CN102459578A - 基于在北美狗中循环的犬瘟热病毒的免疫原性组合物、疫苗和诊断方法 - Google Patents

Abstract

提供了免疫原性组合物和广谱疫苗，其含有从地理区域收集的犬瘟热病毒(CDV)的新鉴别出的分离物。所述新鉴别出的分离株表现出欧洲野生谱系CDV以及北极和美洲-2谱系CDV之一或二者的性质。因此，所述疫苗可以广泛地保护免于欧洲野生谱系CDV以及北极谱系CDV或美洲-2谱系CDV、或北极和美洲-2谱系CDV二者的感染。

Description

基于在北美狗中循环的犬瘟热病毒的免疫原性组合物、疫苗和诊断方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年1月30日提交的美国临时专利申请 61/148,791的利益，其整个内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般地涉及新鉴别出的犬瘟热病毒(CDV)的分离株（isolate）。具体地，本发明提供了改进的CDV免疫原性组合物、疫苗和诊断方法，它们含有或考虑了这些新发现的分离株，并描述了基于基因构成来选择用于免疫原性组合物、疫苗和诊断方法中的广谱分离株的系统方法。

背景技术

犬瘟热病毒(CDV)是一种影响所有年龄的狗的单链RNA麻疹病毒。CDV会造成多系统感染，所述感染可能涉及眼、呼吸道、胃肠道、体被和神经系统，且通常是快速致命的。尽管该疾病对于狗而言是破坏性的问题，其它物种也易感该病毒，例如，浣熊、狐狸、山狗、狼、各种毛皮动物和大型非驯养宠物，诸如狮子、豹、猎豹和老虎。在过去，已经证实疫苗可以有效地减少CDV感染的发病率。但是，似乎存在CDV发病率的再现，甚至在充分接种疫苗的动物中。

CDV的血凝素(H)蛋白是一种参与宿主细胞-病毒结合的病毒表面蛋白，该蛋白的突变会影响宿主细胞-病毒相互作用。认为H蛋白是CDV的致病因子。H蛋白的氨基酸序列在CDV分离株中表现出显著的(例如约10%)变化，该变化的系统发生分析用作将病毒分离株分成7个谱系的基础：美洲-1、美洲-2、北极样、亚洲-1、亚洲-2、欧洲和欧洲野生（wildlife）(McCarthy, A.J., M.A. Shaw,和S.J. Goodman. 2007. Proc. Biol. Sci. 274:3165-3174)。抗H蛋白的抗体会提供抗感染保护，因而可能是疫苗效能的基础。但是，抗体不一定在谱系之间交叉反应。因此，基于特定分离株的疫苗可能为疫苗受体提供或不提供针对其它分离株感染的保护。在下述情况下，这是特别有问题的：1) 诸如CDV等RNA病毒表现出高突变率，和2) 狗在国家之间的全球运输增加，这会促进新谱系向以前不知道它们的领域中的引入。此外，对于用特定CDV分离株接种的狗而言，暴露于遗传上遥远的CDV可能导致输入性CDV病毒停留在免疫特殊部位(例如脑、神经节、脊髓、中枢神经系统、自主神经系统、鼻空腔（plenum）和膀胱上皮)，允许遗传上遥远的CDV传播和扩散而不被检测出，因为神经学征状可能被兽医从业人员忽略，这是由于缺乏诊断测试灵敏度和神经学患者长期治疗的费用。

不幸的是，目前在使用中的CDV疫苗在约60年来没有更新 (Woma 等人, 2010. Phylogenetic analysis of the hemagglutinin gene of current wild-type canine distemper viruses from South Africa: Lineage Africa.Vet. Microbiol. doi:10.1016/jvet-mic.2009.11.013)，且没有与这些变化保持同步。这些过时的疫苗的使用，可能是最近的CDV感染暴发的原因，因为这些疫苗不可能提供针对新出现的CDV谱系的感染的保护。此外，PCR测序已经揭示，在一种商业疫苗中使用的疫苗分离株被错误鉴别(Demeter 等人, 2009: Controversial results of the genetic analysis of a canine distemper vaccine strain. Vet. Microbiol. 在线公开)，这使确定如何最好地检测、监测和预防CDV感染和传播的问题进一步复杂化。

