CN109867713B

CN109867713B - 一种犬瘟热基因工程亚单位疫苗

Info

Publication number: CN109867713B
Application number: CN201910270686.9A
Authority: CN
Inventors: 单虎; 张洪亮; 盖春云; 解倩倩; 秦志华; 张传美; 杨瑞梅
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN109867713A; CN108586585A

Abstract

本发明提供一种犬瘟热亚单位疫苗及其制备方法和应用，本发明所提供的犬瘟热亚单位疫苗，包括有疫苗佐剂和抗原，所述的抗原是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的H蛋白。本发明的犬瘟热亚单位疫苗具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，对犬瘟热强毒GN株攻毒的水貂具有非常好的保护效果，免疫后水貂疫苗，能够有效的预防水貂犬瘟热的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

Description

一种犬瘟热基因工程亚单位疫苗

技术领域

本发明属于兽医生物制品制备技术领域，具体涉及一种犬瘟热亚单位疫苗的制备方法和应用。

背景技术

中国毛皮动物养殖业始于1965年，到现在已有50年的发展史。在我国毛皮动物养殖产业发展很快，饲养种类不断增多，数量逐年增大，主要集中山东、辽宁、黑龙江、河北等地，饲养的主要品种有水貂、银狐、貉子等。据不完全统计，目前全国拥有毛皮动物养殖户上万家，各种毛皮动物存栏约4000万只，其中水貂就有2000万只，已经成为一个名副其实的养殖大国。

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由副粘病毒科的犬瘟热病毒 (Caninedistemper virus，CDV)引起的犬科、鼬科和部分浣熊科动物的急性、热性、高度接触性传染病。其主要特征为双相型发热，炎、鼻、消化道等黏膜炎症，以及卡他性肺炎、皮肤湿疹和神经症状。犬瘟热病毒属于副粘病毒科(paramyxoviridae family)麻疹病毒属(Morbillivirus)，病毒基因组为不分节段的负链RNA，病毒粒子呈圆形或不规则形，有时也呈长丝状，直径120～300nm。粒子中心含有宽径15～17nm的螺旋形核衣壳。1905年Carre首次发现犬瘟热病毒，故本病也称carre病。先后在银黑狐、貉、紫貂、北极狐等毛皮动物中发生犬瘟热。现已有报道证实在患Pagets疾病的病人组织中检出了犬瘟热病毒核酸。可见犬瘟热的宿主范围在不断地扩大，感染谱在日益增多。近年来，随着我国军犬、警犬、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加，以及异地交流的增多，犬瘟热在我国犬中的发病率和致死率均有升高的趋势，而且临床表现也与以往有所不同。该病是目前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一，因此受到广泛重视。

犬瘟热病没有特效的药物进行治疗，所以早期预防和诊断就显得格外重要。CDV灭活疫苗因所产生的抗体下降较快、抗原性差、诱导体液免疫的时间短等缺点。随着弱毒疫苗的广泛使用，也发现了存在着许多缺陷，它能引起免疫抑制和一定程度上的神经系统损害，此外，由于母源抗体的干扰和病毒基因的突变等因素，免疫犬也未能得到完全保护，许多国家均有免疫群体爆发犬瘟热的报道。研究新的免疫力强的疫苗势在必行。研究开发以基因工程疫苗为主的兽用新型疫苗是本世纪的主导方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种犬瘟热亚单位疫苗及其制备方法和应用，具有安全性高和良好的免疫原性的特点，达到预防犬瘟热目的，提高免疫效力，降低疫苗成本。从而解决灭活疫苗免疫效果维持时间短，成本较高等问题。

本发明所提供的犬瘟热亚单位疫苗，包括有疫苗佐剂和抗原，所述的抗原是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的H蛋白；

进一步的，所述的H蛋白通过杆状病毒来表达；

作为优选，所述的H蛋白的浓度不低于8μg/mL；

本发明所提供的疫苗，其中疫苗佐剂为烯丙基蔗糖交联丙烯酸聚合物溶液和丙三醇溶液混合配制的复合佐剂；

本发明再一个方面提供用于重组表达上述H蛋白的杆状病毒。

本发明的犬瘟热亚单位疫苗具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，对犬瘟热强毒GN株攻毒的水貂具有非常好的保护效果，免疫后水貂疫苗，能够有效的预防水貂犬瘟热的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

