CN114794018B - 一种腮腺炎病毒攻毒动物模型及其建立方法 - Google Patents

一种腮腺炎病毒攻毒动物模型及其建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种腮腺炎病毒攻毒动物模型及其建立方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种腮腺炎病毒攻毒动物模型，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型为静脉注射有腮腺炎病毒的干扰素受体缺失动物；研究发现，与普通小鼠相比，干扰素受体缺失小鼠经腮腺炎病毒攻毒后，血液中的腮腺炎病毒载量显著提高，并且，与肌肉注射和滴鼻注射相比，干扰素受体缺失小鼠经尾静脉注射腮腺炎病毒后，血液中的腮腺炎病毒载量显著提高，可见，对干扰素受体缺失动物静脉注射腮腺炎病毒可突破物种限制，在动物体内实现腮腺炎病毒的有效感染，形成与人感染所相似的症状（例如，在各种脏器中显著的复制），因此，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型可作为腮腺炎病毒攻毒动物模型。

Description

一种腮腺炎病毒攻毒动物模型及其建立方法
技术领域
本发明涉及一种腮腺炎病毒攻毒动物模型及其建立方法，属于生物技术领域。
背景技术
流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒（Mumps virus，MuV）引起的急性传染病，是儿童和青少年期常见的呼吸道传染病。其主要临床症状为腮腺肿痛，有时也会引起诸如病毒性脑炎、睾丸炎、胰腺炎或卵巢炎等急性炎症或者全身性炎症。
MuV主要通过唾液、唾液污染的物品以及空气飞沫传播。流行性腮腺炎属于全球流行传染病中的一种，地区分布非常广泛。腮腺炎的流行和爆发无明显的季节和地域性，且不受气候等因素的影响，但冬春季的发病人数要多于夏季。
现阶段，控制流行性腮腺炎的主要措施是疫苗预防免疫。随着腮腺炎病毒疫苗的广泛使用，腮腺炎的发病率被极大的控制。因此，针对不同基因型的腮腺炎病毒开发更多安全、高效疫苗成为了当务之急，而有效的动物模型是疫苗开发的重要环节和工具。
然而，腮腺炎病毒在各种非人的动物模型中感染效率不高，不能形成与人感染所相似的症状（例如，在各种脏器中显著的复制），因此，亟需找到可实现腮腺炎病毒有效感染的构建腮腺炎病毒攻毒动物模型的方法，以用于腮腺炎病毒疫苗有效性的评价。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种腮腺炎病毒攻毒动物模型，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型为静脉注射有腮腺炎病毒的干扰素受体缺失动物。
在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为干扰素受体缺失大鼠、干扰素受体缺失小鼠、干扰素受体缺失兔、干扰素受体缺失猴、干扰素受体缺失仓鼠或干扰素受体缺失豚鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为I型干扰素受体缺失动物或Ⅱ型干扰素受体缺失动物；所述I型干扰素受体为IFN-αR、IFN-βR和/或IFN-α/βR；所述Ⅱ型干扰素受体为IFN-γR。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒在干扰素受体缺失动物体内的攻毒剂量为1×103CCID50/只~1×106CCID50/只。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型为尾静脉注射有腮腺炎病毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型的受检样本为血液、淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和/或肺。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型的受检样本为血液。
本发明还提供了上述腮腺炎病毒攻毒动物模型的建立方法，所述方法为给干扰素受体缺失动物静脉注射腮腺炎病毒。
在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为干扰素受体缺失大鼠、干扰素受体缺失小鼠、干扰素受体缺失兔、干扰素受体缺失猴、干扰素受体缺失仓鼠或干扰素受体缺失豚鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为I型干扰素受体缺失动物或Ⅱ型干扰素受体缺失动物；所述I型干扰素受体为IFN-αR、IFN-βR和/或IFN-α/βR；所述Ⅱ型干扰素受体为IFN-γR。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒在干扰素受体缺失动物体内的攻毒剂量为1×103CCID50/只~1×106CCID50/只。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为给IFNα/βR-/-基因缺失小鼠尾静脉注射腮腺炎病毒。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型的受检样本为血液、淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和/或肺。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型的受检样本为血液。
本发明还提供了一种评价腮腺炎病毒疫苗有效性的方法，所述方法包括如下步骤：
免疫步骤：使用腮腺炎病毒疫苗对干扰素受体缺失动物进行免疫；
攻毒步骤：免疫结束后，给干扰素受体缺失动物静脉注射腮腺炎病毒进行攻毒；
评价步骤：攻毒结束后，检测干扰素受体缺失动物体内的腮腺炎病毒载量。
