CN110551694B - 塞尼卡谷病毒svv/ch/zz/2016 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有特定理化特性的塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)SVV/CH/ZZ/2016株，其为无囊膜小RNA病毒，属细小RNA病毒科，该病毒对有机溶剂、蛋白酶和酸具有耐受性，但对碱敏感，并且表现出对高温的敏感性，该塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016株的理化特性对研究如何预防、控制SVV疫情和SVV疫苗研制工作具有重要的意义。

Description

塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016

技术领域

本发明涉及塞尼卡谷病毒，尤其涉及一种具有特定理化特性的塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016株，其中该株的保藏编号为CGMCC No.14886，本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，又叫做Seneca virus A (SVA)，是近年来新发现的一种无囊膜小RNA病毒，属细小RNA病毒科，是Seneca virus病毒属唯一成员，与心病毒最为接近，直径25-30nm，呈正十二面体结构。SVV可引起猪水泡样症状新生仔猪的死亡，临床上其发病症状与口蹄疫、猪水疱病和水泡性口炎很难区分(LM Hales, NJKnowles,et al.Complete genome sequence analysis of Seneca Valley virus-001,anovel oncolytic picornavirus.[J].Veterinary Journal,2008, 89(5):1265-1275。BGuo,PE

et al.Novel Senecavirus A in Swine with Vesicular Disease,United States,July 2015[J].Emerging Infectious Diseases,2016,22(7):1325-1325)。

SVV的传染源主要为传染期的猪，病猪口部、鼻部和蹄冠部的水疱中含有大量病毒。该病对成年猪表现为亚临床感染，繁殖猪在蹄冠和鼻部有病变产生，7日龄内新生仔猪死亡率高达30％-70％。大量研究显示，自然感染该病的猪，发病状况相较于口蹄疫和其他疱疹疾病更为温和，具有以下感染症状：在发病猪的口腔、鼻部、蹄冠部最先出现白色肿胀的小囊泡，进而表面糜烂发展成溃疡，通常创面在7天内自动修复，只有在较为严重的感染下，才可形成瘢痕；病畜表现更为短暂发热和跛行，其临床症状与口蹄疫、水疱性口炎、猪水疱病和猪水疱疹相似；此外，SVV感染还可使7天内新生仔猪死亡率增加。该病毒最早于2002年在PER.C6细胞培养物中被发现，从2007年开始，在美国、加拿大、巴西等地先后出现该病的报道。2015年我国广东首次发现该病，呈现迅速蔓延的趋势。

我国对SVV的研究报道并不多，并且目前没有对该病毒理化性质的研究的报道，大多养殖户对该病没有引起足够的重视，但该病已经形成全球蔓延的趋势，一旦形成大爆发趋势，经济损失不可估量。因此，针对该病毒进行深入研究将对SVV病毒的预防、控制和疫苗研制工作具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有特定理化特性的塞尼卡谷病毒，特别是命名为SVV/CH/ZZ/2016的塞尼卡谷病毒株。

本发明提供一种塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016，对酸、特别是 pH值为3.0以下的酸具有耐受性，对pH值大于8.0的碱敏感。而与塞尼卡谷病毒同样为无囊膜病毒且临床上其发病症状类似的口蹄疫病毒对特别是pH7.6以上的碱耐受，但不耐酸，可见本发明的塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016和口蹄疫病毒在酸碱耐受性上完全相反。因此，通过本发明的上述发现，能够将两个病毒进行很好的区分。

另外，塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016对有机溶剂、蛋白酶也具有耐受性。其中，有机溶剂可以为乙醚、氯仿、甲醛、戊二醛、三氯三氟乙烷、丙酮等，优选为乙醚、氯仿。蛋白酶可以为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和灰色链丝菌酶等，优选为胰蛋白酶。上述有机溶剂和蛋白酶的性质对于在制备该病毒的过程中，病毒的分离纯化的试剂选择具有重要意义。

而且，该塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016株对热的敏感性上，在 50℃以下放置10min以下时毒价降低1个滴度；在56℃放置30min以上时毒价降低2个滴度，在60℃、70℃时作用30min，毒价降低5个滴度，表现出对高温的敏感性。无囊膜病毒因为结构简单、体积更小，所以一般消毒药消毒效果不好，而上述发现对该病毒的消毒方法的选择具有重要意义。