显然，需要调查CDV临床病例的增加的流行病学研究，也需要开发考虑了新出现的CDV分离株的新的免疫学和疫苗组合物和诊断方法。

发明内容

在一个方面，本发明提供了新鉴别出的犬瘟热病毒(CDV)的分离株。因此，本发明另外提供了更新的免疫原性组合物和疫苗组合物。本发明的疫苗组合物被设计为提供针对新出现的CDV形式的广谱保护。另外，本发明提供了更新的检测CDV感染的诊断方法和试剂盒。所述诊断方法和试剂盒会提供检测该病毒的新进化形式的能力。本发明的组合物和诊断方法和试剂盒至少部分地基于以前未知的CDV变体的发现，并考虑了现有的疫苗制剂和诊断方法不能胜任的病毒突变形式的出现。在另一个方面，本发明提供了用于选择抗原（例如，病原性分离株或其一部分）的系统方法，所述抗原对应着抗原的广谱来源（例如病原体分离株或其一部分）的基因构成，并用于这样的组合物和诊断方法中。

本发明另外提供了欧洲野生(EW)谱系的一种分离的犬瘟热病毒(CDV)，其包含CDV 9041474B CDV-EW (ATCC保藏号 PTA-10596)的特征。在另一个实施方案中，本发明提供了从CDV株CDV 9041474B CDV-EW (ATCC保藏号 PTA-10596)或其后代株已经在其中繁殖的细胞培养物中分离出的CDV减毒株。在该类型的一个具体实施方案中，可以通过噬斑法纯化CDV减毒株。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物或疫苗，其包含含有CDV 9041474B CDV-EW (ATCC保藏号 PTA-10596)的特征的分离的CDV或其后代。

在另一个实施方案中，本发明提供了美洲-2 (AM-2)谱系的一种分离的犬瘟热病毒(CDV)，其具有CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏号 PTA-10597)的特征。在另一个实施方案中，本发明提供了从CDV株CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏号 PTA-10597)或其后代株已经在其中繁殖的细胞培养物中分离出的CDV减毒株。在该类型的一个具体实施方案中，可以通过噬斑法纯化CDV减毒株。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物或疫苗，其包含具有CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏号 PTA-10597)的特征的分离的CDV或其后代。

本发明也提供了在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法。一种这样的方法包括给所述对象施用免疫原性组合物或疫苗，其包含含有CDV 9041474B CDV-EW (ATCC保藏号 PTA-10596)的特征的分离的CDV或其后代。在另一个这样的实施方案中，所述方法包括给所述对象施用免疫原性组合物或疫苗，其包含具有CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏号 PTA-10597)的特征的分离的CDV或其后代。

本发明也提供了诊断试剂盒。一个这样的实施方案包括寡核苷酸引物，其特异性地用于扩增在SEQ ID NO: 42中所述的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述诊断试剂盒包含寡核苷酸引物，其特异性地用于扩增在SEQ ID NO: 43中所述的核苷酸序列。

本领域技术人员会认识到，这样的引物是基于要扩增的目标核苷酸序列(例如被靶向的序列)的核苷酸序列。在有些实施方案中，引物与靶序列的独特序列同源或互补。

本发明另外提供了本发明的重组的和/或分离的核酸分子。一种这样的核酸编码SEQ ID NO: 44的氨基酸序列和/或其核酸互补体。在另一个这样的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 42的核苷酸序列和/或其互补体。在另一个这样的实施方案中，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO: 42的核苷酸序列和/或其互补体具有大于99.5%同一性的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，所述重组的和/或分离的核酸分子编码SEQ ID NO: 45的氨基酸序列和/或其核酸互补体。在另一个实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 43的核苷酸序列和/或其互补体。在另一个这样的实施方案中，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO: 43的核苷酸序列和/或其互补体具有大于95%同一性的核苷酸序列。

本发明另外提供了表达载体，其可以包含任一种本发明的分离的核酸分子。在一个这样的实施方案中，所述表达载体包含编码SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的分离的核酸分子和/或其互补体。在另一个实施方案中，本发明提供了表达载体，其包含编码SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的分离的核酸分子或其互补体。

本发明另外提供了免疫原性组合物和疫苗，其可以包含任一种本发明的表达载体。在一个这样的实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含表达载体，该表达载体包含编码SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的分离的核酸分子和/或其互补体。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含表达载体，该表达载体包含编码SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的分离的核酸分子和/或其互补体。

本发明另外提供了本发明的所有分离的和/或重组的蛋白、多肽、肽、融合蛋白和嵌合蛋白。在一个这样的实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列。在另一个这样的实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO: 42的核苷酸序列编码。

