣原体感染中的作用。培养Hela细胞，接种D型沙眼衣原体。同时设置阳性和阴性对照。将已接种标本的24孔培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，实验组分别加入80μM的LJH685和20μM LJI308，5%CO₂、35℃恒温湿度的条件下培养48h，然后观察结果。碘染色法和免疫荧光法倒置显微镜下观察衣原体包涵体。随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集80μM的LJH685和20μM LJI308作用的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色观察包涵体，计数传染性衣原体的数量。具体实验方法和结果如下：

1、实验方法：

1.1接种衣原体：从-70℃取出冻存Hela细胞，37℃速溶，在含10%新生牛血清的DMEM培养基，5%CO₂、35℃的条件下培养，待细胞生长成致密单层，胰蛋白酶消化传代。Hela细胞铺24孔板，加入爬片，每孔1×10⁵细胞，待细胞生长成单层，接种衣原体。从-70℃取出衣原体菌株，在旋涡振荡器上振荡30sec，无菌条件下将内容物移至单层细胞培养板中。同时设置阳性和阴性对照。将已接种标本的24孔培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，实验组分别加入80μM LJH685和20μM LJI308，5%CO₂、35℃恒温湿度的条件下培养48h，然后观察结果。

1.2碘染色：吸去培养孔中的分离培养基，加入0.2 ml甲醇固定10min，弃去甲醇，加入0.2 ml卢格氏碘液，染色15min。倒置显微镜下观察衣原体包涵体。

1.3直接免疫荧光法：首先弃去细胞培养液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定细胞20min后，PBS漂洗3次；Triton 100作用细胞15分钟，PBS漂洗3次，取出爬片。加荧光标记的MOMP单克隆抗体，37℃下孵育30min，PBS漂洗3次；DAPI染色10分钟，PBS漂洗3次，晾干，封片剂封片，荧光显微镜下观察结果。

1.4 确定衣原体感染率：随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。

1.5 确定传染性衣原体的数量：在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集80μM LJH685和20μM LJI308作用的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色观察包涵体，计数传染性衣原体的数量。

2、实验结果如图1-6：

图1：LJH685和LJI308抑制D型衣原体感染荧光图。D型沙眼衣原体感染Hela细胞，FITC荧光标记MOMP抗体，包涵体为黄绿色荧光。阳性对照组可见较多绿色荧光的大包涵体，LJH685和LJI308作用组，包涵体的数量减少，包涵体变小。

图2：LJH685和LJI308作用后衣原体感染率降低。衣原体感染后0小时加入80μMLJH685和20μM LJI308，作用至48小时，免疫荧光显微镜下观察衣原体包涵体。随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。LJH685和LJI308作用组，衣原体的感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图3：LJH685和LJI308作用后衣原体面积变小。衣原体感染后0小时加入80μMLJH685和20μM LJI308，作用至48小时，免疫荧光显微镜下观察衣原体包涵体。每组随机计算60个包涵体面积， LJH685和LJI308作用组衣原体的面积变小，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图4：LJH685和LJI308作用后传染性衣原体的数量减少。衣原体感染后0小时加入80μM LJH685和20μM LJI308，作用至48小时，SPG收集。复种新鲜的单层Hela细胞，培养至48小时，计数包涵体数量。LJH685和LJI308作用组，复活的传染性衣原体数量减少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图5：LJH685和LJI308抑制衣原体感染电镜图。衣原体感染后0小时加入80μMLJH685和20μM LJI308，作用至48小时，PBS漂洗3次，电镜保存液固定，静置4小时。透射电子显微镜观察，LJH685和LJI308作用组衣原体包涵体变小，LJH685和LJI308内可见异型包涵体，放大倍数为6000倍，标尺为2μm。