在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为干扰素受体缺失大鼠、干扰素受体缺失小鼠、干扰素受体缺失兔、干扰素受体缺失猴、干扰素受体缺失仓鼠或干扰素受体缺失豚鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为I型干扰素受体缺失动物或Ⅱ型干扰素受体缺失动物；所述I型干扰素受体为IFN-αR、IFN-βR和/或IFN-α/βR；所述Ⅱ型干扰素受体为IFN-γR。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒在干扰素受体缺失动物体内的攻毒剂量为1×103CCID50/只~1×106CCID50/只。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
免疫步骤：使用腮腺炎病毒疫苗对IFNα/βR-/-基因缺失小鼠进行免疫；
攻毒步骤：免疫结束后，给IFNα/βR-/-基因缺失小鼠尾静脉注射腮腺炎病毒进行攻毒；
评价步骤：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内的腮腺炎病毒载量。
在本发明的一种实施方式中，所述评价步骤为：攻毒结束后，检测干扰素受体缺失动物血液、淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和/或肺内的腮腺炎病毒载量。
在本发明的一种实施方式中，所述评价步骤为：攻毒结束后，检测干扰素受体缺失动物血液内的腮腺炎病毒载量。
本发明还提供了上述腮腺炎病毒攻毒动物模型或上述建立方法或上述方法在评价腮腺炎病毒疫苗有效性中的应用。
本发明还提供了一种评价腮腺炎病毒毒株毒力的方法，所述方法包括如下步骤：
攻毒步骤：给干扰素受体缺失动物静脉注射腮腺炎病毒进行攻毒；
评价步骤：攻毒结束后，检测干扰素受体缺失动物体内的腮腺炎病毒载量。
在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为干扰素受体缺失大鼠、干扰素受体缺失小鼠、干扰素受体缺失兔、干扰素受体缺失猴、干扰素受体缺失仓鼠或干扰素受体缺失豚鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为I型干扰素受体缺失动物或Ⅱ型干扰素受体缺失动物；所述I型干扰素受体为IFN-αR、IFN-βR和/或IFN-α/βR；所述Ⅱ型干扰素受体为IFN-γR。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒在干扰素受体缺失动物体内的攻毒剂量为1×103CCID50/只~1×106CCID50/只。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
攻毒步骤：给IFNα/βR-/-基因缺失小鼠尾静脉注射腮腺炎病毒进行攻毒；
评价步骤：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内的腮腺炎病毒载量。
在本发明的一种实施方式中，所述评价步骤为：攻毒结束后，检测干扰素受体缺失动物血液、淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和/或肺内的腮腺炎病毒载量。
在本发明的一种实施方式中，所述评价步骤为：攻毒结束后，检测干扰素受体缺失动物血液内的腮腺炎病毒载量。
本发明还提供了上述腮腺炎病毒攻毒动物模型或上述建立方法或上述方法在评价腮腺炎病毒毒株毒力中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种腮腺炎病毒攻毒动物模型，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型为静脉注射有腮腺炎病毒的干扰素受体缺失动物；研究发现，与普通小鼠相比，干扰素受体缺失小鼠经腮腺炎病毒攻毒后，血液中的腮腺炎病毒载量显著提高，并且，与肌肉注射和滴鼻注射相比，干扰素受体缺失小鼠经尾静脉注射腮腺炎病毒后，血液中的腮腺炎病毒载量显著提高，可见，对干扰素受体缺失动物静脉注射腮腺炎病毒可突破物种限制，在动物体内实现腮腺炎病毒的有效感染，形成与人感染所相似的症状（例如，在各种脏器中显著的复制），因此，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型可作为腮腺炎病毒攻毒动物模型，用于腮腺炎病毒的毒株毒力评价以及腮腺炎病毒疫苗有效性的评价。
进一步地，所述腮腺炎病毒攻毒动物模型的受检样本为血液；研究发现，与淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和肺相比，干扰素受体缺失小鼠经尾静脉注射腮腺炎病毒后，血液中的腮腺炎病毒载量更高，因此，可选择血液作为腮腺炎病毒攻毒动物模型的受检样本，并且，以血液作为受检样本有利于连续取样进行动态监测，同时，以血液作为受检样本在采样时具有操作简单的优势。
2、本发明提供了一种评价腮腺炎病毒疫苗有效性的方法，所述方法先使用待评价的腮腺炎病毒疫苗对干扰素受体缺失动物进行免疫，再使用腮腺炎病毒对干扰素受体缺失动物进行尾静脉注射，最后通过检测干扰素受体缺失动物体内的腮腺炎病毒载量对腮腺炎病毒疫苗的有效性进行评价；研究发现，与普通小鼠相比，干扰素受体缺失小鼠经腮腺炎病毒攻毒后，血液中的腮腺炎病毒载量显著提高，并且，与肌肉注射和滴鼻注射相比，干扰素受体缺失小鼠经尾静脉注射腮腺炎病毒后，血液中的腮腺炎病毒载量显著提高，可见，对干扰素受体缺失动物静脉注射腮腺炎病毒可突破物种限制，在动物体内实现腮腺炎病毒的有效感染，形成与人感染所相似的症状（例如，在各种脏器中显著的复制），因此，使用此方法评价腮腺炎病毒疫苗有效性在腮腺炎病毒疫苗有效性的评价中极具应用前景。
进一步的，所述检测为检测干扰素受体缺失动物血液内的腮腺炎病毒载量；研究发现，与淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和肺相比，干扰素受体缺失小鼠经尾静脉注射腮腺炎病毒后，血液中的腮腺炎病毒载量更高，因此，可选择血液作为腮腺炎病毒疫苗有效性评价的观测对象，并且，以血液作为观测对象有利于连续取样进行动态监测，同时，以血液作为观测对象在采样时具有操作简单的优势。
