CN101928782B

CN101928782B - 同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物和试剂盒

Info

Publication number: CN101928782B
Application number: CN2009102340261A
Authority: CN
Inventors: 张志成; 范红结; 陈钟鸣; 戴鼎震; 方光远; 何小明
Original assignee: Jinling Institute of Technology
Current assignee: Shandong Xing'an Intelligent Technology Co ltd
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2029-11-19
Also published as: CN101928782A

Abstract

本发明公开了一种用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物对，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种包含上述引物对的同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒，及采用该试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的方法。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的引物具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测提供了快速、灵敏、特异的方法。

Description

同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物和试剂盒

技术领域

本发明属于动物保护和质检领域，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

2006年夏秋季节，江西、湖南、湖北、安徽及江苏南京、无锡、扬州、苏州等国内主要养猪地区都会发生一种以高热、食欲下降、呼吸困难和繁殖障碍为主要特征的传染病，由于病原尚未明确，根据病猪体温升高的临床特点，将该病称为“猪无名高热”或猪“高热病”等。高热病广泛蔓延，流行数月。13～25周龄的生长育肥猪多发。发病率10％～80％不等，死亡率20％～50％不等。共同症状表现为体温40.5℃以上高烧不退，呼吸急促、咳嗽或流鼻涕，多数病猪皮肤潮红。不同猪群尚表现便秘、腹泻、肢体麻痹、母猪流产和口鼻腔流血等。所有病死猪都以表现严重的肺炎病变为典型特征，全身淋巴结水肿、出血，肝脏肿大或有坏死点，脾脏肿大，皮下出血，胸腔和腹腔积水，胃底和小肠粘膜出血，心脏冠状沟出血点，心包积液及膀胱粘膜出血点或斑等。以磺胺药为主或单纯地当蓝耳病、流感、猪瘟来防治，结果均较差，对症治疗效果亦不佳。此次疫病的流行和发生给我国养猪业造成了巨大经济损失，一些疫情严重的地区猪存栏量减少60％以上，不少中小型猪场因此而倒闭。此次疫情的流行造成病死及淘汰猪数量达数千万头，这对中国的养猪业而言不能不说确是一场灾难，这次灾难造成的损失要远大于1996年的猪繁殖与呼吸综合征病毒(蓝耳病)(PRRSV)和2002年猪圆环病毒2型感染所致的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，并引起了国务院、农业部和社会的高度关注，而且世界动物卫生组织(OIE)及国外兽医界都投予了注视的目光。2007年1月，猪“高热病”主要病原最终确定为变异PRRSV(NSP2 1594～1680变异株)，并定名为高致病性猪蓝耳病。PRRSV变异株NSP2基因的第483位和535-563位氨基酸发生缺失。

目前临床诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典株的方法主要是采用RT-PCR，主要可分为两大类。一类是是分步检测，一次只能检测其中一种，譬如，中国动物疫病预防控制中心的专利“猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株RT-PCR试剂盒”[200710086548]，这类方法重复操作、耗时较长、实验成本较高，容易带入人为误差，不适合基层应用等特点。另一类是鉴别RT-PCR的方法，譬如，郝晓芳等建立的以NSP2为唯一检测目的基因，以目标条带扩增大小为标准来鉴别PRRSV变异株和经典株[高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立，中国预防兽医学报；2007， 29(5)：704-709.]，何丹等建立的二重PCR诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株[猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用，广西农业科学2009，40(1)：84-87.]，这类方法以NSP2为唯一检测目的基因，但是NSP2是PRRSV基因组中的高变区，存在较高的变异性，给实验结果带来潜在的不稳定性。

非结构蛋白NSP9在不同PRRSV间同源性超过97.5％，具有较高的保守性，可以作为PRRSV诊断的目的基因。本研究针对NSP2和NSP9基因序列设计两对引物，建立一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测PRRSV的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能准确、快速、灵敏、结果易于判读的用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供包含上述引物对的同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒。

本发明最后要解决的技术问题是提供采用上述试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的方法。

为解决上述技术问题，本发明的思路如下：

目前临床RT-PCR诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株，主要是针对ORF7(N蛋白)设计的引物，而RT-PCR诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株，则需要针对NSP2基因，两者在基因上距离约13-14kb，而常见的反转录酶只能有效扩增8kb左右，所以无法一次反转录后同时检测变异株和经典株。非结构蛋白NSP9在不同PRRSV间同源性超过97.5％，具有较高的保守性，可以代替ORF7作为PRRSV诊断的目的基因。而且ORF7在基因组上距离NSP2约6kb，常见反转录酶能够达到这个长度。本研究针对NSP2和NSP9基因序列设计两对引物，建立一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测PRRSV的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的引物对，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的试剂盒，包括如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对。

