CN113952383B - 椿乳凝胶在防治hpv感染和菌群失调所致宫颈癌变中的应用 - Google Patents

椿乳凝胶在防治hpv感染和菌群失调所致宫颈癌变中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了椿乳凝胶在防治HPV感染和菌群失调所致宫颈癌变中的应用。本发明研究发现，椿乳凝胶能够抑制可引起细胞癌变的HPV18E6/E7蛋白的表达，诱导含有HPV18基因的细胞凋亡，杀灭含有HPV18基因的病变细胞，清除已经产生病理性变化的阴道组织，促进正常宫颈上皮细胞的增殖，修复受损的阴道组织。同时椿乳凝胶对引起阴道菌群失调的加德纳菌和白色念珠菌具有较好的抑制作用，可恢复阴道菌群的平衡。椿乳凝胶能够显著抑制HPV感染和加德纳菌与白色念珠菌感染，并抑制HPV感染和加德纳菌与白色念珠菌感染所致的宫颈细胞异常癌变，降低由HPV感染和阴道菌群失调引起的宫颈炎症向宫颈癌发展的可能性。

Description

椿乳凝胶在防治HPV感染和菌群失调所致宫颈癌变中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及椿乳凝胶在防治人乳头瘤病毒(HPV)感染和菌群失调引起的宫颈炎症及宫颈癌变中的应用。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，近年来其发病有年轻化的趋势。
相关研究表明，人乳头瘤病毒(HPV)长时间持续感染，尤其是HPV16、HPV18等黏膜高危致癌性的病毒，一定程度上增加了宫颈上皮的瘤变，也提高了宫颈癌症的发生率，HPV16和HPV18与世界上70％-76％的宫颈癌相关。
同时，加德纳菌等引起宫颈炎症，也是常见妇科宫颈病变疾病之一。且研究显示，加德纳菌等条件致病菌所引起的黏液脓性宫颈炎会增加HPV的感染风险，进一步提高了宫颈癌症的发生风险。
HPV感染和加德纳菌等菌群失调都是造成宫颈癌症发生的重要因素，且临床中两者同时感染的情况大有所在，病况及机理情况更为复杂。而目前的药物多是分别关注抑制HPV感染，或抑菌和调节菌群失调，对两者共同感染发展为宫颈癌的防治药物报道较少。
发明内容
本发明旨在寻找能够同时具有抑制HPV感染和调控加德纳菌所致菌群失调的作用，对由HPV感染和加德纳菌等菌群失调所致的宫颈癌症的防控具有重要的意义。
本发明的目的是提供椿乳凝胶在制备防治HPV感染和/或菌群失调共同引起的宫颈癌的药物中的应用。
本发明的目的是提供椿乳凝胶在制备能够修复受损宫颈组织的药物中的应用，尤其是指由HPV感染和/或宫颈炎条件致病菌感染所致受损的宫颈组织。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
椿乳凝胶的处方组成为：椿皮、苦参、牡丹皮、乳香、冰片五味药。具有清热燥湿，祛瘀生肌的功效，其功能主治为湿热淤阻型慢性宫颈炎。临床药理学研究报道：该方具有抗炎、活血化瘀、收敛消肿的功效，能促进正常鳞状上皮细胞再生，能够消除病因，清除局部感染及坏死组织，促进正常宫颈细胞的修复再生。
本发明研究发现，椿乳凝胶对加德纳菌和白色念珠菌具有很好的抑菌作用，对HPV感染所致的宫颈上皮细胞损伤具有修复作用，对人宫颈癌细胞内HPV有明显的清除作用。在由HPV感染和加德纳菌等菌群失调共同所致的宫颈癌变的防控方面具有很重要的应用价值。因此，要求保护以下应用：
椿乳凝胶主药组合物在制备能够防治HPV感染和/或其所致宫颈癌的药物中的应用。
所述防治HPV感染包括对HPV的清除作用、对癌细胞的凋亡作用。
椿乳凝胶主药组合物在制备能够抑制宫颈炎条件致病菌和/或菌群失调所致宫颈癌变的药物中的应用。
椿乳凝胶主药组合物在制备能够修复受损宫颈组织的药物中的应用。优选地，所述受损宫颈组织是由HPV感染和/或宫颈炎条件致病菌感染所致受损的宫颈组织。优选地，所述受损宫颈组织为受损宫颈上皮细胞。
椿乳凝胶可抑制CaSki和Hela细胞增殖，调节HPV16/18 E6/E7蛋白表达，促进CaSki和Hela细胞凋亡，调节H8细胞周期；可抑制宫颈炎菌群失衡中的条件致病菌，两种机制作用下共同修复受损宫颈组织，促进受损宫颈上皮细胞的更新。
椿乳凝胶主药组合物在制备能够防治HPV感染和菌群失调共同作用所致宫颈癌的药物中的应用。
椿乳凝胶主药组合物在制备能够抑制HPV感染和菌群失调共同作用所致宫颈细胞异常或癌变的药物中的应用。