附图说明

图1：CDV QN-1株与CDV3株H基因序列比对结果图；

图2：CDV QN-1株与标准株H基因序列核苷酸比对结果图；

图3：CDV QN-1株H基因序列比对结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：犬瘟热病毒H基因的克隆

在山东省诸城市某养殖场的水貂，约60日龄左右；未免疫水貂犬瘟热疫苗产品，水貂群出现疑似犬瘟热症状，眼、鼻有明显分泌物，食欲减退、鼻镜干燥，但未出现水貂死亡病例，怀疑受到水貂犬瘟热病毒弱毒株的感染。对从该养殖场获得的样品进行病毒筛选，最终获得了一株犬瘟热病毒Caninedistempervirus CDV QN-1株,于2018年4 月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:V201814；

分子生物学鉴定根据扩增N基因高度保守序列的特异性引物，预期扩增长度为265bp；一对扩增H基因编码序列(CDS)的特异性引物，预期扩增长度为1921bp(见表1)。引物由北京赛百盛生物工程公司合成，用ddH₂O稀释为终浓度为20pmol/μL，置-20℃保存。

表1：N基因和H基因引物序列

^a序列在CDV Onderstepoort(AF305419)全基因组中的位置。

H基因PCR扩增产物用DNA胶回收试剂盒纯化回收，按操作说明书进行。对EP管进行编号，得到胶回收产物。将回收鉴定后的目的基因片段按照10μL连接反应体系与pMD18-T载体连接，操作按试剂盒说明书进行，整个过程要在冰浴上进行。连接体系吹打混匀后，将其置于16℃连接2h。连接后马上进行转化，转化实验的操作步骤参照分子生物学大实验。采用E.Z.N.A.^TM Plasmid Mini Kit I(质粒小量提取试剂盒I型)提取质粒，按试剂盒说明书进行操作。

重组质粒的PCR鉴定：取重组质粒1μL作为模板，利用H基因扩增引物F1，R1进行PCR扩增。反应条件：95℃5min；94℃45s， 54℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，取5μL PCR产物进行凝胶电泳检测。将重组质粒进行PCR鉴定，得到大小约1921bp左右的目的片段，与预期大小一致。

重组质粒的酶切鉴定：利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，重组质粒为PCR鉴定阳性。置37℃水浴中酶切反应3h，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用Alpha凝胶成像系统观察结果。

将重组质粒用BamHⅠ和HindⅢ酶切得到两个片段分别长约 2690bp和1921bp左右，与预期大小相一致。

3)H基因的测序

取菌液PCR和双酶切鉴定均为阳性的重组质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对确认所测序列的正确性。

测序结果表明CDV QN-1病毒株的H基因的氨基酸序列(氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1)与国内外报道的分离株有较大差异，与CDV3相比有14处发生了变异， P10-A10，P18-A18，Q29-E29，Q215-E215，A269-T269，S295-L295，A436-G436，Q441-E441，A457-G457，Y525-S525，D526-V526， H540-D540，P550-S550，P583-A583，显示了病毒的变化。其中Y525-S525和D526-V526这两个突变位点发生在宿主细胞结合的受体关键区域，会影响CDV与宿主细胞的结合，这很可能是导致CDV QN-1毒力降低的原因。其他相关特异性变异与毒株致病性研究较少，不排除其相关性。

实施例2：犬瘟热病毒H基因重组表达病毒的构建

本实施例所需要的毒株、菌株、细胞与质粒如下：

CDV QN-1株H基因片段、Vero细胞和pFastBac1质粒均由本实验室保存；大肠杆菌E.coli DH5a、购自宝生物工程(大连)有限公司；Sf9昆虫细胞有中国动物卫生与流行病学控制中心馈赠。