3.本发明提供了一种评价腮腺炎病毒毒株毒力的方法，所述方法先使用腮腺炎病毒对干扰素受体缺失动物进行尾静脉注射，然后通过检测干扰素受体缺失动物体内的腮腺炎病毒载量对腮腺炎病毒毒株的毒力进行评价；研究发现，与普通小鼠相比，干扰素受体缺失小鼠经腮腺炎病毒攻毒后，血液中的腮腺炎病毒载量显著提高，并且，与肌肉注射和滴鼻注射相比，干扰素受体缺失小鼠经尾静脉注射腮腺炎病毒后，血液中的腮腺炎病毒载量显著提高，可见，对干扰素受体缺失动物静脉注射腮腺炎病毒可突破物种限制，在动物体内实现腮腺炎病毒的有效感染，形成与人感染所相似的症状（例如，在各种脏器中显著的复制），因此，使用此方法评价腮腺炎病毒毒株毒力在腮腺炎病毒毒株毒力的评价中极具应用前景。
进一步的，所述检测为检测干扰素受体缺失动物血液内的腮腺炎病毒载量；研究发现，与淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和肺相比，干扰素受体缺失小鼠经尾静脉注射腮腺炎病毒后，血液中的腮腺炎病毒载量更高，因此，可选择血液作为腮腺炎病毒毒株毒力评价的观测对象，并且，以血液作为观测对象有利于连续取样进行动态监测，同时，以血液作为观测对象在采样时具有操作简单的优势。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2的病毒液的制备方法如下：
细胞制备：将孵化9~11日龄的鸡胚（购自浙江立华公司），去头去内脏，使用剪刀剪成1.5mm3的组织块后，以5mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶（购自Gibco公司，货号：27250018），于37℃下消化20min，消化后进行吹打，制备成浓度为2.0×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液；
病毒接种：将腮腺炎病毒毒株按照0.001MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒的细胞悬液以200mL/层的添加量加入到细胞工厂（购自Thermo公司，10层）中，于34℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有200mL病毒生长液（所述病毒生长液为购自Gibco公司的货号为259962的BactoTM TC 乳清蛋白水解物）；
细胞换液：第一次培养24h后，将细胞工厂中的病毒生长液导入废液罐中，用0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液清洗细胞工厂，每层加液150mL，晃动清洗细胞表面后将液体导入废液罐，以上操作重复3遍；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第二次培养；
第一次收获：第二次培养72h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第三次培养；
第二次收获：第三次培养24h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第四次培养；
第三次收获：第四次培养24h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞工厂中，每层加液200mL，于34℃下培养进行第五次培养；
第四次收获：第五次培养24h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获和第三次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒液。
使用上述制备方法分别对A基因型腮腺炎病毒毒株JL（购自佐治亚大学）和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2（保藏编号为CCTCC No:V201950，记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）进行培养，得到A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2的病毒液，上述病毒液用于动物模型的攻毒，并且，A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2是减毒株，因此，两者的病毒液还作为腮腺炎病毒减毒活疫苗用于有效性评价。
下述实施例中F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F和G基因型腮腺炎病毒毒株MuV（Ggenotype）的病毒液的制备方法如下：
细胞制备：取1支Vero细胞（购自ATCC）用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基（购自Gibco公司）复苏至T25细胞瓶（购自Thermo公司）内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T25细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将0.25%胰酶消化液（先称取2.5g购自Gibco公司的猪源胰蛋白酶、0.2g EDTA溶解于PBS缓冲液中，然后用HCl调节pH至7.4，最后加PBS缓冲液定容至1L，即得0.25%胰酶消化液）以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去0.25%胰酶消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用10mL病毒生长液（病毒生长液为含10%胎牛血清的DMEM培养基，10%是指v/v）重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，制备成浓度为2.0×105个/mL的Vero细胞悬液；
病毒接种：将腮腺炎病毒毒株按照0.001MOI的接种量接种至T25细胞瓶内的Vero细胞悬液中后，于34℃下进行第一次培养；