其中，具体优选地，所述HPV为HPV16或HPV18。
具体优选地，所述致病菌为加德纳菌和/或白色念珠菌。
具体优选地，所述菌群失调是指加德纳菌和/或白色念珠菌感染所致菌群失调。
具体地，所述宫颈癌细胞为人宫颈癌细胞CaSki或人宫颈癌细胞Hela。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究发现，椿乳凝胶能够抑制可引起细胞癌变的HPV18 E6/E7蛋白的表达，诱导含有HPV18基因的细胞凋亡，杀灭含有HPV18基因的病变细胞，清除已经产生病理性变化的阴道组织，促进正常宫颈上皮细胞的增殖，修复受损的阴道组织。同时椿乳凝胶对引起阴道菌群失调的加德纳菌和白色念珠菌具有较好的抑制作用，可恢复阴道菌群的平衡。椿乳凝胶能够显著抑制HPV感染，并抑制HPV感染和加德纳菌与白色念珠菌感染共同所致的宫颈细胞异常癌变，降低由HPV感染和阴道菌群失调引起的宫颈炎症向宫颈癌发展的可能性。
附图说明
图1为椿乳凝胶对加德纳菌和白色念珠菌的抑制作用。
图2为椿乳凝胶对人宫颈上皮细胞H8周期的影响。
图3为椿乳凝胶对人宫颈癌细胞CaSki凋亡的影响。
图4为椿乳凝胶对人宫颈癌细胞Hela凋亡的影响。
图5为椿乳凝胶对HPV E6/E7蛋白表达的影响；图a、b分别代表携带有HPV16基因的CaSki细胞和携带有HPV18基因的Hela细胞。
图6为椿乳凝胶对HPV E6/E7的蛋白表达影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所用材料：
受试物：椿乳凝胶(chunruningjiao)，规格4g/支，批号：20180804，生产日期：2018.08.28，有效期至2021.01，由株洲千金药业股份有限公司提供。阳性对照药：西多福韦(cidofovir，CDV)，批号：20171125，由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。
细胞及菌株：人宫颈上皮细胞H8、人宫颈癌细胞CaSki(HPV 16阳性)、人宫颈癌细胞Hela(HPV 18阳性)，均购自于豪地华拓生物科技有限公司。加德纳菌(GV-10-1)和白色念珠菌，来自于北京北纳创联生物技术研究院。
主要试剂：高糖DMEM培养基(HyClone公司，批号AB10201637)；胎牛血清(Sciencell公司，批号：M048-6)；CCK-8(Bimake公司，批号：B34304)；HPV16 E6抗体/HPV18E6抗体(Abcam公司，批号：GR247586-18)、HPV16 E7抗体(Abcam公司，批号：GR264171-1)、HPV18 E7抗体(Abcam公司，批号：GR241906-1)；HEPES(Sigma公司，批号：SLBQ1006V)；
Figure BDA0002294387340000031
蛋白胨(BD公司，批号：6060563)；新鲜酵母提取物(GIBCO公司，批号：1819083)；马血清(Solarbio公司，批号：912I051)；沙氏葡萄糖液体培养基(青岛海博生物技术有限公司，批号：20150921)。
主要仪器：3111型CO2培养箱，美国Thermo公司；DMIL型倒置显微镜，德国Leica公司；MR-96A型酶标仪，深圳迈瑞公司；CJ-1F型医用净化工作台，苏州冯氏实验动物设备有限公司；Accuri C6型流式细胞仪，美国BD公司；PowerPacTM Basic型电泳仪，美国Bio-Rad公司；BSCIIB2-1101型生物安全柜，上海瑞仰净化装备有限公司；SPX-250B型生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司。
以下实施例中所用统计学分析方法为：采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理，计量资料以
Figure BDA0002294387340000041
表示，两样本均数的比较采用Student T-Test检验，多样本组间均数的比较采用One-way ANOVA检验，P<0.05表示有统计学意义，P<0.01表示所检验的差别有非常显著性意义。
实施例1椿乳凝胶对加德纳菌和白色念珠菌的抑制作用
一、实验方法
1、菌株培养
