CN110755606A - 一种类nadc30 prrsv耐热保护剂减毒活疫苗及其制备与应用 - Google Patents

一种类nadc30 prrsv耐热保护剂减毒活疫苗及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗及其制备与应用，其特征在于：疫苗毒株为自然重组PRRSV，骨架为HP‑PRRSV MLV，同时具有NADC30毒株131个氨基酸缺失的分子特征，重组位置位于非结构蛋白编码区（Nsp2）的1737nt‑3506nt。通过将一株自然重组PRRSV在MARC‑145细胞体外传代，获得性能稳定低毒力种子液并与耐热保护剂混合制备而成；采用肌肉注射免疫，安全无毒副作用，且能产生对HP‑PRRSV及NADC30毒株的攻毒保护，具有良好的市场应用前景。

Description

一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗及其制备与应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗及制备与应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍、生长猪呼吸道疾病为主要特征的猪传染病，对全世界的养猪业造成了巨大经济损失。特别是2006年暴发高致病性HP-PRRSV，其临床发病率与死亡率高，给我国养猪业带来前所未有经济损失。自2012年开始，国内陆续分离到与美国NADC30基因同源性较高的毒株，由于与NADC30毒株遗传进化关系较近，国内现将该类病毒统称为类NADC30毒株（NADC30-like毒株），发病猪场临床症状主要表现为：母猪流产等繁殖障碍，保育及生长育肥猪的严重呼吸道症状。2014年以来，类NADC30毒株在我国流行呈现出加剧趋势，目前有大量研究报道，该类毒株与HP-PRRSV已成为猪场两大优势流行毒株，增加了毒株复杂性，给我国生猪养殖带来了新的挑战。
目前，市场上的商品化PRRSV疫苗主要有两大类：灭活疫苗和弱毒疫苗。疫苗免疫是防控PRRSV感染常用手段之一，但两类疫苗存在优缺点。灭活疫苗具有较高安全性，不存在毒力返强的风险，但其免疫效力与弱毒疫苗相比，诱导中和抗体水平低，产生的免疫效果不确实，且免疫剂量大，副反应作用大，也不能有效激发机体的细胞免疫，从而难以有效控制PRRSV的发生及流行；弱毒疫苗在PRRSV防控中发挥重要作用，但是弱毒苗对异源毒株提供部分交叉保护效力，特别是NADC30-like毒株的出现，由于它易于重组的特性产生了大量的重组毒株，NADC30-like 毒株基因组间同源性较低，即使是同一谱系中的不同毒株间仍有较大差异，现有疫苗难以对其产生充分的交叉保护。同时，弱毒疫苗不宜常温保存运输，因此，开发一种更加安全、高效、耐热保护、特别是对现在流行NADC30-1ike和HP-PRRSV两大优势毒株提供理想保护效果的疫苗迫在眉睫。
发明内容
PRRSV类NADC30毒株的基因组特征主要表现为非结构蛋白区Nsp2存在“111+1+19”的氨基酸缺失分子特征，具有高度变异性和更高的重组频率，重组模式复杂多样，但重组的位置主要集中于非结构蛋白区，基于上述特点，本发明公开了如下的技术内容：
一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗，其特征在于：疫苗毒株为自然重组PRRSV，骨架为HP-PRRSV MLV，同时具有NADC30毒株131个氨基酸缺失的分子特征，重组位置位于非结构蛋白编码区（Nsp2）的1737nt-3506nt，具有SEQ ID NO:1序列：
PSLLPLECVQGCCEHKGGLSSPSAVEVSGFDPACLDWLAKVMHLPSSAIPAALAEMSGNFGHSAPPVPVVWTVSQFFARHSGGEDPDQVCLKKIVSLCQLLESCCCSQNKANPVTPEEVRRKIDQYLRGAVSLEECLARLEKARPPSILDTSFDWDVVLPGVGVVAQAAKLPLTNQCHAPVAVVAQRPPPEFQSRKAESVRSLPENRPLPAPRRKIRSECGSLASLGGNFPDSWEDLAGGPFHSPVLPESVARSNGPVPVPAPRRTVSQLKPSPITSTPVPAPRCGLQHVGGMNLAVGTLACQDELLDLPASSQTEYEALSLPQSEDALVVRGGEVEEALSEASGMPNDIRLTPVSSSSSLSSVEITRPKYSAQAIIDTGGPCCGHLQEVKEKYLSVMREACDATKLDDPATQEWLSRMWDRVDMLTWRSTSMFQAPFILADKFKFLPKMILETPPPYPCGFVMMPRTPAPSVGAESDLTVGSVATEDVPRILGKIGDTDELLDRGPSAPSKGEPVCDQPAKDPRMSPRDSDESIIVPPADTGGVGSFTDLPSSDGVDVDGGGPLRTVKTKAERLLDQLSCQVFSLVSH
本发明进一步公开了一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗制备方法，其特征在采用体外细胞致弱方法，用MARC-145细胞体外传代至F40即为种子液，同时与以明胶为主要成分的耐热冻干保护剂混合制备。
本发明更进一步公开了类NADC30 PRRSV减毒活疫苗在制备有效预防HP-PRRSV及NADC30 PRRSV发生方面的应用，特别是降低生猪临床发病率应用。实验结果显示：本发明安全无毒副作用，可以产生对NADC30及HP-PRRSV毒株的攻毒保护，相比对照组其保护率分别为100%和80%，显著降低临床发病率，提高生猪免疫保护效力。同时实现了常温保存与运输。