1、重组表达载体pFastBac1-Head Domain的构建

1)设计2对表达引物(F2、R2)，并在引物5’端引入BamHI和XhoI 酶切位点和保护性碱基，预期片段大小为1921bp，PCR扩增Head Domain基因，目的片段与表达载体pFastBac1的双酶切，将胶回收的基因片段与pFastBac1载体在冰浴中连接，连接体系为10μL，连接体系混匀后，将其置于16℃过夜。连接产物10μL加入至100μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰中放置30min；42℃水浴中作用90s，迅速在冰浴中冷却1-2min；加入800μL预温至37℃的LB(不含抗生素)液体培养基，37℃220rpm培养45min，离心收集菌体，用 200μLLB液体培养基重悬细菌后均匀涂布于Amp+LB平板上，37℃温箱中倒置培养过夜。

2)重组表达载体的鉴定

在转化菌培养平板上随机挑取6个单菌落，接种到5mL含50μg/mL Amp+的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒 DNA。

将重组质粒作10倍稀释，取2μL做为模板，上游引物和下游引物各取0.5μL进行PCR扩增混匀后置PCR扩增仪中，进行如下循环：95℃ 5min；94℃40s，56℃40s，72℃1min，35cycles；72℃10min。 PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将提取的重组质粒，用BamHⅠ和XhoI双酶切均匀混合后，于37℃水浴4h，1％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，同时用空白质粒载体作为阴性对照。

将重组原核表达质粒pFastBac1-H经BamHⅠ、XhoI双酶切后， 1％琼脂糖凝胶电泳均出现2条特异性条带，所得条带大小分别为 4775bp和1921bp，与预期大小相符，将鉴定为阳性的重组质粒送华大基因科技股份有限公司测序。与GenBank已发表的序列进行同源性比较，将测序确定为阳性的质粒保存备用。

2、pFastBac1-H在Sf9昆虫细胞中的表达和鉴定

1)重组穿梭杆粒pFastBac1-H转染Sf9昆虫细胞

具体的转染步骤如下：

取生长状态良好的昆虫细胞，进行活细胞计数，计算其成活率(细胞成活率要高于95％)。

取2mL生长状态良好的昆虫细胞，细胞计数约为2×10⁶加入到六孔板中，让细胞贴壁生长至少1h，并设立阴性对照。

准备两个灭菌的1.5mL离心管，一个离心管加入100μL的无血清培养基和2μL的重组杆粒(约1-2ng)，并将其混匀。另一个离心管中加入100μL无血清培养基和的8μLCellfectin Reagent脂质体转染试剂，轻轻将其混匀。在两个离心管上分别做好标记，于室温静置15-20 min。

将两个离心管中的混合液混在一起，并轻轻混合均匀，于室温温育30min，然后在上述混合液中加入预热的无血清培养基800μL混合均匀，然后将混合液一滴一滴的轻轻滴在预先贴壁的Sf9昆虫细胞上，此过程一定要缓慢，之后置于27℃培养箱中避光培养5h。

培养5h以后，吸掉六孔板中的培养基，加入预热的新鲜 Sf-900TMⅢSFM(1×)无血清培养基，然后置于27℃培养箱中避光培养3-5d，直至细胞出现病变为止。

将鉴定正确的重组穿梭杆粒转染Sf9昆虫细胞以后，转染成功的细胞出现明细的细胞病变：细胞变大、变圆、有的细胞破裂等。而转入空载体的细胞生长良好。

2)重组杆状病毒的收获

细胞培养3-5d以后，如果转染成功，会看到明显的细胞病变，细胞直径会增大，细胞核充满整个细胞，有的细胞会出现破裂，最后，细胞从平板上脱落下来。此时可以轻轻吹打六孔板中的细胞，收集细胞悬液，转入到无菌的10mL离心管中于4℃保存，如果要长期保存，可将其置于-80℃冰箱中，此毒即为P1代毒。