取冻存的加德纳菌或白色念珠菌，水浴融化后接种至9ml相应液体培养基试管内并混匀，同时制备一管不加菌液的培养基作为阴性对照管，硅胶塞封口后，将试管置于合适条件下培养24～48h，分别将加德纳菌或白色念珠菌用相应培养液配制成浓度为1×107CFU/ml的菌液，备用。
2、最小抑菌浓度(MIC)测定
将椿乳凝胶配制为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9mg/ml浓度的混悬液，将西多福韦配制成1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8μg/ml浓度的溶液，各组浓度药液均放置在试管中。每管中药液为1.8ml，各管中加入1×107CFU/ml加德纳菌或白色念珠菌悬液200μL，用透气硅胶塞塞好试管，同时设置空白对照组(菌液中加入培养基作为对照)、阳性对照组(培养液中不加菌液)。将各管适宜条件下培养48h，观察无细菌生长的浓度，即为最小抑菌浓度(MIC)，在肉眼观察后，将培养液摇晃均匀，取100μl上层液体，均匀涂布至相应平板上，进行加德纳菌或白色念珠菌的活菌计数。
二、实验结果
椿乳凝胶对加德纳菌和白色念珠菌最小抑菌浓度的影响：量取连续倍比稀释的椿乳凝胶药液或西多福韦与稀释菌液恒温培养，镜下观察测定椿乳凝胶或西多福韦对不同菌株的最小抑菌浓度。结果如图1和表1。
表1
Figure BDA0002294387340000051
注：“+”表示菌生长，无抑菌作用；“+/-”表示抑菌作用弱；“-”表示菌不生长，有抑菌作用。
结果显示，椿乳凝胶有效成分中含有抑菌成分。椿乳凝胶对加德纳菌和白色念珠菌均有不同程度的抑菌作用，椿乳凝胶对加德纳菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度分别为62.5mg/ml、125mg/ml。西多福韦对加德纳菌和白色念珠菌均无明显抑菌作用。
实施例2椿乳凝胶对HPV的清除作用
一、实验方法
1、细胞培养
将人宫颈上皮细胞H8、人宫颈癌细胞CaSki、人宫颈癌细胞Hela复苏后接种于5mlDMEM完全培养基中，转移至25cm2的培养瓶中，37℃、5％CO2培养至对数生长期后备用。
2、CCK-8法检测细胞存活率
取对数期生长的H8、CaSki、Hela细胞，分别以每孔5×103个细胞接种于96孔细胞培养板中，设置溶媒对照组、椿乳凝胶最大溶解度10mg/ml为最高浓度，以接近
Figure BDA0002294387340000061
为梯度差下设5个浓度：3、1、0.3、0.1、0.03mg/ml，同时设置西多福韦(3、10、30、100、300、1000μg/ml)作为阳性对照组，每组6个复孔。采用CCK-8法测定细胞存活情况。细胞存活率≥80％，则认为对细胞无毒性作用，记为TC0，以H8细胞TC0、1/2TC0、1/4TC0进行后续试验的浓度。
3、流式细胞术检测人宫颈上皮细胞周期
取已对数生长期的H8细胞，以5×105/孔的密度接种至6孔板中，待细胞贴壁后，设置溶媒对照组、椿乳凝胶组(TC0、1/2TC0、1/4TC0)，阳性对照组，每组6个复孔。24h后，常规消化收集细胞，用70％冷乙醇固定过夜，加5μl的PI，室温避光孵育30min，用流式细胞仪检测细胞周期。
4、流式细胞术检测宫颈癌细胞凋亡
取对数生长期的CaSki和Hela细胞，以5×105/孔的密度接种至6孔板中，待细胞贴壁后，设置溶媒对照组、椿乳凝胶组(TC0、1/2TC0、1/4TC0)，阳性对照组，每组6个复孔。24h后，收集细胞，加入500μl Binding Buffer缓冲液重悬细胞，加入5μl的Annexin V-FITC、5μl的PI，在室温避光条件下孵育15min，用流式细胞仪检测凋亡情况。
5、HPV16 E6/E7蛋白、HPV18 E6/E7蛋白表达检测
细胞处理方法同步骤4，处理24h后分别提取各孔总蛋白，用Western Blot法检测E6/E7蛋白表达。
二、实验结果
1、椿乳凝胶对H8、CaSki和Hela细胞增殖的影响