一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的试剂盒，包括：

(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株阳性对照细胞灭活毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株阳性对照细胞灭活毒；

(2)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典株特异性引物对：

针对NSP2基因：上游引物P1：如SEQ IDNO：1所示；

下游引物P2：如SEQ ID NO：2所示；

针对NSP9基因：上游引物P3：如SEQ IDNO：3所示；

下游引物P4：如SEQ ID NO：4所示；

(3)RNA提取试剂：由Trizol 12mL，无菌DEPC水500μL，RNA酶抑制剂24μL组成；

(4)RT-PCR反应试剂：由RT反应液200μL，其中含反转录引物序列：RT引物如SEQ ID NO：4所示，RNA酶抑制剂24μL，AMV反转录酶12μL，5×buffer 60μL，dNTP25μL，2×PCR Master Mix 200μL组成；

(5)电泳检测试剂：由50×TAE电泳缓冲液20mL，GoldView 100μL组成。

利用上述试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的方法，包括如下步骤：

(1)RNA的提取：

(1a)取待检组织0.5g，置于匀浆器或者研钵研碎后用1.5mL D-Hanks液稀释；取已研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，6000rpm离心5min；

(1b)取步骤(1a)离心得到的上清液300μL于1.5mL灭菌离心管中，加入1mL Trizol混匀，室温下放置10min；再加入200μL氯仿混匀，室温下放置2min；

(1c)将步骤(1b)的灭菌离心管12000rpm离心10min，取600μL上层水相到另一1.5mL灭菌离心管中，加入600μL异丙醇混匀，室温下放置10min；

(1d)将步骤(1c)的灭菌离心管12000rpm离心10min，去上清，加入-20℃预冷的75％(v/v)乙醇溶液500μL，旋涡震荡混匀，7500rpm离心3min；

(1e)去除步骤(1d)离心后的上清，37℃干燥，用30μL DEPC水溶解即用或-70℃保存；

(2)反转录：

取16μL mRNA和如SEQ ID NO：4所示的RT引物25pmol/U，0.5μL混匀于PCR管中，放于PCR仪中65℃ 10min立即冰浴5min，再加入如下试剂：5×buffer 5μL、dNTP2μL、RNA酶抑制剂0.5μL、AMV反转录酶0.5μL，置PCR仪中50℃反转录1h，95℃ 3min灭活反转录酶后，-20℃保存备用；

(3)PCR：

25μL体系：2×PCR Master Mix 12.5μL；ddH₂O 6.5μL；上游引物P1 1μL；下游引物P2 1μL；上游引物P3 1μL；下游引物P4 1μL和模板(即步骤2的反转录产物)2μL；PCR反应条件：95℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃4 0s，35个循环；72℃ 8min；

(4)琼脂糖凝胶电泳：

准确称取0.3g琼脂糖，加入20mL TAE置锥形瓶于微波炉中完全溶解后加入核酸染料GoldView 6.0μL并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μL点于已凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳1h；

(5)判断结果：

如果扩增出约680bp和380bp特异性两条片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株阳性；

如果仅扩增出了约380bp特异性片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株阳性；

如果没有扩增出片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阴性。

有益效果：由于本发明采用的引物来自PRRSV不同基因中高度保守的区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株，灵敏度达10²TCID₅₀；本研究针对NSP2和NSP9基因序列设计两对引物，建立一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测PRRSV的方法。

附图说明

图1为特异性试验电泳图。其中，M：DL2000，1：PRRSV变异株，2：PRRSV经典株，3：阴性对照。

图2为退火温度选择试验电泳图。其中，1：62℃，2：60℃，3：58℃，4：56℃，5：54℃，6：阴性对照，M：DL2000。

图3为敏感性试验电泳图。其中，M：DL2000，1：10⁴TCID₅₀，2：10³TCID₅₀，3：10²TCID₅₀，4：10¹TCID₅₀，5：10⁰TCID₅₀，6：阴性对照。

图4为已知阳性病料验证试验电泳图。其中，M：DL2000，1～6：PRRSV变异株阳性病料，7：阴性对照。

图5为已知阳性病料验证试验电泳图。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：试剂盒的制备。

1病毒株：

1.1阴性对照样品的制备

取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存。

1.2猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株阳性对照样品的制备：

1.2.1RPMI-1640培养基的配制：

RPMI-1640粉一袋(10.4g，购自Invitrogen公司)，溶于1000mL三蒸水中，加Hepes 5.96g，丙酮酸钠0.11g，NaHCO₃ 2.2g，搅拌充分溶解后，N₂正压滤过除菌，4℃保存备用。