3)重组杆状病毒的扩增

收集P1代毒当天，取生长良好的Sf9昆虫细胞2mL，细胞计数约2x10⁶个细胞，接种到六孔细胞培养板中，让细胞贴壁生长3h，并设立阴性对照，取P1代毒约30uL接种到上述六孔细胞培养板中，置于 27℃细胞培养箱中培养3-5d，期间注意观察细胞的形态变化，当细胞出现细胞病变并且从平板上脱落下来的时候，按照收集P1代毒的方法进行收毒，此时收到的杆状病毒即为P2代毒，依照此方法再接种细胞，即可得到高病毒滴度的P3代毒。注意收集的杆状病毒若要长期保存，应置于-80℃冰箱中，反复冻融会降低病毒滴度。

4)Western blot检测pFastBac1-H蛋白表达的鉴定

将重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分离后进行电转印，然后以兔抗CDV阳性血清为一抗，HRP标记羊抗兔IgG为二抗，进行 Western-blot鉴定，重组蛋白Head Domain相对分子质量约50.8ku，与预期大小相符。表明两个重组蛋白均能与阳性血清特异性结合，具有良好的抗原性。

3、病毒滴度测定

对原始毒种进行重组杆状病毒滴度检测，采用间接免疫荧光 (IFA)法，具体操作步骤如下：用DMEM培养液将毒种作10倍系列稀释，取10^-4～10^-7 4个稀释梯度的毒株分别与2×10⁵cells/ml Vero细胞悬液等比例混合。混合液以200μl/孔加入96孔细胞板内，每个梯度重复3次，同时设立空白细胞对照组。5％CO₂、37℃培养12小时后，换含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的DMEM维持液继续培养 24小时。加入冰甲醇固定；加入兔抗CDV血清，37℃孵育；加入 FITC标记羊抗兔二抗，37℃孵育。倒置荧光显微镜下观察，采用Reed-Muench方法进行滴度计算，病毒滴度为2×10⁷IFU/ml。

实施例3：犬瘟热病毒H基因亚单位疫苗实验室试制及产品质量研究

病毒与细胞

制造本品用的毒种为CDV重组杆状病毒，由青岛农业大学构建、保管和供应，病毒滴度≥10⁷IFU/ml；检验用毒种为CDV GN株，ID₅₀为10^-2.0/ml，由青岛农业大学分离鉴定、保管和供应。Sf9生产用细胞第6代，由青岛农业大学鉴定、保管和供应。

试验动物

6月龄水貂，品种为金州黑色标准水貂、美国短毛黑水貂。试验用貂群健康良好，食欲、饮欲正常，无传染病，中和抗体效价不高于 1:4。所在貂场未发生过水貂犬瘟热，貂场按照正常免疫程序进行。

1、病毒接种与培养

将毒种按0.01％的接种量接种细胞密度达1×10⁶cells/ml的Sf9细胞，27℃条件下连续培养72小时，收获病毒上清液，12000rpm离心 20分钟，收集上清，即为生产用毒，-20℃保存备用。

当生物反应器内Sf9细胞密度达1×10⁶cells/ml时，将生产用毒种按 1％的接种量接毒，接毒后27℃继续培养120小时，转速80rpm，溶氧值60％，pH值6.2。培养120小时后，收获病毒培养液，标记产品名称、制备日期和数量。收获的病毒液于2～8℃保存。按以上方法共接种三批病毒液，共获得三批半成品，批号分别命名为F1、F2、F3。将收获的病毒液取样，进行间接免疫荧光(IFA)检测病毒滴度。

表2生产用毒病毒含量测定结果

2、疫苗配制

1)过滤将收获的病毒液依次经过1.0μm滤膜系统和0.22μm滤膜系统过滤，滤液分装于无菌容器，注明收获日期，置于2～8℃保存。

2)灭活将0.2M灭活剂二乙烯亚胺(BEI)以一定比例加入过滤后的病毒液内，终浓度为5mM，37℃连续搅拌灭活72小时，反应终止后加入终浓度为5mM的硫代硫酸钠中和多余的BEI，2～8℃条件下保存。

3)灭活病毒液检验

灭活检验取灭活病毒液加入Sf9细胞，27℃培养72小时后盲传，连续盲传3代，每代进行间接免疫荧光(IFA)检测。每代灭活病毒液传代产物均无绿色特异性荧光，阳性对照应出现绿色特异性荧光。