图6：LJH685和LJI308抑制衣原体感染有时间效应。 (a) 在感染后0h, 6h, 12h,18h和24h分别加入LJH685，抑制剂LJH685加入时间越早，D型沙眼衣原体感染率越低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。(b) 在感染后0h, 6h, 12h, 18h和24h分别加入LJI308，抑制剂LJI308加入时间越早，D型沙眼衣原体感染率越低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

结果显示，80μM LJH685和20μM LJI308能抑制衣原体的感染，衣原体的感染率降低，包涵体的数量减少，包涵体变小，衣原体复活数量减少，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

实施例2 LJH685和LJI308在不同细胞系中的作用相似

本实施例的目的是明确LJH685和LJI308在不同细胞中的作用。培养鼠成纤维McCoy细胞和绿猴肾Vero细胞，接种D型沙眼衣原体。同时设置阳性和阴性对照。将已接种标本的24孔培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，实验组分别加入40μM的LJH685和20μM LJI308，5%CO₂、35℃恒温湿度的条件下培养48h，然后观察结果。碘染色法和免疫荧光法倒置显微镜下观察衣原体包涵体。随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集80μM的LJH685和20μM LJI308作用的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色观察包涵体，计数传染性衣原体的数量。具体实验方法和结果如下：

1、实验方法：

1.1接种衣原体：从-70℃取出冻存McCoy细胞和Vero细胞，37℃速溶，在含10%新生牛血清的DMEM培养基，5%CO₂、35℃的条件下培养，待细胞生长成致密单层，胰蛋白酶消化传代。McCoy细胞和Vero细胞铺24孔板，加入爬片，每孔1×10⁵细胞，待细胞生长成单层，接种衣原体。从-70℃取出衣原体菌株，在旋涡振荡器上振荡30sec，无菌条件下将内容物移至单层细胞培养板中。同时设置阳性和阴性对照。将已接种标本的24孔培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，McCoy细胞和Vero细胞实验组分别加入80μM LJH685和20μM LJI308，5%CO₂、35℃恒温湿度的条件下培养48h，然后观察结果。

1.2免疫荧光观察：弃去细胞培养液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定细胞20min后，PBS漂洗3次；Triton 100作用细胞15分钟，PBS漂洗3次，取出爬片。加荧光标记的MOMP单克隆抗体，37℃下孵育30min，PBS漂洗3次；DAPI染色10分钟，PBS漂洗3次，晾干，封片剂封片，荧光显微镜下观察结果。

1.3确定衣原体感染率：随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。

1.4 确定传染性衣原体的数量：在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集80μM LJH685和20μM LJI308作用的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色观察包涵体，计数传染性衣原体的数量。

2、实验结果如图7-14：

图7：LJH685和LJI308在McCoy细胞系中的作用。建立鼠成纤维McCoy细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308在McCoy细胞中能抑制衣原体感染。免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少。

图8：LJH685和LJI308在McCoy细胞作用后衣原体感染率降低。建立鼠成纤维McCoy细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308作用后，免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少，衣原体的感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图9：LJH685和LJI308在McCoy细胞作用后包涵体面积变小。建立鼠成纤维McCoy细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308作用后包涵体面积变小，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图10：LJH685和LJI308在McCoy细胞作用后传染性衣原体数量减少。建立鼠成纤维McCoy细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308作用后，SPG收集培养物复种后，传染性衣原体的数量减少, 与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图11：LJH685和LJI308在Vero细胞系中的作用。建立鼠成纤维Vero细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308在Vero细胞中能抑制衣原体的感染。免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少。

图12：LJH685和LJI308在Vero细胞作用后衣原体感染率降低。建立鼠成纤维Vero细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308作用后，免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少，衣原体的感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图13：LJH685和LJI308在Vero细胞作用后包涵体面积变小。建立绿猴肾Vero细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308作用后包涵体面积变小, 与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图14：LJH685和LJI308在Vero细胞作用后传染性衣原体数量减少。建立鼠成纤维McCoy细胞衣原体感染模型，发现LJH685和LJI308作用后，SPG收集培养物复种，传染性衣原体的数量减少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