具备以上特性的塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016病毒株已于2017年11月20日由位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(邮政编码100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 14886，分类命名为塞尼卡谷病毒Seneca Valley virus。塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016 CGMCC 14886也属于本发明内容。其对酸、特别是pH值为3.0以下的酸具有耐受性，对pH值大于8.0的碱敏感，对有机溶剂和蛋白酶具有耐受性，在50℃以下放置30min以下时毒价降低1个滴度，且在56℃以上放置 30min以上时毒价降低2个滴度。

另外本发明提供上述塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016株在其疫苗制备中的应用。

本发明成功得到了具有上述特定的理化特性的塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886，对研究如何预防、控制SVV疫情和疫苗研制工作具有重要的意义。

附图说明

图1为表示病料组织PCR检测结果的电泳图，其中，编号1-6为病料组织；N为阴性对照；01为SVV阳性对照；02为FMDV(猪口蹄疫病毒)样品对照；M为100bpDNA Marker。

图2为SVV/CH/ZZ/2016株F6代毒液不同阶段收获后的显微镜照片，其中，1为细胞接种前；2为细胞接种24h；3为细胞接种48h。

图3为表示SVV/CH/ZZ/2016株F6代病毒PCR检测结果的电泳图，其中，编号8-2为SVV/CH/ZZ/2016株F6代病毒液；N1、N2为阴性对照；0为SVV阳性对照；M为100bpDNA Marker。

图4为SVV/CH/ZZ/2016株F6代的电镜观察图。

图5为表示SVV/CH/ZZ/2016株毒力试验PCR检测结果的电泳图，编号6-1至6-5为实验组发病猪病料；N为阴性对照；01为SVV阳性对照；02为FMDV样品对照；M为100bpDNAMarker。

具体实施方式

在中国河南省郑州市某猪场发现了SVV病毒，发明人从发病猪只病料分离得到的SVV病毒其中一株被命名为塞尼卡谷病毒 SVV/CH/ZZ/2016，该病毒株已于2017年11月20日由位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(邮政编码 100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 14886。塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016通过采集河南省郑州市某猪场发病猪只病料分离得到，可在人胚肾细胞(293FT 细胞)、猪睾丸细胞(ST)和猪肾细胞(PK-15)上培养增殖。根据 SVV/CH/ZZ/2016株在PK-15细胞出现CPE的情况，测定其病毒半数组织细胞感染量(TCID₅₀)大于等于10^6.5TCID₅₀/mL。

发明人之前先用一步RT-PCR方法扩增出SVV/CH/ZZ/2016株的7个核苷酸序列片段(S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7)，然后对7个核苷酸序列片段进行克隆测序，再将7个核苷酸序列片段的DNA序列依次进行拼接、编辑及校正，最终得到塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016的全基因组序列。塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016的全基因组序列如序列表中SEQ ID No:1 所示。

本发明中，将该SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886传代至F6代，通过不同的处理方式对该SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886的理化特性做研究，结果发现了其为具有特性理化特性的毒株，这对SVV病毒在我国的预防、控制和疫苗研制工作具有重要的意义。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

以下的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》 Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明选取一种塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016株对其采用不同的物理、化学方法处理后，通过测定其病毒含量的变化，从而研究其不同条件下的理化特性。

本发明通过采集发病猪的原始病料，经过PCR的方法验证，确定为塞尼卡谷病毒，经过病毒分离培养鉴定，得到塞尼卡谷病毒 SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886，并通过接种猪肾细胞(PK-15)，传代至F6，选取F6代SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886(以下有时简称为“SVV/CH/ZZ/2016株F6代”)病毒液通过不同的物理、化学方法处理后，测定其病毒含量的变化。

实施例1塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886理化特性鉴定

1.材料与引物设计

1.1组织病料、细胞和实验动物

组织病料：河南某猪场疑似SVV发病猪临床样品。

细胞：猪肾细胞(PK-15)，购自中国兽药监察所，由本研究室冻存。

实验动物：30-40日龄非免疫健康仔猪(口蹄疫抗原阴性、SVV抗体阴性)，购自呼和浩特某猪场。

1.2主要试剂

MEM，购自宜兴市赛尔生物科技有限公司；新生牛血清，购自金源康生物科技有限公司。乙醚、氯仿来源于QC部理化室；胰蛋白酶、 HCl、NaOH由本研究室提供。

1.3引物设计

将塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016的全基因组序列分成7个核苷酸序列片段：S1(1195bp)、S2(1581bp)、S3(1386bp)、S4(1235bp)、 S5(1698bp)、S6(1075bp)和S7(876bp)，分别在保守序列区域内设计一步RT-PCR扩增7个核苷酸序列片段的引物组合，经分析、比对、筛选和优化，最终确定的引物序列如表1所示。