无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

目的蛋白含量检测取灭活病毒液进行目的蛋白含量检测，每毫升目的蛋白含量≥16μg/ml。

4)复合佐剂配制复合佐剂溶液的主要成份是由烯丙基蔗糖交联丙烯酸聚合物溶液A和丙三醇溶液B按5:1的比例混合，最后根据佐剂用量加入适量无菌纯化水混匀配制组成。

5)疫苗制备

疫苗配制方案疫苗配制方案疫苗成分主要含犬瘟热H蛋白重组杆状病毒灭活液、复合佐剂成分溶液A和溶液B。疫苗配制按每毫升疫苗终浓度含犬瘟热H蛋白不低于8ug，抗原量与佐剂按1:1比例进行配制。

疫苗配制过程将检验合格的灭活抗原液调整为目的蛋白含量≥16ug/ml置于无菌配苗罐中，开动搅拌器低速搅拌，按1:1的比例称取复合佐剂溶液缓慢加入配苗罐中，并以200rpm进行搅拌20分钟，其混合均匀。

6)分装

疫苗充分混合后，20ml/瓶定量分装，加盖密封，贴签。共制备3批成品，批号分别命名为QD01、QD02、QD03。

3、成品检验

1)性状将疫苗取样于室温自然光充足的条件下观察疫苗颜色，应为无色或微黄色混悬液。

2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4)安全检验取健康易感貂(犬瘟热中和抗体不高于1:4)20只，随机分为4组。1～3组为疫苗免疫组，每组5只，4组为对照组，5 只。皮下分5点注射三批犬瘟热亚单位疫苗(pFastBac1-H株)，每只注射1头份(1ml)，免疫后对试验水貂及对照水貂连续观察14日，观察记录体温、精神状态、食欲、粪便变化情况及注射局部是否有不良反应，试验开始首日、试验最后一日分别称量试验貂体重，评价水貂生长状况，于试验最后一日，每组剖杀3只水貂，检查注射部位有无病理变化。在观察期内，三批犬瘟热亚单位疫苗(pFastBac1-H株) 免疫组和对照组水貂在体温、精神状态、食欲、粪便均正常，注射局部无肿胀和炎症等不良反应，注射部位剖检检查未出现异常变化，疫苗接种组水貂生长情况与对照组差异不显著。

5)效力检验

取健康易感貂(犬瘟热中和抗体不高于1:4)20只，随机分为4 组。1～3组为疫苗免疫组，每组5只，4组为对照组，5只。皮下分5 点注射三批犬瘟热亚单位疫苗(pFastBac1-H株)，每只注射1头份(1 ml)1-4组试验貂于免疫后21日当天，每只以1ml(含100个ID₅₀) 的犬瘟热病毒GN株(脏器毒)攻击，连续观察21日，观察记录试验水貂和对照水貂的体温变化和临床症状。结果显示，三批犬瘟热亚单位疫苗(pFastBac1-H株)接种试验水貂，免疫后21日，用100个ID₅₀犬瘟热病毒GN株(脏器毒)攻击，三批犬瘟热亚单位疫苗(pFastBac1- H株)免疫组对犬瘟热病毒GN株(脏器毒)攻击的均为5/5保护，对照组5/5发病。具体结果见下表。

表3保护试验结果

注：“-”表示未出现对应症状，“+”表示出现对应症状。a体温：发热(体温达40℃以上)并持续1～3日；b精神：精神沉郁、食欲减退或废绝、流眼眵、结膜炎、鼻流清涕或脓性鼻液；c粪便：出现排血样稀便或伴有蛋清样粘液的粪便；d RT-PCR检测结果：RT-PCR检测粪便或死亡动物脾脏或肺脏呈阳性。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种犬瘟热基因工程亚单位疫苗