细胞换液：第一次培养24h后，将T25细胞瓶内的病毒生长液导入废液罐中，用0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液清洗T25细胞瓶，每瓶加液5mL，晃动清洗细胞表面后将液体导入废液罐，以上操作重复3遍；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的货号为12350039的培养基199）注入细胞瓶中，每瓶加液10mL，于34℃下培养进行第二次培养；
第一次收获：第二次培养72h后，将T25细胞瓶内的病毒培养液导出，即得病毒液。
使用上述制备方法分别对F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F（保藏编号为CCTCC No:V201948，记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）和G基因型腮腺炎病毒毒株MuV（G genotype）（来自江苏省疾病预防与控制中心）进行培养，得到F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F、G基因型腮腺炎病毒毒株MuV（G genotype）的病毒液，上述病毒液用于动物模型的攻毒。
实施例1：小鼠类型对腮腺炎病毒攻毒后发病情况的影响
实验动物为IFNα/βR-/-基因缺失小鼠（4~6周龄，来自华中农业大学）和129小鼠（4~6周龄，购自北京维通利华公司），实验组共设置6组，每组4只，6组实验组分别为尾静脉、肌肉和滴鼻注射F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F的病毒液进行攻毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠和尾静脉、肌肉和滴鼻注射F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F的病毒液进行攻毒的129小鼠，攻毒剂量为1×106CCID50/只。攻毒后14D采集实验组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠和129小鼠的血液、淋巴结、脾脏、肝脏、心脏和肾脏进行荧光定量PCR，通过荧光定量PCR检测实验组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠和129小鼠的血液、淋巴结、脾脏、肝脏、心脏和肾脏中腮腺炎病毒的病毒载量，检测结果见表1~2；
其中，荧光定量PCR为：
步骤一：采集血液或者组织样本，使用Trizol试剂提取组织中的RNA：a）取样本100µL加入900µL Trizol试剂（购自赛默飞），于样品管中充分混匀，静置10 min；b）每个样品管中加200µL氯仿，混匀静置5min，4℃、12000r/min离心10min；c）取上层上清液转移至新离心管，加入等体积的异丙醇，混匀静置10min，4℃、10000r/min离心10min；d）弃上清液，沉淀中加750µL 75%（v/v）乙醇，4℃、12000r/min离心10min；e）弃掉上清液，留沉淀，将离心管倒扣于吸水纸上10min，于室温（25℃）下晾干；f）离心管中加入20µL DEPC水，将RNA沉淀充分溶解；
步骤二：倍比稀释病毒标准品，使用Trizol试剂提取不同稀释倍数的病毒标准品中的RNA：将病毒标准品（病毒标准品即F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2的病毒液）用PBS缓冲液（购自赛默飞）稀释至1×106CCID50/mL后，继续用PBS缓冲液进行倍比稀释至1×10- 1CCID50/mL；参照步骤一对不同稀释倍数的病毒标准品进行RNA提取；
步骤三：RNA的RT-qPCR荧光定量检测：按照HiScript II U+one step Qrt-pcrProbe Kit（Vazyme，货号：7E501B1）说明书进行RT-qPCR荧光定量体系的配置；使用RT-qPCR荧光定量体系对步骤一和步骤二获得的RNA进行RT-qPCR荧光定量检测，检测引物为（5’-3’）MuV-N-F3（ACCTTGCTTTGTTGGAGGCT，SEQ ID NO.1）、MuV-N-R3（ACCGACTCCCATGGCATAAC，SEQ ID NO.2）和MuV-N-P3（CTTTGCACCCGGGGGCTACC，SEQ ID NO.3）；根据不同稀释倍数的病毒标准品测得的CT值，建立标准曲线，并根据血液或者组织样本品测得的CT值，计算样本的病毒载量。
由表1~2可知，尾静脉、肌肉和滴鼻注射腮腺炎病毒的129小鼠在各器官和血液中均未检测到较高剂量的腮腺炎病毒；肌肉和滴鼻注射腮腺炎病毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠只有血液中有少量的病毒增殖，各脏器组织中无病毒增殖；尾静脉注射腮腺炎病毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液和各脏器样本中均有较高的病毒载量。可见，尾静脉注射腮腺炎病毒的IFNα/βR-/-小鼠具备作为腮腺炎病毒攻毒动物模型，用于腮腺炎病毒的毒株毒力评价以及腮腺炎病毒疫苗有效性评价的潜力。并且，攻毒后14D，尾静脉注射腮腺炎病毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的淋巴结、脾脏、肝脏、心脏和肾脏均有较高的病毒载量，但是均显著低于血液中的病毒载量，因此，可选择血液作为腮腺炎病毒攻毒动物模型的最佳受检样本，以血液作为受检样本还具备操作简单，可连续取样进行动态监测的优势。
表1 不同注射方式免疫129小鼠后的病毒组织分布（lgCCID50/mL）
Figure 36831DEST_PATH_IMAGE001
表2 不同注射方式免疫IFNα/βR-/-基因缺失小鼠后的病毒组织分布（lgCCID50/mL）
Figure 219551DEST_PATH_IMAGE002
注：表1~2中，I.M.为肌肉注射，I.N.为滴鼻注射，I.V.为尾静脉注射。
实施例2：攻毒剂量对腮腺炎病毒攻毒后发病情况的影响