表1用于一步RT-PCR扩增塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016全基因组

的引物组合

2.方法

2.1病毒分离培养

将分离病料组织匀浆，无菌PBS液2～8℃浸毒24小时以上， 5000r/min离心10分钟，取上清过滤后，按体积比为10％的量接种于长满单层的PK15细胞，37℃的CO₂培养箱中吸附1小时，加入细胞维持液，同时设正常细胞对照，置37℃的CO₂培养箱中培养，观察细胞病变情况；待80％细胞出现病变时，收获病毒液，反复冻融2～3次后作为第1代细胞毒(记为F1)，保存于-70℃冰箱中备用。在PK-15 细胞上连续传代至F12。

2.2SVV/CH/ZZ/2016株F6代基因检测

将从病料组织中分离得到的病毒进行连续传代，直至F6代，收毒后，反复冻融2-3次，提取RNA，进行PCR检测。

2.3SVV/CH/ZZ/2016株F6代病毒含量测定

将SVV/CH/ZZ/2016株F6代收获毒液用MEM维持液作10倍系列稀释，取10^-5～10^-8 4个稀释度，每个稀释度作4个复孔，每孔100μl 加入到96孔细胞培养板中，再加入100μl细胞悬液，细胞密度为5× 10⁵个cell/ml，置37℃、5％CO₂培养箱中培养5日，记录各稀释度细胞病变孔数，按Reed～Muench法计算TCID₅₀。

2.4SVV/CH/ZZ/2016株F6代电镜观察

将SVV/CH/ZZ/2016株F6代收获经过浓缩处理后，送至扬州大学进行电镜试验观察。

2.5SVV/CH/ZZ/2016株F6代毒力试验

选取30-40日龄健康仔猪(口蹄疫抗原阴性、SVV抗体阴性)10 头，分为实验组和对照组，每组各5头，实验组每头猪耳根后肌肉注射SVV/CH/ZZ/2016株F6细胞毒2ml，对照组注射相同计量生理盐水作为对照。连续观察10日，对实验组均应出现SVV病毒的典型症状，对照组则不应出现典型症状。病毒发病部位采集病料检测PCR结果。

2.6SVV/CH/ZZ/2016株F6代对乙醚的敏感性试验

将SVV/CH/ZZ/2016株F6代病毒液经1000rpm离心5min除去细胞碎片，取上清液1.6mL，分别移入2个1.5mL离心管中，每管0.8mL；其中一管加入乙醚0.2mL作为实验组，另一管不加乙醚作为对照组；冰浴振荡60min，然后2000rpm离心20min，液体分上下两层：上层为乙醚，下层为病毒液；吸取病毒液，移入新的离心管中，连续吹打使乙醚充分挥发，然后测定试验组和对照组病毒液的TCID₅₀。如系乙醚敏感病毒，则病毒效价明显降低，甚至完全灭活。

2.7SVV/CH/ZZ/2016株F6代对氯仿的敏感性试验

将SVV/CH/ZZ/2016株F6代病毒液，加入分析纯级氯仿，使其终浓度为4.8％，对照组则加入终浓度为4.8％的生理盐水；在4℃振荡混合10min，然后500rpm离心5min，液体分上下两层：上层为病毒液，下层为氯仿；吸取上层液体，测定实验组和对照组样品的TCID₅₀。

2.8SVV/CH/ZZ/2016株F6代对胰蛋白酶的敏感性试验

在两个试管内各加入0.5mL的SVV/CH/ZZ/2016株F6代病毒液，其中一管(实验组)加入1％胰蛋白酶溶液0.5mL，使胰蛋白酶最终浓度为0.5％；另一管(对照组)加入0.5mLPBS液；将两个试管倒转几次，使其充分混合，并于37℃感作1h；然后各加入一定量的灭活犊牛血清，充分混匀，终止胰蛋白酶的作用；测定实验组和对照组样品的 TCID₅₀。