本发明主要解决了现有商品化疫苗无法提供对NADC30毒株免疫交叉保护问题，重点考察了候选疫苗毒株安全性与广谱免疫性能，主要难点在于候选疫苗毒株筛选与减毒疫苗毒株代次确定。
本发明更加详细的描述如下：
一、材料与方法
1、主要试剂
MARC-145细胞购自南京科佰生物细胞库；PRRSV N蛋白单克隆抗体、异硫氯酸荧光素（FITC）-山羊抗小鼠IgG，购自天津联星生物公司；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；DEPC、PMD-18T载体、dNTP、RNase Inhibitor、M-MLV、Taq酶、随机引物等为大连宝生物工程有限公司产品。
2、MARC-145细胞传代培养
将MARC-145细胞从液氮灌中取出，放置常温复苏，接种于透气盖细胞培养瓶，待细胞长至单层后，弃掉上清，PBS洗涤2次，加入胰酶消化，晃动细胞培养瓶，充分作用，显微镜下观察，消化至单个细胞，加入DMEM培养液，反复吹打，按1传3传代培养。
3、种子液制备及效价检测
将候选疫苗毒株接种到单层MARC-145细胞，37℃吸附1h，弃上清，加入含血清的DMEM培养液，放置37℃、5% CO2培养箱培养48h后，应用倒置显微镜定时观察细胞CPE，收获培养物反复冻融，按上述步骤传代至F40，即制备本发明种子液。
将种子液接种 MARC-145 细胞单层，37℃培养 48h～60h，当70 %以上细胞出现CPE时收获病毒液。将收获的病毒液使用DMEM 培养基进行10×系列稀释，接种于96孔板，每个稀释度接种8个孔，0.1 mL/孔，同时设正常细胞对照，于37℃ 5% CO2培养2 d～3 d，观察CPE，使用Reed-Muench公式计算TCID50。制备3批次种子液并分别进行效价测定。
4、耐热保护剂减毒活疫苗制备
将收获的种子液使用 DMEM 稀释后，用以明胶为主要成分的耐热冻干保护剂混合，定量分装后加盖，置于冻干机内进行冷冻真空冻干。每批次分别抽样进行病毒含量TCID50测定和无菌检验。
5、耐热保护剂减毒活疫苗安全性试验
取制备的3批减毒活疫苗，分别接种28d日龄仔猪（PRRSV抗原与抗体阴性），每批次5头/组，每头猪接种2 m L (107.0TCID50/m L)。同时设空白对照（3头/组），只接种疫苗稀释液2mL/头。疫苗接种后连续 14 d 测量动物体温，观察有无临床可见异常。疫苗接种当日和接种后 14 d 称量实验动物体重。试验结束所有仔猪剖检，观察肺脏有无病变，并制备病理切片。
6、耐热保护剂减毒活疫苗免疫效力试验
选取21d日龄仔猪（PRRSV抗原与抗体阴性），实验1-4组，每组 5 头，分别肌肉免疫接种减毒活疫苗，2mL (105.0 TCID50/m L)/头，同时设3头不接种疫苗作为对照。疫苗接种后每周采血监测其抗体水平。接种后28 d，实验1和3组用PRRSV NADC30野毒（分离毒株）攻毒，实验2和4组用HP-PRRSV野毒（ CAU0680）攻毒，其中每头猪肌肉注射 1m L，滴鼻2mL(104.0TCID50/m L)。空白对照正常饲养。试验周期为21d，攻毒后连续观察各组猪的临床症状并记录直肠温度；于试验周期结束后安乐死存活猪，观察剖检变化，统计攻毒保护率。
二、结果与分析
（1）种子液 TCID50检测结果
对制备3批次种子液分别采用Reed-Muench方法进行TCID50测定，经测定病毒效价分别为107.6 TCID50/mL、 107.7TCID50/mL和 107.5 TCID50/mL，符合种子液含量要求。
（2）耐热保护剂减毒活疫苗病毒含量及无菌检验
对制备3批次减毒活疫苗分别采用Reed-Muench方法进行TCID50测定，测得3 批冻干减毒活疫苗每头份病毒含量分别为 105.9 TCID50、105.8TCID50和105.8TCID50，并且无菌和支原体检验均合格。
（3）耐热保护剂减毒活疫苗安全性试验
仔猪接种2mL（107.0TCID50/mL）耐热保护剂减毒活疫苗后，试验组和对照组的仔猪均无异常反应，体温正常，实验组和对照组增重无明显差异；剖检观察肺脏正常无实变，无病理组织学改变。
（4）耐热保护剂减毒活疫苗效力试验
疫苗接种后第7d进行抗体ELISA 检测，第14 d 实验1-4组血清抗体阳转率均100 %。接种后 28 d 进行攻毒，第1组和第3组所有实验猪体温均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察肺脏基本正常，无明显病理组织学改变；第 2组中出现1头猪体温升高（>41℃），表现出轻微精神沉郁与呼吸困难等临床症状，剖检肺脏出现轻度间质性肺炎，病理组织学主要表现为局部组织炎性细胞浸润；第4组所有实验猪体温均升高，表现出明显呼吸困难等临床症状，剖检肺脏出现大面积实变，病理组织学均表现为肺泡间隔增
表1 耐热保护剂减毒活疫苗免疫效力试验保护率
Figure 569738DEST_PATH_IMAGE001
三、结论
本发明安全无毒副作用，可以产生对NADC30及HP-PRRSV毒株的攻毒保护，相比对照组其保护率分别为100%和80%，显著降低临床发病率，提高生猪免疫保护效力。同时实现了常温保存与运输。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明所用原料及试剂均有市售。PRRSV HP-PRRSV（CAU0680）购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；NADC30临床分离毒株（参见-《天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及遗传演化分析》-2018年硕士论文中第四章：病毒分离与鉴定部分），然后由本实验室分离和保存；也可以参见下面方法进行分离：