实验动物为IFNα/βR-/-基因缺失小鼠（4~6周龄，来自华中农业大学），实验组共设置4组，每组4只，4组实验组均为尾静脉注射F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F的病毒液进行攻毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠，攻毒剂量分别为1×103CCID50/只、1×104CCID50/只、1×105CCID50/只1×106CCID50/只。攻毒后3D、7D、14D和28D采集实验组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的血液进行荧光定量PCR（荧光定量PCR参见实施例1），通过荧光定量PCR检测实验组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的血液中腮腺炎病毒的病毒载量，检测结果见表3。
由表3可知，攻毒后3D，尾静脉注射腮腺炎病毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的血液中病毒无明显增殖，攻毒后7D，尾静脉注射腮腺炎病毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的血液中病毒载量明显升高，并在攻毒后14D达到高峰，在攻毒后28D仍处于较高水平。可见，通过对IFNα/βR-/-小鼠尾静脉注射腮腺炎病毒制备腮腺炎病毒攻毒动物模型时的各攻毒剂量之间无明显的病毒梯度。
表3 不同注射剂量免疫IFNα/βR-/-基因缺失小鼠后血液中病毒载（lgCCID50/mL）
Figure 264867DEST_PATH_IMAGE003
实施例3：腮腺炎病毒攻毒动物模型用于毒株毒力的评价
评价对象为A基因型腮腺炎病毒毒株JL、F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F、F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2和G基因型腮腺炎病毒毒株MuV（G genotype），实验动物为IFNα/βR-/-基因缺失小鼠（4~6周龄，来自华中农业大学），实验组共设置4组，每组4只，4组实验组分别为尾静脉注射A基因型腮腺炎病毒毒株JL、F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F、F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2和G基因型腮腺炎病毒毒株MuV（G genotype）的病毒液进行攻毒的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠，攻毒剂量为1×103CCID50/只。攻毒后14D采集实验组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的血液进行荧光定量PCR（荧光定量PCR参见实施例1），通过荧光定量PCR检测实验组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的血液中腮腺炎病毒的病毒载量，检测结果见表4。
由表4可知，攻毒后14D，尾静脉注射A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2这两个减毒株的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液中的病毒载量显著低于尾静脉注射F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F和G基因型腮腺炎病毒毒株MuV（G genotype）这两个野生株的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液中的病毒载量，说明F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F和G基因型腮腺炎病毒毒株MuV（G genotype）这两个野生株的毒力强于A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2这两个减毒株，腮腺炎病毒攻毒动物模型可用于腮腺炎病毒毒株的毒力评价。另外，表4的结果证明了F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F和G基因型腮腺炎病毒毒株MuV（G genotype）这两个野生株可作为免疫攻毒试验的攻击毒株，符合免疫攻毒实验攻毒株的选择要求，更具有代表性。
表4 不同毒株免疫IFNα/βR-/-基因缺失小鼠后的病毒载量（lgCCID50/mL）
Figure 925656DEST_PATH_IMAGE004
实施例4：腮腺炎病毒攻毒动物模型用于腮腺炎病毒疫苗有效性的评价
评价对象为A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2的病毒液，由于A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2是减毒株，因此，两者的病毒液可作为腮腺炎病毒减毒活疫苗用于有效性评价，实验动物为IFNα/βR-/-基因缺失小鼠（4~6周龄，来自华中农业大学），实验组共设置3组，每组4只，其中2组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠先分别腹腔注射A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2的病毒液进行第一次免疫，第一次免疫剂量为1×104CCID50/只，第一次免疫7D后进行第二次免疫，第二次免疫计量与第一次免疫一致，剩余1组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠于同日腹腔注射同体积DMEM培养基（购自Gibco公司）作为阴性对照，免疫结束后，对3组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠尾静脉注射F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F的病毒液进行攻毒，攻毒剂量为1×103CCID50/只。攻毒前0D，攻毒后7D、14D采集实验组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的血液进行荧光定量PCR（荧光定量PCR参见实施例1），通过荧光定量PCR检测实验组IFNα/βR-/-基因缺失小鼠的血液中腮腺炎病毒的病毒载量，检测结果见表5。