2.9SVV/CH/ZZ/2016株F6代对酸的敏感性试验

取4个离心管各加入5mL病毒液，用0.1mol/L HCl将管中病毒液的pH值分别调至3.0，4.0，5.0，6.0；置37℃感作2h，再用7.5％NaHCO₃溶液将pH值调回至7.2左右；测定各样品的TCID₅₀。如果实验组的感染力比对照组降低2个对数以上乃至完全灭活者，证明该病毒对酸敏感，相差不到1个对数者为耐酸。

2.10SVV/CH/ZZ/2016株F6代对碱的敏感性试验

取4个离心管各加入5mL病毒液，用7.5％NaHCO₃或 0.1mol/LNaOH将管中病毒液的pH值分别调至7.0，8.0，9.0，10.0；置37℃感作2h，再用0.1mol/L HCl溶液将pH值调回至7.2左右；测定各样品的TCID₅₀。如果实验组的感染力比对照组降低2个对数以上乃至完全灭活者，证明该病毒对碱敏感，相差不到1个对数者为耐碱。

2.11SVV/CH/ZZ/2016株F6代对热的敏感性试验

取12支离心管，每支加入1mL病毒液；分别置于37℃、50℃、 56℃、60℃、70℃的水浴锅中进行反应，37℃水浴30min，50℃分别水浴5min、10min、15min、30min、60min、120min，56℃分别水浴30min、 60min、70min，60℃水浴30min，70℃水浴30min，然后测定各样品的TCID₅₀。

3结果

3.1病毒分离培养

将SVV疑似病料提取RNA后，以其为模板，进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图1所示，显示得到了一条440bp 目的条带，与预期扩增目的条带大小一致。

3.2SVV/CH/ZZ/2016株F6代基因检测

收获SVV/CH/ZZ/2016株F6代毒液后(图2)，提取RNA，进行 PCR检测，结果显示出现目的条带与预期大小一致，说明该病毒为 SVV/CH/ZZ/2016株。(图3)

3.3SVV/CH/ZZ/2016株F6代病毒含量测定

将SVV/CH/ZZ/2016株F12代收获毒液用MEM(最低必需培养液 (minimum Eagle’smedium))维持液作10倍系列稀释，取10^-5～10^-8 4 个稀释度，每个稀释度作4个复孔，按Reed～Muench法计算，TCID₅₀为10^7.75/0.1ml。

3.4SVV/CH/ZZ/2016株F6代电镜观察

结果如图4所示，该病毒直径约为25-30nm，表面光滑，无囊膜。

3.5SVV/CH/ZZ/2016株F6代毒力试验

攻毒后观察10d，实验组所有猪均发病，而对照组均不发病，PCR 检测结果见图5。

3.6SVV/CH/ZZ/2016株F6代对乙醚、氯仿、胰蛋白酶的敏感性

试验结果见表1，从以上检测结果得出，塞尼卡谷病毒 SVV/CH/ZZ/2016株对乙醚、氯仿、胰蛋白酶均不敏感。

表2SVV/CH/ZZ/2016株F6代乙醚、氯仿、胰蛋白酶敏感性

样品	病毒原液	乙醚	氯仿	胰蛋白酶
					TCID<sub>50</sub>/0.1ml	7.75	7.5	7.25	7.25

3.7SVV/CH/ZZ/2016株F6代对酸的敏感性

选取不同pH处理后的病毒液检测其病毒含量，结果如表2所示。分析可知塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016株对酸有较好耐受性。

表3SVV/CH/ZZ/2016株F6代对酸的敏感性

样品	病毒原液	pH＝1	pH＝1.5	pH＝2	pH＝2.5	pH＝3.0	pH＝4.0	pH＝5.0	pH＝6.0
										TCID<sub>50</sub>/0.1ml	7.75	7.5	7.25	7.5	7.75	7.5	7.25	7.25	7.0

3.8SVV/CH/ZZ/2016株F6代对碱的敏感性

将病毒液的pH值分别调至7.0、8.0、9.0、10.0处理后，检测其 TCID₅₀结果如表3，可知SVV/CH/ZZ/2016株塞尼卡谷病毒在pH大于 8.0时对碱敏感。

表4SVV/CH/ZZ/2016株F6代对碱的敏感性

样品	病毒原液	pH＝7.0	pH＝8.0	pH＝9.0	pH＝10.0
						TCID<sub>50</sub>/0.1ml	7.75	7.25	6.75	6.0	5.25