（1）取新鲜PRRS阳性（NADC30 RT-PCR 检测阳性）样品，剪碎、组织处理器拍打，4℃、6000rpm离心 10 min；取少量上清液反复冻融3次，0.22μm 滤膜过滤除菌；
（2）接种单层的PAMs细胞，37℃吸附1h，弃上清，加入含血清的DMEM 培养液，放置37℃、5% CO2培养箱培养48h后；
（3）应用倒置显微镜定时观察细胞CPE，连续观察5d，收获培养物冻融，反复培养3代，观察细胞CPE；
（4）将收获的细胞培养物，按照试剂盒说明书步骤提取病毒总RNA，按常规RT-PCR检测方法进行检测并基因测序。
实施例2
耐热保护剂减毒活疫苗制备
（1）将种子液接种 MARC-145 细胞单层，37℃培养 48h～60h，当70 %以上细胞出现CPE时收获病毒液。
（2）将收获的病毒液进行10×系列稀释，接种于96孔板，每个稀释度接种8个孔，0.1 mL/孔，同时设正常细胞对照，于37℃ 5% CO2培养2 d～3 d，测定TCID50。
（3）将收获的种子液调整浓度，用以明胶为主要成分的耐热冻干保护剂混合，定量分装后加盖，置于冻干机内进行冷冻真空冻干。
（4）每批次分别抽样进行病毒含量TCID50测定和无菌检验。
实施例3
类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗的临床应用
（1）天津地区某猪场一栋14日龄仔猪（约100头），分别肌肉免疫接种减毒活疫苗，2mL(105.0 TCID50/m L)/头，同时设不接种疫苗作为对照。
（2）疫苗接种后每日观察免疫和空白组所有仔猪的临床反应（体温、精神状态、临床发病等）。
（3）所有实验免疫仔猪体温均正常，未表现出任何临床症状；相比试验免疫组，空白对照组的约5%仔猪出现体温均升高，表现出明显呼吸困难等临床症状，经检测为PRRSV阳性。
（4）类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗，可以产生PRRSV毒株的保护，相比空白对照组其保护率为100%，显著降低临床发病率。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津农学院
<120> 一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗及其制备与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 589
<212> PRT
<213> 耐热保护剂减毒活疫苗
<400> 1
Pro Ser Leu Leu Pro Leu Glu Cys Val Gln Gly Cys Cys Glu His Lys
1 5 10 15
Gly Gly Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Glu Val Ser Gly Phe Asp Pro
20 25 30
Ala Cys Leu Asp Trp Leu Ala Lys Val Met His Leu Pro Ser Ser Ala
35 40 45
Ile Pro Ala Ala Leu Ala Glu Met Ser Gly Asn Phe Gly His Ser Ala
50 55 60
Pro Pro Val Pro Val Val Trp Thr Val Ser Gln Phe Phe Ala Arg His
65 70 75 80
Ser Gly Gly Glu Asp Pro Asp Gln Val Cys Leu Lys Lys Ile Val Ser
85 90 95
Leu Cys Gln Leu Leu Glu Ser Cys Cys Cys Ser Gln Asn Lys Ala Asn
100 105 110
Pro Val Thr Pro Glu Glu Val Arg Arg Lys Ile Asp Gln Tyr Leu Arg
115 120 125
Gly Ala Val Ser Leu Glu Glu Cys Leu Ala Arg Leu Glu Lys Ala Arg
130 135 140
Pro Pro Ser Ile Leu Asp Thr Ser Phe Asp Trp Asp Val Val Leu Pro
145 150 155 160
Gly Val Gly Val Val Ala Gln Ala Ala Lys Leu Pro Leu Thr Asn Gln
165 170 175
Cys His Ala Pro Val Ala Val Val Ala Gln Arg Pro Pro Pro Glu Phe
180 185 190
Gln Ser Arg Lys Ala Glu Ser Val Arg Ser Leu Pro Glu Asn Arg Pro
195 200 205
Leu Pro Ala Pro Arg Arg Lys Ile Arg Ser Glu Cys Gly Ser Leu Ala
210 215 220