由表5可知，攻毒后，尾静脉注射A基因型腮腺炎病毒毒株JL和F基因型腮腺炎病毒毒株QS-F-SH2这两个减毒株的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液中的病毒载量显著低于尾静脉注射DMEM培养基的IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液中的病毒载量，这是因为免疫腮腺炎减毒株后，IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内中和抗体产生，在受到腮腺炎病毒野生株的攻击后，中和抗体与腮腺炎病毒野生株发生中和反应，阻止病毒在体内的增殖。此结果说明腮腺炎病毒攻毒动物模型可准确评估腮腺炎病毒疫苗的有效性。
表5 不同毒株免疫IFNα/βR-/-基因缺失小鼠后的病毒载量（lgCCID50/mL）
Figure 5607DEST_PATH_IMAGE005
注：表5中，“LOD”为低于检测限。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 北京赛尔富森生物科技有限公司
<120> 一种腮腺炎病毒攻毒动物模型及其建立方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
accttgcttt gttggaggct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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Claims (12)

1.一种评价腮腺炎病毒疫苗有效性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
免疫步骤：使用腮腺炎病毒疫苗对IFNα/βR-/-基因缺失小鼠进行免疫；
攻毒步骤：免疫结束后，给IFNα/βR-/-基因缺失小鼠静脉注射腮腺炎病毒进行攻毒；
评价步骤：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内的腮腺炎病毒载量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腮腺炎病毒在IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内的攻毒剂量为1×103CCID50/只~1×106CCID50/只。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
免疫步骤：使用腮腺炎病毒疫苗对IFNα/βR-/-基因缺失小鼠进行免疫；
攻毒步骤：免疫结束后，给IFNα/βR-/-基因缺失小鼠尾静脉注射腮腺炎病毒进行攻毒；
评价步骤：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内的腮腺炎病毒载量。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述评价步骤为：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液、淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和/或肺内的腮腺炎病毒载量。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述评价步骤为：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液内的腮腺炎病毒载量。
6.权利要求1~5任一项所述的方法在评价腮腺炎病毒疫苗有效性中的应用。
7.一种评价腮腺炎病毒毒株毒力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
攻毒步骤：给IFNα/βR-/-基因缺失小鼠静脉注射腮腺炎病毒进行攻毒；
评价步骤：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内的腮腺炎病毒载量。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述腮腺炎病毒在IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内的攻毒剂量为1×103CCID50/只~1×106CCID50/只。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
攻毒步骤：给IFNα/βR-/-基因缺失小鼠尾静脉注射腮腺炎病毒进行攻毒；
评价步骤：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠体内的腮腺炎病毒载量。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述评价步骤为：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液、淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、心脏和/或肺内的腮腺炎病毒载量。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述评价步骤为：攻毒结束后，检测IFNα/βR-/-基因缺失小鼠血液内的腮腺炎病毒载量。
12.权利要求7~11任一项所述的方法在评价腮腺炎病毒毒株毒力中的应用。
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