在另一个实施方案中，本发明提供了免疫原性组合物和疫苗，其包含编码血凝素蛋白的CDV病毒体。在有关的实施方案中，所述血凝素可以部分地由包含SEQ ID NO: 1-33所述的核苷酸序列的核酸编码。在其它有关的实施方案中，本发明提供了通过给对象施用一种或多种这样的免疫原性组合物或疫苗，在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法。

本发明另外提供了选择用于免疫原性组合物中的一种或多种病原体分离株的方法，其中所述分离株使用一种或多种最常用的密码子来编码选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽。一种这样的方法包括下述步骤：1) 对于多种病原体分离株中的每种分离株，测定编码所述选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列；2) 对于在测定步骤中得到的核苷酸序列，得到所述目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中一个或多个目标氨基酸残基的密码子选择数据，由此得到密码子选择频率数据；3) 从所述密码子选择频率数据，鉴别出目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一个目标氨基酸残基的最常用的密码子；和4) 从多种病原体分离株中，选择使用一种或多种最常用的密码子来编码目标蛋白、多肽或肽的一种或多种分离株。在本发明的一个实施方案中，所述病原体是犬瘟热病毒。

在另一个实施方案中，本发明提供了选择用于免疫原性组合物中的核酸(其可以来自病原体的分离株)的一个或多个核苷酸序列的方法。所述核酸使用一种或多种最常用的密码子来编码选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽。所述方法包括下述步骤：1) (例如从多种病原体分离株中)测定编码选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的多个核苷酸序列；2) 对于在测定步骤中得到的核苷酸序列，得到所述目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中一个或多个目标氨基酸残基的密码子选择数据，由此得到密码子选择频率数据；3) 从所述密码子选择频率数据，鉴别出目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一个目标氨基酸残基的最常用的密码子；和4) 从多个核苷酸序列中，选择使用一种或多种最常用的密码子来编码目标蛋白、多肽或肽的核苷酸序列。

附图说明

图1.分离株07091030 (SEQ ID NO: 1，CDV的H基因的核苷酸(nt) 438-1302)。该分离株来自具有癫痫发作史、并表现出具有多个胞浆内包含体的嗜中性粒细胞的狗。该CDV分离株在表达犬信号传递淋巴细胞-活化分子的Vero细胞系(Vero + SLAM)中形成大的、多核的合胞体。基于H蛋白序列，这是欧洲野生谱系分离株。该CDV分离株可以特别地用作例如攻击病毒。

图2.分离株07091031 (SEQ ID NO: 2，H基因的核苷酸440-1494)。

图3.分离株07091032 (SEQ ID NO: 3，H基因的核苷酸440-1225)。

图4.分离株07101508 (SEQ ID NO: 4，H基因的核苷酸427-1335)。该分离株与欧洲野生(EW)遗传谱系具有高同一性，但是来自具有Ondersteport疫苗接种史的南加利福尼亚狗。该分离株在Vero+SLAM细胞中生成大合胞体。该分离株与来自小熊猫（lesser panda）和丹麦貂（Danish mink）的CDV具有高同一性，但是不与Ondersteport疫苗分离株密切相关。

图5.分离株07100609 (SEQ ID NO: 5，N基因的核苷酸833-1213)。编码来自海洋哺乳动物(海豹)的该CDV-样病毒的基因的核衣壳序列与来自美国的犬分离株164071(EU716337)相匹配。

图6.分离株07110098 (SEQ ID NO: 6，H基因的核苷酸439-1286)。

图7.分离株07111080 (SEQ ID NO: 7，H基因的核苷酸630-1501)。

图8.分离株08010939 (SEQ ID NO: 8，H基因的核苷酸443-1343)。

图9.分离株08011277A (SEQ ID NO: 9，H基因的核苷酸423-1556)。

图10.分离株08011277B (SEQ ID NO: 10，H基因的核苷酸1530-410)。

图11.分离株08011277C (SEQ ID NO: 11，H基因的核苷酸433-1230)。

图12.分离株08011277D (SEQ ID NO: 12，核衣壳基因的核苷酸833-1578)。不能扩增该分离株的H基因。扩增的缺少指示在引物结合序列中的遗传变异(并因此，缺少同源性)。核衣壳基因序列与CDV分离株的序列相匹配。