3.9SVV/CH/ZZ/2016株F6代对热的敏感性

从表4中可得出：塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016株在37℃时作用30min，其毒价没影响；在50℃时作用10min，毒价稍有下降，作用 30min，毒价降低一个滴度；在56℃时作用30min毒价就明显降低；在 60℃、70℃时作用30min毒价更明显降低。因此塞尼卡谷病毒对高温敏感。

表5SVV/CH/ZZ/2016株F6代对热的敏感性

由上可知，本发明将塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886传代至F6代，并对F6代病毒滴度进行测定，结果TCID₅₀为7.75/0.1ml。将塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016株F6代病毒培养物接种仔猪后，攻毒4～5d出现典型临床症状，取病变组织进行PCR检测，结果显示阳性。在此基础上，通过不同的处理方式对塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016CGMCCNo.14886的理化特性做研究，结果表明该毒株对乙醚、氯仿、胰蛋白酶有较强耐受性；该毒株对碱敏感而对酸不敏感；56℃30min可使其毒价显著降低。

电镜观察塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886的病毒形态(如图4所示)为与目前所报道的病毒形态完全符合，基因组测序也符合SVV序列要求，测序结果如序列表中SEQ ID No:1所示。

序列表

<110> 金宇保灵生物药品有限公司

<120> 塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016

<130> CGCNB185052W

<141> 2018-06-01

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7292

<212> DNA

<213> 塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016的全基因组核苷酸序列(Senecavirus病毒属)