H8、CaSki和Hela细胞给予不同浓度的椿乳凝胶后，镜下观察，H8和CaSki细胞形态学未出现明显变化，细胞增殖未受到明显影响，细胞增殖抑制率均<20％。Hela细胞高浓度出现增殖速度减慢，细胞碎片增多、细胞间的间隙增大、部分细胞呈空泡状等现象。且Hela细胞状态与椿乳凝胶浓度有明确相关性，在10mg/ml浓度条件下可见较多无法维持完整细胞形态。经Bliss法计算，得出椿乳凝胶对Hela细胞的IC50＝47.558mg/ml，从表2可知3<IC50<10mg/ml，TC0>3mg/ml，西多福韦对CaSki和Hela细胞的IC50分别为181.100和395.196μg/ml。因此，设置椿乳凝胶终浓度设置为5、2.5、1.25mg/ml，西多福韦终浓度为100、50、25μg/ml。
表2各组H8、CaSki、Hela细胞的增殖
Figure BDA0002294387340000071
注：IC50表示对细胞的半数抑制率浓度，Emax表示对细胞的最大抑制率，椿乳凝胶和西多福韦IC50单位分别为mg/ml，μg/ml。
2、椿乳凝胶对人宫颈上皮细胞周期的影响
采用不同浓度的椿乳凝胶或西多福韦处理H8细胞24h后，细胞周期分析结果显示：在G0/G1细胞比例明显减少，S期细胞比例增加，G2/M期细胞比例明显增加，表明其对宫颈上皮细胞的修复作用可能是通过减少间期休眠的细胞，促进其进入G2/M期，促进细胞分裂，从而加速受损上皮细胞的更新。详见表3。图2为各组人宫颈上皮细胞H8的周期。
表3各组人宫颈上皮细胞H8的周期
Figure BDA0002294387340000072
Figure BDA0002294387340000073
Figure BDA0002294387340000081
注：表示与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
3、椿乳凝胶对宫颈癌细胞凋亡的影响
采用不同浓度的椿乳凝胶或西多福韦处理宫颈癌细胞24h后，凋亡结果分析显示：椿乳凝胶组5mg/ml时CaSki细胞凋亡及坏死细胞数与溶媒对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，而椿乳凝胶组2.5mg/kg时对Hela细胞凋亡及坏死细胞数与溶媒对照组相比无显著性差异(P>0.05)；椿乳凝胶2.5mg/ml时Hela细胞早期凋亡及晚期凋亡细胞数与溶媒对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，椿乳凝胶5mg/ml时，Hela细胞各期凋亡细胞与溶媒对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。西多福韦各浓度组时CaSki和Hela细胞早期、晚期凋亡及坏死细胞数与溶媒对照组相比具有明显差异(P<0.05)，且具有浓度-效应关系。详见表4和图3、4。
表4各组人宫颈癌细胞CaSki、Hela的凋亡
Figure BDA0002294387340000082
Figure BDA0002294387340000083
注：表示与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
4、椿乳凝胶对HPV16 E6/E7、HPV18 E6/E7蛋白表达的影响
在给予不同剂量的椿乳凝胶后，分别从CaSki和Hela细胞提取的总蛋白中HPV16E6/E7和HPV18 E6/E7蛋白表达均下调，表明椿乳凝胶清除HPV与下调E6/E7蛋白有关，且下调HPV18 E6/E7蛋白比下调HPV16 E6/E7蛋白表达更为明显。结果详见图5、图6和表5。
表5椿乳凝胶对E6/E7mRNA表达的影响
Figure BDA0002294387340000091
实施例3椿乳凝胶抑制HPV感染和加德纳菌/白色念珠菌感染共同所致宫颈炎发展为宫颈癌
一、动物模型：
(1)模型I组：
SD大鼠，雌性，体重220g-260g。120只。
造模用药：0.2ml 25％苯酚胶浆。
给药方式：用注射器将药物轻轻注入SD大鼠阴道深处1cm处，每3天给药1次，共5次；至大鼠阴道口出现红肿或有脓性物流出，同时显微镜观察到变性坏死或脱落形成溃疡，以及黏膜下的病变，包括充血水肿、炎细胞浸润、脓肿及炎性肉芽组织或纤维增生，为造模成功。
(2)模型II组：
SD大鼠，雌性，体重220g-260g。120只。
造模用药：制备加德纳菌感受态细胞，进行含HPV18的质粒的转化，再用加德纳菌感受态细胞和白色念珠菌共培养混合液，感染大鼠。其中HPV18质粒抽提液的体积及浓度为0.1ml，200pmol/L，加德纳菌感受态细胞和白色念珠菌共培养混合液的体积为0.1ml。