结果显示，LJH685和LJI308能抑制衣原体的感染，衣原体的感染率降低，包涵体的数量减少，包涵体变小，衣原体复活数量减少，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

实施例3 LJH685和LJI308在不同血清型衣原体感染的作用相似

本实施例的目的是明确LJH685和LJI308在不同血清型衣原体感染中的作用。具体实验方法和结果如下：

1、实验方法：

培养Hela细胞，接种沙眼衣原体。碘染色法和免疫荧光法倒置显微镜下观察衣原体包涵体，计算衣原体的感染率，复种沙眼衣原体，计数传染性衣原体的数量。

2、实验结果：

结果如图15-16：

图15：LJH685和LJI308在L1型衣原体感染中的作用：选用L1血清型沙眼衣原体感染Hela细胞，发现LJH685和LJI308能抑制L1血清型衣原体的感染。免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少。

图16：LJH685和LJI308在F型衣原体感染中的作用：选用F血清型沙眼衣原体感染Hela细胞，发现LJH685和LJI308能抑制F血清型衣原体的感染。免疫荧光法观察发现衣原体包涵体变小，数量减少。

实施例4 RSK siRNA抑制衣原体的感染

本实施例的目的是明确RSK特异性干扰RNA（siRNA）的作用。设计合成RSK特异的siRNA，在衣原体感染后0小时加入，作用至24小时，更换普通分离液，继续培养至48小时，Western blot 检测RSK蛋白的表达，碘染色法和免疫荧光法倒置显微镜下观察衣原体包涵体，计算衣原体的感染率，复种沙眼衣原体，计数传染性衣原体的数量。具体实验方法和结果如下：

1、实验方法：

1.1 设计RSK特异性干扰RNA：从GeneCards网站搜索RSP6KA1(RSK1)基因序列，委托广州锐博生物公司合成3条RSK siRNA。冻干粉瞬时离心，用RNase free Water 配制成20μM 储存液，分装保存于-20℃～-80℃。

1.2接种衣原体：24孔板培养单层Hela细胞，接种衣原体，1500g条件下离心1h。

1.3 RSK siRNA作用：

1.3.1准备无RNA酶的枪头。取250μl opti-MEM和5μl RNAi MAX混合，静置5分钟。

1.3.2取250μl opti-MEM和5μl 20Um siRNA混合，静置5分钟。

1.3.3然后将上述液体混合，静置20分钟。

1.3.4将上述500μl的混合液，分成3份，每孔160μl ，再加入320μl的不含抗生素不含胎牛的DMEM，5%CO₂、35℃恒温湿度的条件下培养24小时，弃去培养液，更换不含抗生素不含胎牛的DMEM继续培养48h，荧光观察结果。

1.4 Western blot检测RSK蛋白的表达：

1.4.1取siRNA作用后培养至48小时的细胞，采用PBS反复洗涤三次，细胞裂解液80µl加入还原型5×SDS上样缓冲液20 µl。沸水浴10 min，10,000 rpm离心5 min后吸取上清各20 µl进行10% SDS-PAGE 电泳。

1.4.2电泳后取分离胶转膜，转PVDF膜后采用10%脱脂奶粉封闭2 h。

1.4.3采用RSK1抗体孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min。

1.4.4孵育HRP标记的二抗，37℃ 孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min。之后凝胶成像仪曝光。

2、实验结果如图17-21：

图17：RSK siRNA作用后Western blot检测RSK蛋白的表达：衣原体感染后0小时加入RSK1特异的siRNA，作用24小时后继续培养至48小时，Western blot检测RSK蛋白表达降低。

图18：RSK siRNA 干扰衣原体感染荧光图。D型沙眼衣原体感染Hela细胞后0小时加入2条RSK1特异的siRNA，FITC荧光标记MOMP抗体，包涵体为黄绿色荧光。阳性对照组可见较多绿色荧光的大包涵体，RSK特异性干扰RNA作用后，包涵体的数量减少，包涵体变小。