<400> 1

tttgaaatgg ggggctgggc ccttatgccc agtccttcct ttccccttcc ggggggtaaa 60

ccggctgtgt ttgctagagg cacagaggag caacatccaa cctgcttttg tggggaacgg 120

tgcggctcca attcctgcgt cgccaaaggt gttagcgcac ccaaacggcg catctaccaa 180

tgctattggt gtggtctgcg agttctagcc tactcgtttt cttcccctac tcactcagtc 240

acgcacaaaa agtgtgttgt aactacaaga tttagccctc gcacgggatg tgcgataacc 300

gcaagattga ctcaagcgcg gaaagcgctg taaccacatg ctgttagtcc cttcgtggct 360

gcgagatggc tatccacctc ggatcactga actggagctc gaccctcctt agtaagggaa 420

ccgagaggcc ttcttgcaac aagctccgac acagagtcca cgtgattgct accaccatga 480

gtacatggtt ctcccctctc gacccaggac ttctttttga atatccacgg ctcgatccag 540

agggtggggc atgatccccc tagcatagcg agctacagcg ggaactgtag ctaggcctta 600

gcgtgccttg gatactgcct gatagggcga cggcctagtc gtgtcggttc tataggtagc 660

acatacaaat atgcagaact ctcatttttc tttcgataca gcctctggca cctttgaaga 720

cgtaaccgga acaaaagtca agatcgttga ataccccaga tcggtgaaca atggtgttta 780

cgattcgtcc actcatttag agatactgaa cctacagggt gaaattgaaa ttttaaggtc 840

tttcaacgag taccaaattc gcgccgccaa acaacaactt ggactggaca tcgtatacga 900

actacagggt aatgttcaga caacctcaaa gaatgatttt gattcccgcg gcaataatgg 960

taacatgacc ttcaattact acgcaaacac ttaccagaat tcagtagact tctcgacctc 1020

ctcgtcggcg tcaggcgccg gacccgggaa ctcccggggc ggactagcgg gtctcctcac 1080

aaatttcagt ggaatcttga accctcttgg ctacctcaaa gatcaaaata ccgaagaaat 1140

ggaaaactct gctgatcgag tcataacgca aacggcgggc aacactgcca taaacacgca 1200

atcatcctag ggtgtgttgt gtgcctacgt tgaagacccg accaaatctg accctccgtc 1260

cagcagtaca gatcaaccca ccaccacttt tactgccatc gacaggtggt atactggacg 1320

tctcaattct tggacaaaag ctgtaaaaac cttctctttt caggccgtcc cgctccctgg 1380

agccttcctg tctagacagg gaggcctcaa cggaggggcc ttcacggcta ccctacatag 1440

acatttctta atgaagtgcg ggtggcaggt gcaggtccaa tgcaatttga cgcaattcca 1500

ccaaggtgct cttcttgttg ccatggtccc cgagaccacc cttgatgtca aacctgacgg 1560

caaggcaaag agcttacagg agctgaatga agagcagtgg gtggaaatgt ctgacgatta 1620

ccggaccggg aaaaacatgc cttttcaatc tcttggcaca tactatcggc cccctaactg 1680

gacttggggc cccaatttta tcaaccccta tcaagtaaca gttttcccac accaaattct 1740

gaacgcgaga acctctacct cggtagacat aagtgtccca tacatcgggg agactcctac 1800

acaatcctca gagacacaga actcctggac cctcctcgtc atggtgcttg tccccttaga 1860

ctacaaggag ggagccacaa ctgacccaga aatcacattc tctgtaaggc ctacaagtcc 1920

ttacttcaat gggcttcgta accgtttcac gaccgggacg gacgaggaac aggggcccat 1980

tcccacagca cccagagaaa attcgcttat gtttctctca accatccctg acgacactgt 2040

ccctgcttac gggaatgtgc gtacccctcc cgtcaattac ctccccggtg aaataaccga 2100

cctcttacaa ctggcccgta tacccactct catggcgttt gggcgggtgt ctgaacccga 2160

gcctgcctca gacgcttatg tgccctacgt tgccgttcct gcccagttcg acgacaagcc 2220

tctcatctcc ttcccgatca ccctttcaga tcctgtctac cagaacaccc tggtaggcgc 2280

catcagttcg aacttcgcca actacagggg gtgtatccaa atcactctga cattttgtgg 2340

acccatgatg gcaagaggga aattcctgct ctcgtattct ccccctaatg gagcacaacc 2400

acagaccctt tctgaagcta tgcagtgcac atattctatt tgggacatag gcttgaactc 2460

tagttggacc tttgtcatcc cctacatctc gcccagtgat taccgtgaaa ctcgggctat 2520

taccaactca gtttattctg ctgatggttg gtttagctta cacaagctga ccaaaatcac 2580

tctaccacct gactgcccac agagtccctg tattctcttt ttcgcctctg ctggtgagga 2640

ttacaccctc cgtctccctg ttgattgtaa tccttcctac gtgttccact ccaccgacaa 2700

cgccgagact ggtgttattg aggcaggtaa cactgacacc gatttctctg gtgaactggc 2760

ggctcctggc tctaaccata ctaatgtcaa attcctgttt gaccgatctc gactactgaa 2820

tgtaattaag gtgctggaga aggacgccgt cttcccccgt cctttcccca cggcaacagg 2880

tgcacagcag gacgatggtt acttttgtct tctaacaccc cgcccaacag tcgcttcccg 2940

acccgccact cgtttcggcc tgtacgtcaa cccgtctgac agtggcgttc tcgctaacac 3000

ttcactggat ttcaattttt atagtttggc ctgtttcact tactttagat cagaccttga 3060

agtcgcggtg gtctcactgg agccagattt ggaattcgcc gtggggtggt tcccctctgg 3120

cagtgagtac caggcttcta gctttgtcta cgaccaactg catgtaccct accactttat 3180

tgggcgcacc ccccgcgctt tcaccagcaa gggtggaaag gtatctttcg tgctcccttg 3240

gaactctgtc tcttccgtgc ttcccgtgcg ctgggggggc gcttccaagc tttcttctgc 3300

cacgcggggt ctgccggctc atgctgactg ggggaccatt tacgccttta tcctccgtcc 3360

caacgagaag aaaagctccg ctgtaaagca cgtggcggtg tacgttcggt acaagaacgc 3420

gcgtgcttgg tgccccagca tgcttccctt tcgcagctat aagcagaaga tgctgatgca 3480

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tgaagcggaa aacgatctag tcactctggc ctctctctgg aagatggtac actccgttca 3600

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ccctgtcctc cagtaccagc tggagatgaa gaagctcggg cccgtggctt tggctcatga 4080

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cctcaaatct cttgccctaa cactggggaa gactaatttg gcccaaagtc tcaccactat 4200

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gccccctgga gcgctctctc ttatggaaat gcaacagccc aacgtggaca tgggctttga 5220