Ser Leu Gly Gly Asn Phe Pro Asp Ser Trp Glu Asp Leu Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Phe His Ser Pro Val Leu Pro Glu Ser Val Ala Arg Ser Asn Gly
245 250 255
Pro Val Pro Val Pro Ala Pro Arg Arg Thr Val Ser Gln Leu Lys Pro
260 265 270
Ser Pro Ile Thr Ser Thr Pro Val Pro Ala Pro Arg Cys Gly Leu Gln
275 280 285
His Val Gly Gly Met Asn Leu Ala Val Gly Thr Leu Ala Cys Gln Asp
290 295 300
Glu Leu Leu Asp Leu Pro Ala Ser Ser Gln Thr Glu Tyr Glu Ala Leu
305 310 315 320
Ser Leu Pro Gln Ser Glu Asp Ala Leu Val Val Arg Gly Gly Glu Val
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Ser Glu Ala Ser Gly Met Pro Asn Asp Ile Arg Leu
340 345 350
Thr Pro Val Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Val Glu Ile Thr Arg
355 360 365
Pro Lys Tyr Ser Ala Gln Ala Ile Ile Asp Thr Gly Gly Pro Cys Cys
370 375 380
Gly His Leu Gln Glu Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Val Met Arg Glu
385 390 395 400
Ala Cys Asp Ala Thr Lys Leu Asp Asp Pro Ala Thr Gln Glu Trp Leu
405 410 415
Ser Arg Met Trp Asp Arg Val Asp Met Leu Thr Trp Arg Ser Thr Ser
420 425 430
Met Phe Gln Ala Pro Phe Ile Leu Ala Asp Lys Phe Lys Phe Leu Pro
435 440 445
Lys Met Ile Leu Glu Thr Pro Pro Pro Tyr Pro Cys Gly Phe Val Met
450 455 460
Met Pro Arg Thr Pro Ala Pro Ser Val Gly Ala Glu Ser Asp Leu Thr
465 470 475 480
Val Gly Ser Val Ala Thr Glu Asp Val Pro Arg Ile Leu Gly Lys Ile
485 490 495
Gly Asp Thr Asp Glu Leu Leu Asp Arg Gly Pro Ser Ala Pro Ser Lys
500 505 510
Gly Glu Pro Val Cys Asp Gln Pro Ala Lys Asp Pro Arg Met Ser Pro
515 520 525
Arg Asp Ser Asp Glu Ser Ile Ile Val Pro Pro Ala Asp Thr Gly Gly
530 535 540
Val Gly Ser Phe Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Gly Val Asp Val Asp
545 550 555 560
Gly Gly Gly Pro Leu Arg Thr Val Lys Thr Lys Ala Glu Arg Leu Leu
565 570 575
Asp Gln Leu Ser Cys Gln Val Phe Ser Leu Val Ser His
580 585

Claims (3)

1.一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗，其特征在于：疫苗毒株为自然重组PRRSV，骨架为HP-PRRSV MLV，同时具有NADC30毒株131个氨基酸缺失的分子特征，重组位置位于非结构蛋白编码区（Nsp2）的1737nt-3506nt。
2.权利要求所述一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗制备方法，其特征在采用体外细胞致弱方法，用MARC-145细胞体外传代至F40即为种子液，同时与以明胶为主要成分的耐热冻干保护剂混合制备。
3.权利要求所述一种类NADC30 PRRSV耐热保护剂减毒活疫苗在预防HP-PRRSV及NADC30 PRRSV临床发病率方面的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110878379A (zh) * 2019-12-11 2020-03-13 天津农学院 一种类nadc30 prrsv减毒活疫苗配套鉴别检测方法及其应用

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