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1824

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atgctctcct accaagacaa ggtgggtccc ttctacaagg acaatgcaag acccaattca 60

tccaagctgt ccccagtgac agaacagcat gggggcagga gaccacctta tttgttgttt 120

gtccttctca tcctattggt tggaatcctg gccctgcttg ctatcactgg agttcgattt 180

caccaagtat caactagcaa tatggaattt agcagattgc tgaaagagga tatggagaaa 240

tcagaggccg tacatcatca agtcatagat gtcttgacac cgctcttcaa gattattggg 300

gatgagattg ggttacggtt gccacaaaag ctaaacgaga tcaaacaatt tatccttcaa 360

aagacaaatt tcttcaatcc gaacagagaa ttcgatttcc gcgatctcca ctggtgcatt 420

aacccgccta gtaaggtcaa ggtgaatttt acaaattact gtgagacaat tgggatcaga 480

aaatctattg catcggcagc aaatcccatc cttttatcag ccctctctgg gggcaggagt 540

gacatattcc caccatacag atgcagtgga gctactactt cagtaggcaa agttttcccc 600

ctatcagtct cgttatccat gtctttgatc tcaagaacct cacagataat caatatgctg 660

accgctacct cagacggcgt gtatggcaaa acttacttgc tagtgcctga tgatatagaa 720

cgggagttcg acactcaaga gattcgagtc tttgaaatag gcttcattaa aaggtggctg 780

aatgacatgc cattactcca agcaaccaac tatatggtcc tcccggagaa ttccaaagcc 840

aaggtatgta ccatagcagt gggtgagttg acactggctt cctcgtgtgt agaagagagc 900

actgtattat tataccatga cagcaggggt tcacaagatg gtattctagt agtgacactg 960

gggatatttg gggcaacacc tatggatcat attgaggaag tgatacctgt cgctcaccca 1020

tcaatggaga aaatacatat aacaaaccac cgtggtttta taaaagattc aattgcaacc 1080

tggatggtgc ctgccctggc ctctgagaaa caagaagaac aaaaaggttg gctggagtca 1140

gcttgtcaaa gaaaaaccta ccccatgtgc aaccaaacgt catgggaacc cttcggagga 1200

ggacagttgc catcttatgg gcggttgaca ttacctctag atgcaagtgt tgaccttcaa 1260

cttaacatat cgttcacata cggtccggtt atactgaatg gagatgctat ggattattat 1320

caaagcccac ttttgaactc cggatggctt accattcctc ctaaaaacgc aacaatcctt 1380

ggattgataa acaaagcaag tagaggagac cagttcactg tgatacccca agtattaaca 1440

tttgcgccca gggaatcatg tggaaattgt tatttaccta ttcaaacatc tcaaattata 1500

gatagagatg tcctcatcga gtccaatgta gtggtgttgc ctacacagag ttttagatat 1560

gtcatagcaa cgtctgtcat atcacgaaat gatcatgcga ttgtttatta tgtttatcac 1620

ccaatccgga ccatttctta tacgcaccca tttagactaa ctaccaaggg tagacctgat 1680

ttcctaagga ttgaatgttt tgtgtgggat gataatttgt ggtgtcacca attttacaga 1740

tacgagccta acatcgccaa ctctacaacc agtgttgaga atttagtccg tataagattc 1800

tcatgtaacc gttcaaatcc ctga 1824

<210> 2

<211> 607

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Met Leu Ser Tyr Gln Asp Lys Val Gly Pro Phe Tyr Lys Asp Asn Ala

1 5 10 15

Arg Pro Asn Ser Ser Lys Leu Ser Pro Val Thr Glu Gln His Gly Gly

20 25 30

Arg Arg Pro Pro Tyr Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Val Gly

35 40 45

Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Thr Gly Val Arg Phe His Gln Val Ser

50 55 60

Thr Ser Asn Met Glu Phe Ser Arg Leu Leu Lys Glu Asp Met Glu Lys

65 70 75 80

Ser Glu Ala Val His His Gln Val Ile Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe

85 90 95

Lys Ile Ile Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Leu Pro Gln Lys Leu Asn

100 105 110

Glu Ile Lys Gln Phe Ile Leu Gln Lys Thr Asn Phe Phe Asn Pro Asn

115 120 125

Arg Glu Phe Asp Phe Arg Asp Leu His Trp Cys Ile Asn Pro Pro Ser

130 135 140

Lys Val Lys Val Asn Phe Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Ile Gly Ile Arg