图19：RSK siRNA作用后衣原体感染率降低。衣原体感染后0小时加入RSK1特异的siRNA，作用至48小时，免疫荧光显微镜下观察衣原体包涵体。随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。2条RSK1特异的siRNA作用后，衣原体的感染率降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图20：RSK siRNA作用后包涵体面积变小。D型沙眼衣原体感染Hela细胞后0小时加入2条RSK1特异的siRNA，发现siRNA作用后包涵体面积变小，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

图21：RSK siRNA作用后传染性衣原体的数量减少。衣原体感染后0小时加入RSK1特异的siRNA，作用至48小时，SPG收集。复种新鲜的单层Hela细胞，培养至48小时，计数包涵体数量。siRNA作用组，复活的传染性衣原体数量减少，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

结果显示，免疫荧光观察发现衣原体包涵体变小，数量减少，衣原体的感染率降低。SPG收集培养物复种后，传染性衣原体的数量减少。

实施例5 LJH685和LJI308与阿奇霉素联合使用有协同作用

本实施例的目的是明确LJH685和LJI308与阿奇霉素联合使用的效果。培养Hela细胞，接种D型沙眼衣原体。在衣原体感染后0小时和22小时分别加入RSK信号通路抑制剂LJH685和LJI308，观察衣原体包涵体数量，计算衣原体的感染率。复种衣原体，计数传染性衣原体的数量。具体实验方法和结果如下：

1、实验方法：

1.1接种衣原体：准备单层Hela细胞和衣原体，接种衣原体的24孔细胞培养板在35℃、1500g条件下离心1h。离心完毕，吸去所有接种的样本液，每孔更换含1μg/ml放线菌酮的DMEM培养基，实验组分别加入80μM LJH685、20μM LJI308、0.02μg/ml阿奇霉素、80μMLJH685+0.02μg/ml阿奇霉素、20μM LJI308+0.02μg/ml阿奇霉素，同时设置阳性和阴性对照，5%CO₂、35℃的条件下培养48h，然后荧光染色观察包涵体的数量和大小等改变。

1.2 确定衣原体感染率：随机计数20个400倍视野，计算衣原体的感染率。

1.3确定传染性衣原体的数量：在感染后48小时，每孔1毫升SPG收集实验组的细胞，-70℃冻存后复融，接种新鲜的单层细胞，荧光染色包涵体，确定传染性衣原体的数量。

2、实验结果：

在感染后0小时加入LJH685、LJI308、阿奇霉素、LJH685+阿奇霉素、LJI308+阿奇霉素和DMSO对照，培养至48h，观察衣原体的感染率，包涵体的数量，包涵体大小，复种后产生的传染性衣原体的数量；A：阳性对照；B：0.02μg/ml阿奇霉素处理；C：80μM LJH685处理；D：20μM LJI308处理；E：0.02μg/ml阿奇霉素+80μM LJH685处理；F：0.02μg/ml阿奇霉素+20μMLJI308处理。结果如图22所示，本研究发现LJH685、LJI308与阿奇霉素具有协同作用，小分子抑制剂与抗生素联合使用抑制效果更强。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.RSK信号通路抑制剂在制备抑制沙眼衣原体感染的药物方面的应用；所述RSK信号通路抑制剂为LJH685和/或LJI308。

2.RSK信号通路抑制剂与阿奇霉素联用在制备抑制沙眼衣原体感染的药物方面的应用；所述RSK信号通路抑制剂为LJH685和/或LJI308。

3.一种抑制沙眼衣原体感染的药物，其特征在于，由RSK信号通路抑制剂、阿奇霉素和一种或多种药学上可接受的辅料组成；所述RSK信号通路抑制剂与阿奇霉素的比例为10～100μM：0.02μg/mL；所述RSK信号通路抑制剂为LJH685和/或LJI308。