给药方式：同上。
二、治疗方案
治疗用药：两种动物模型分别随机分为三组，实验组给药椿乳凝胶，对照组给药生理盐水，阳性对照组给药止带消糜栓(市购)。
给药方式：阴道给药。用注射器将药物送入大鼠阴道深处，每日一次，持续两个月为一个疗程；共五个疗程。
三、结果测试
采用TCT检测的方式，观察各组模型大鼠宫颈细胞是否发生癌变或癌前病变(异常)，并进行HPV病毒的分子检测，统计HPV感染率和宫颈细胞癌变率。
表6各组大鼠HPV感染率和宫颈细胞异常癌变率
Figure BDA0002294387340000101
结果显示，椿乳凝胶能够显著抑制HPV感染，并抑制HPV感染和加德纳菌菌与白色念珠菌感染共同所致的宫颈细胞异常癌变。
综上所述，椿乳凝胶能够抑制可引起细胞癌变的HPV18 E6/E7蛋白的表达，从而诱导含有HPV18基因的细胞凋亡，杀灭含有HPV18基因的病变细胞，清除已经产生病理性变化的阴道组织，促进正常宫颈上皮细胞的增殖，修复受损的阴道组织。同时椿乳凝胶对引起阴道菌群失调的加德纳菌和白色念珠菌具有较好的抑制作用，可恢复阴道菌群的平衡。椿乳凝胶对HPV18的抑制作用和对阴道菌群的调节作用，可协同降低由HPV感染和阴道菌群失调引起的宫颈炎症向宫颈癌发展的可能性，因此在治疗HPV感染和调节阴道菌群方面具有良好疗效，值得推荐用于HPV及阴道菌群失调共同引起的宫颈炎及预防向宫颈癌发展。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.中药组合物在制备能够防治HPV感染和/或其所致宫颈癌的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述HPV为HPV16或HPV18。
2.中药组合物在制备能够抑制宫颈炎条件致病菌感染的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述致病菌为加德纳菌或加德纳菌和白色念珠菌。
3.中药组合物在制备能够抑制HPV感染的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述HPV为HPV16或HPV18。
4.中药组合物在制备能够抑制宫颈炎条件致病菌和HPV感染的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述致病菌为加德纳菌和/或白色念珠菌，所述HPV为HPV16或HPV18。
5.中药组合物在制备能够修复受损宫颈组织的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述受损宫颈组织是由HPV感染所致受损的宫颈组织；所述HPV为HPV16或HPV18。
6.中药组合物在制备能够修复受损宫颈组织的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述受损宫颈组织是由宫颈炎条件致病菌感染所致受损的宫颈组织；所述致病菌为加德纳菌或加德纳菌和白色念珠菌。
7.中药组合物在制备能够修复受损宫颈组织的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述受损宫颈组织是由HPV感染和宫颈炎条件致病菌感染所致受损的宫颈组织；所述HPV为HPV16或HPV18，所述致病菌为加德纳菌和/或白色念珠菌。
8.中药组合物在制备能够防治HPV感染和菌群失调共同作用所致宫颈癌的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述HPV为HPV16或HPV18，所述菌群失调是指加德纳菌和/或白色念珠菌感染所致菌群失调。
9.中药组合物在制备能够抑制HPV感染和菌群失调共同作用所致宫颈细胞异常或癌变的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的有效成分为椿皮、苦参、牡丹皮、乳香和冰片，所述中药组合物为椿乳凝胶；所述HPV为HPV16或HPV18，所述菌群失调是指加德纳菌和/或白色念珠菌感染所致菌群失调。
10.根据权利要求5～7任一所述应用，其特征在于，所述受损宫颈组织为受损宫颈上皮细胞。
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