145 150 155 160

Lys Ser Ile Ala Ser Ala Ala Asn Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ser

165 170 175

Gly Gly Arg Ser Asp Ile Phe Pro Pro Tyr Arg Cys Ser Gly Ala Thr

180 185 190

Thr Ser Val Gly Lys Val Phe Pro Leu Ser Val Ser Leu Ser Met Ser

195 200 205

Leu Ile Ser Arg Thr Ser Gln Ile Ile Asn Met Leu Thr Ala Thr Ser

210 215 220

Asp Gly Val Tyr Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Val Pro Asp Asp Ile Glu

225 230 235 240

Arg Glu Phe Asp Thr Gln Glu Ile Arg Val Phe Glu Ile Gly Phe Ile

245 250 255

Lys Arg Trp Leu Asn Asp Met Pro Leu Leu Gln Ala Thr Asn Tyr Met

260 265 270

Val Leu Pro Glu Asn Ser Lys Ala Lys Val Cys Thr Ile Ala Val Gly

275 280 285

Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ser Cys Val Glu Glu Ser Thr Val Leu Leu

290 295 300

Tyr His Asp Ser Arg Gly Ser Gln Asp Gly Ile Leu Val Val Thr Leu

305 310 315 320

Gly Ile Phe Gly Ala Thr Pro Met Asp His Ile Glu Glu Val Ile Pro

325 330 335

Val Ala His Pro Ser Met Glu Lys Ile His Ile Thr Asn His Arg Gly

340 345 350

Phe Ile Lys Asp Ser Ile Ala Thr Trp Met Val Pro Ala Leu Ala Ser

355 360 365

Glu Lys Gln Glu Glu Gln Lys Gly Trp Leu Glu Ser Ala Cys Gln Arg

370 375 380

Lys Thr Tyr Pro Met Cys Asn Gln Thr Ser Trp Glu Pro Phe Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gln Leu Pro Ser Tyr Gly Arg Leu Thr Leu Pro Leu Asp Ala Ser

405 410 415

Val Asp Leu Gln Leu Asn Ile Ser Phe Thr Tyr Gly Pro Val Ile Leu

420 425 430

Asn Gly Asp Ala Met Asp Tyr Tyr Gln Ser Pro Leu Leu Asn Ser Gly

435 440 445

Trp Leu Thr Ile Pro Pro Lys Asn Ala Thr Ile Leu Gly Leu Ile Asn

450 455 460

Lys Ala Ser Arg Gly Asp Gln Phe Thr Val Ile Pro Gln Val Leu Thr

465 470 475 480

Phe Ala Pro Arg Glu Ser Cys Gly Asn Cys Tyr Leu Pro Ile Gln Thr

485 490 495

Ser Gln Ile Ile Asp Arg Asp Val Leu Ile Glu Ser Asn Val Val Val

500 505 510

Leu Pro Thr Gln Ser Phe Arg Tyr Val Ile Ala Thr Ser Val Ile Ser

515 520 525

Arg Asn Asp His Ala Ile Val Tyr Tyr Val Tyr His Pro Ile Arg Thr

530 535 540

Ile Ser Tyr Thr His Pro Phe Arg Leu Thr Thr Lys Gly Arg Pro Asp

545 550 555 560

Phe Leu Arg Ile Glu Cys Phe Val Trp Asp Asp Asn Leu Trp Cys His

565 570 575

Gln Phe Tyr Arg Tyr Glu Pro Asn Ile Ala Asn Ser Thr Thr Ser Val

580 585 590

Glu Asn Leu Val Arg Ile Arg Phe Ser Cys Asn Arg Ser Asn Pro

595 600 605

Claims

1.一种H蛋白，其特征在于，所述的H蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

2.一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的H蛋白。

3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述的核酸的序列为SEQ ID NO:1。

4.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒用于重组表达权利要求1所述的H蛋白。

5.权利要求1所述的H蛋白作为犬瘟热亚单位疫苗的抗原的应用。