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tggacttaca caatccgctc ttcttgtgac tggccggacc ttcctaatca atgagcacac 5340

gtggtccaac ccctcttgga ccagcttcac aatccgtggt gaggtgcaca ctcgtgatga 5400

gcctttccaa acggttcatt ttactcacca tggtcttccc acagatctga tgatggtacg 5460

tctcggaccg ggcaactcct tccctaacaa tctagacaag tttggacttg accagatgcc 5520

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gaacttcctc gggtttgttg actccatcac ctctgaccaa ggaacctatg cgagactttt 5640

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tggtgtccga cgcatcattg gcctgcattc tgctggtgcc gctggtatcg gcgccgggac 5760

ttacatctca aaattaggac tgatcaaagc ccttaaacac ctcggtgagc ctctggctac 5820

aatgcaagga ctgatgactg agctagagcc tggagtcacc gtacatgtgc cccgaaaatc 5880

taaattgaga aagacgaccg cacacgcggt gtacaaaccg gagtttgaac ccgctgtgtt 5940

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acacactgcc aacgtccctt atcaacctcc tttgttctac acatacatgt tagagtacgc 6060

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cattagcggc cttcgacgta ctgatctcgt cgattttgcg aacggcacgg tagacccggc 6240

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ttttctgaaa gatgaaatca gaccctcaga gaaggtccga gcgggaaaaa cccgcattgt 6360

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cttctggacc gtcatagggg ctcagctcga gggaagaaag aacacgtatg acgtggatta 6540

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gtataagatg actcctgcca acaaaggttc tgtcttccct ccgacttcct ctctctccga 6960

tgctgttttt ctaaaacgca aattcgtcca aaacaatgac ggcttataca aaccagttat 7020

ggatttaaag aatttggaag ccatgctctc ctacttcaaa ccaggaacac tactcgagaa 7080

gctgcaatct gtttctatgt tggctcaaca ttctggaaaa gaagaatacg atagattgat 7140

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ggccttgttc gactgacctg gatagcccaa cgcgcttcgg tgctgccggc gattctggga 7260

gaactcagtc ggaacagaaa agggaaaaaa aa 7292

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S1核苷酸序列片段的上游引物S1-F(人工序列)

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tttgaaatgg ggggctgggc cct 23

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<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S1核苷酸序列片段的下游引物S1-R(人工序列)

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gcgtgtttat ggcagtgttg cc 22

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<213> 一步RT-PCR扩增S2核苷酸序列片段的上游引物S2-F(人工序列)

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tagcgggtct cctcacaaat t 21

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<213> 一步RT-PCR扩增S2核苷酸序列片段的下游引物S2-R(人工序列)

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gtgtaatcct caccagcaga 20

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<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S3核苷酸序列片段的上游引物S3-F(人工序列)

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gtatccaaat cactctgaca tt 22

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<213> 一步RT-PCR扩增S3核苷酸序列片段的下游引物S3-R(人工序列)

<400> 7

atagcgtggc ggccaaggcg a 21

<210> 8

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<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S4核苷酸序列片段的上游引物S4-F(人工序列)

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ctagtcactc tggcctctct ctg 23

<210> 9

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<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S4核苷酸序列片段的下游引物S4-R(人工序列)

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tcgaccaact ctaggagatt 20

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<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S5核苷酸序列片段的上游引物S5-F(人工序列)

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cgtgtggtgg tccttag 17

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<212> DNA

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acagcaggct caaactcc 18

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<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S6核苷酸序列片段的上游引物S6-F(人工序列)

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agtttggact tgaccagatg ccg 23

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<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S6核苷酸序列片段的下游引物S6-R(人工序列)

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gagccagtgc cgtgtgaaga gt 22

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<213> 一步RT-PCR扩增S7核苷酸序列片段的上游引物S7-F(人工序列)

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gccaagtttc aatcccatcc tg 22

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<212> DNA

<213> 一步RT-PCR扩增S7核苷酸序列片段的下游引物S7-R(人工序列)

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tttttttttt cccttttctg ttccga 26

Claims (2)

1.一种塞尼卡谷病毒，其特征在于：命名为SVV/CH/ZZ/2016，于2017年11月20日由位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 14886；该塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886的全基因组序列如序列表中SEQ ID No:1所示；且所述塞尼卡谷病毒SVV/CH/ZZ/2016 CGMCC No.14886对pH值为3.0以下的酸具有耐受性，对pH值大于8.0的碱敏感。

2.权利要求1所述的塞尼卡谷病毒在疫苗制备中的应用。

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