1.2.2细胞培养用试剂的配制：

(一)双抗：称取青霉素1g，链霉素6.42g，溶于160mL双蒸水，0.22μm滤菌器滤过除菌，分装后-20℃保存备用。

(二)0.2％胰酶溶液：称取胰蛋白酶0.2g，溶解于100mL双蒸水中，0.22μm滤菌器过滤除菌，-20℃保存备用。

(三)PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 5.367g，KH₂PO₄0.2g，溶于1000mL双蒸水，分装后高压灭菌，4℃保存备用。

1.2.3病料的采集和处理：

无菌采集疑似高热病发病猪场送检的血液和脾脏、肺脏、淋巴结等组织，冷藏保存，及时处理。血液离心后收集血清，无菌分装成至少3等份，每份不少于0.5mL，编号后-70℃保存备用；实质脏器剪碎，用玻璃研磨器研磨后加入MEM培养基稀释至1∶10的悬液，-20℃和室温反复冻融2次，加双抗及两性霉素，3000r/min离心10min，取上清用0.45μm微孔滤器除菌，同上分装，编号后-70℃保存备用。

1.2.4细胞培养：

将培养好的Marc-145细胞用胰酶消化，用加入10％胎牛血清、适量的双抗及两性霉素的RPMI-1640培养基重悬至适当浓度，接种于24孔板，置37℃、5％CO2条件下培养。

1.2.5病毒分离：

用Mcar-145细胞进行病毒分离：Marc-145细胞放入37℃、5％CO₂条件下培养2d长成单层后，吸弃培养基，用PBS缓冲液洗两遍，然后将滤过的病料悬液接种于Marc-145细胞上，每个样品接种4个孔，接种量为100μL/孔，同时做阳性对照孔，各孔补充50μL无血清的培养基，封好放入CO₂培养箱中吸附60min。之后取出，弃除上清，加入0.5mL的含2％血清的维持液，重新置于37℃、5％CO₂条件下培养，48h后观察细胞病变，之后每天观察细胞，将出现病变的细胞培养孔做上标记。5～6d后将培养板放入-20℃冻存，第二天取出将出现病变以及未出现病变的细胞培养液都收获，分装-70℃保存备用。

1.2.6病毒的RT-PCR初步鉴定：

用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的PRRSV(NSP21594-1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测1.2.5获得的细胞毒，操作方法和结果判断按照试剂盒说明书进行。

1.2.7PCR产物回收测序与序列分析：

利用小量胶回收试剂盒纯化PCR产物，然后按常规方法克隆于T载体，由大连宝生生物工程公司测序，用Vector NTI和DNAStar软件分析所插入的基因序列。NSP2蛋白的第482位和533-561位氨基酸发生缺失29个氨基酸的确定为猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株。

1.2.8猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株灭活苗的制备：

取1.2.7鉴定的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株1000μL，加入5μL甲醛溶液，37℃作用12小时以上，-20摄氏度保存备用。

1.3猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株阳性对照样品的制备：

1.3.1按照1.2.1至1.2.5方法操作分离病毒，-20℃保存备用；

1.3.2病毒的RT-PCR初步鉴定：

用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的PRRSV(NSP2 1594-1680变异株)RT-PCR检测试剂盒和猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒检测1.3.2获得的细胞毒，操作方法按照试剂盒说明书进行。PRRSV(NSP2 1594-1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测阴性，猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒检测阳性的毒株确定为猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株阳性。

1.3.3猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株灭活苗的制备：

取1.2.7鉴定的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株1000μL，加入5μL甲醛溶液，37℃作用12小时以上，-20摄氏度保存备用。

2试剂盒中其他成分的制造

2.1Trizol的制备

购自Invitrogen公司，200mL/瓶。

2.2RNA酶抑制剂的制备

购自Takara公司，10μL/管，50U/μL。

2.3无菌DEPC水的制备

购自Takara公司，1mL/管。

2.475％(v/v)乙醇的制备

取无水乙醇750mL，加入DEPC水250mL，混匀。

2.5AMV反转录酶的制备

购自Promega公司，100μL/管，10U/μL。

2.62×PCP master Mix的制备

购自南京博尔迪生物科技有限公司，1mL/管。

2.750×TAE电泳缓冲液的制备

0.5mol/L乙铵四乙酸二钠((EDTA)溶液(pH8.0)配制

EDTA 18.61g

灭菌双蒸水 80mL

氢氧化钠调pH至8.0

灭菌双蒸水加至100mL。

50×T AE电泳缓冲液配制

三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242g

冰乙酸 57.1mL

0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0) 100mL

灭菌双蒸水加至1000mL。

使用时灭菌双蒸水稀释50倍。

2.8Glodview核酸染料的制备

购自上海赛百盛基因技术有限公司，1mL/管。

2.9上样缓冲液的制备

购自南京博尔迪生物科技有限公司，1mL/管。

2.10引物的制备

引物由上海英俊合成，2OD/管

实施例2：检测方法。

利用实施例2的试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的方法，包括如下步骤：

(1)RNA的提取：

(1b)取步骤(1a)离心得到的上清液300μL于1.5mL灭菌离心管中，加入1mL Trizol 混匀，室温下放置10min；再加入200μL氯仿混匀，室温下放置2min；

(2)反转录：

(3)PCR：

25μL体系：2×PCR Master Mix 12.5μL；ddH₂O 6.5μL；上游引物P1 1μL；下游引物P2 1μL；上游引物P3 1μL；下游引物P4 1μL和模板(即步骤2的反转录产物)2μL；

PCR反应条件：95℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，35个循环；72℃ 8min；

(4)琼脂糖凝胶电泳：

(5)判断结果：

实施例3：特异性试验。

1材料

1.1样品

1.1.1其它猪易感病毒毒株：日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，由本单位保存。

1.1.22份SPF猪肺和血清。

1.1.3PRRSV北美型参考株(VR2332毒株)。

2方法

2.1特异性试验方法

用新型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)RT-PCR检测试剂盒检测6株其它猪易感病毒毒株，2份SPF猪肺和血清。考查试剂盒检测不同样品的特异性。

3结果

3.1检测其它猪易感病毒毒株、SPF猪样品和其它猪繁殖与呼吸综合征病毒结果

用新型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)RT-PCR检测试剂盒检测其它猪易感病毒毒株、SPF猪样品和其它猪繁殖与呼吸综合征病毒，结果均为阴性，PRRSV变异株扩增出了约680bp和380bp特异性片段，经典株仅扩增出了约380bp特异性片段，表明该方法特异性较好。结果见表1。

表1 特异性试验检测结果

被检样品	RT-PCR检测结果
		日本乙型脑炎病毒	-
猪瘟病毒	-
		猪细小病毒	-
猪伪狂犬病毒	-
		猪圆环病毒	-
猪传染性胃肠炎病毒	-
		SPF猪肺	-
SPF猪血清	-

实施例4：退火温度选择试验。

同实施例2的检测方法，所不同的是PCR反应条件为：95℃ 3min；94℃ 30s，54-62℃30s，72℃ 40s，35个循环；72℃ 8min；在PCR仪上设定退火温度梯度：54℃、56℃、58℃、60℃、62℃。

紫外灯下观察，发现在54℃、56℃、58℃、60℃、62℃均能清楚看见目的条带，但在60℃时，条带最亮，且特异性最高(见图2)。

实施例5：敏感性试验。

用DEPC灭菌水将PRRSV变异株病毒稀释成10⁰TCID₅₀、10¹TCID₅₀、10²TCID₅₀、10³TCID₅₀、10⁴TCID₅₀，检测方法同实施例2。

结果在10⁴TCID₅₀、10³TCID₅₀、102TCID₅₀、10¹TCID₅₀时仍然可以扩增出明显目的条带，10⁰TCID₅₀几乎看不见目的条带，表明该试剂盒敏感性较高。(见图3)。

实施例6：阳性病料验证试验

分别取6份采用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的PRRSV(NSP2 1594-1680变异株)RT-PCR检测试剂盒(生产批号PRRS200807)检测均为阳性的临床病料和6份采用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的PRRSV RT-PCR检测试剂盒(生产批号PRRS200807)检测均为阳性的临床病料，用实施例2的方法再次验证。发现结果和北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的试剂盒的结果完全一致，如图4、图5所示。

SEQUENCE LISTING

<110>金陵科技学院

<120>一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒及其检测方

法

<130>JIT091020

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>针对NSP2基因的上游引物P1

<400>1

aaagaccaga tggaggagga t 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>针对NSP2基因的下游引物P2

<400>2

gatgatggct tgagctgagta 21

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>针对NSP9基因的上游引物P3

<400>3

atcttcttta tgaactcgcc tgtg 24

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>针对NSP9基因的下游引物P4

<400>4

tcttctttgg gtccgtctgg 20

Claims

1.用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物，其特征在于如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列形成的引物对，以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列形成的引物对。

2.一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物。