图13.分离株08011671 (SEQ ID NO: 13，H基因的核苷酸422-1589。

图14.分离株08021509 (SEQ ID NO: 14，H基因的核苷酸441-686)。

图15.分离株08030074 (SEQ ID NO: 15，H基因的核苷酸447-1282)。

图16.分离株08030776 (SEQ ID NO: 16，H基因的核苷酸422-1541)。

图17.分离株08030777 (SEQ ID NO: 17，H基因的核苷酸411-1537)。

图18.分离株08031346 (SEQ ID NO: 18，H基因的核苷酸436-1059)。

图19.分离株08040383 (SEQ ID NO: 19，H基因的核苷酸1486-620)。

图20.分离株08050180A (SEQ ID NO: 20，H基因的核苷酸418-1552)。

图21.分离株08060351 (SEQ ID NO: 21，H基因的核苷酸412-1536)。

图22.分离株08060352 (SEQ ID NO: 22，H基因的核苷酸408-1553)。

图23.分离株08080696 (SEQ ID NO: 23，H基因的核苷酸423-726)。

图24.分离株08080941 (SEQ ID NO: 24，H基因的核苷酸387-1522)。

图25.分离株08081112 (SEQ ID NO: 25，H基因的核苷酸411-1207)。

图26.分离株08120827 (SEQ ID NO: 26，H基因的核苷酸413-1535)。

图27.分离株08120857 (SEQ ID NO: 27，H基因的核苷酸724-1522)。

图28.分离株09011024 (SEQ ID NO: 28，H基因的核苷酸578-1613)。

图29.分离株09020504-3 (SEQ ID NO: 29，H基因的核苷酸418-1549)。

图30.分离株09041289 (SEQ ID NO: 30，H基因的核苷酸889-1646)。

图31.分离株09041303 (SEQ ID NO: 31，H基因的核苷酸394-1526)。

图32.分离株09041474A (SEQ ID NO: 32，H基因的核苷酸410-1539)。在田纳西州的大庇护所（shelter）内的充分接种疫苗的狗(用商业的Ondersteport CDV疫苗接种疫苗2次)发生了上呼吸道疾病、高热、绿鼻涕、咳嗽和最终的神经学征状（例如颤搐）。55只狗中有约20只死亡，包括从它得到分离株09041474A和09041474B 的4月龄的雌性狗(参见图37)。

图33.分离株09040826 (SEQ ID NO: 33，H基因的核苷酸418-1546)。

图34A-F. 显示来自野外分离株的犬瘟热病毒血凝素(H)密码子序列的密码子表，使用BioEdit程序，将所述序列与CDV-H疫苗和参照株密码子序列相比对。序列：Ondersteport = CDV疫苗序列；AY964110 = 参照欧洲野生(EW)株)；AF112189 = 参照美洲-2 (AM-2)株；AY962112 = 参照北极(Ar)株。用阴影表示密码子中的差异。

图35. 显示美国和GenBank参照序列中的许多最近的美国CDV分离株的遗传亲缘关系的系统树 (标有下划线)。使用MEGA4.1程序 (可以在位于megasoftware.net的网站免费得到; Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599)，构建系统树。

图36. 显示来自CDV感染的狗 (OADDL:07091030)的CDV的红细胞包涵体的血膜。在嗜中性粒细胞和淋巴细胞内可以看到CDV包涵体(箭头)。(水性Romanowsky染色；条 = 10微米)。

图37. 来自09041474B的H基因的完整序列(SEQ ID NO: 42)，包括终止密码子。

图38. 来自08021509的H基因的完整序列(SEQ ID NO: 43)，包括终止密码子。

图39. 来自09041474B的H基因的完整氨基酸序列(SEQ ID NO: 44)。

图40. 来自08021509的H基因的完整氨基酸序列(SEQ ID NO: 45)。

具体实施方式

本发明提供了引起针对CDV的免疫原性应答的组合物、设计为提供针对CDV感染的保护的疫苗组合物、和CDV诊断方法。所述组合物含有新发现的CDV变体。所述新变体会反映CDV的进化趋势，并提供目前在美国循环的主要CDV菌株的指示。所述变体部分地分离自以前已经针对CDV接种疫苗的狗，但是所述狗仍然感染了CDV并患病，即所述狗是疫苗接种失败的受害者。为了终止或缩短CDV的传播，并防止疫苗接种失败，应当将这些新变体中的一种或多种掺入新的疫苗方案中。本发明也提供了新诊断方法，其用于检测新的CDV分离株以及用于区分由疫苗施用造成的犬瘟热和由新出现的病毒（其未包含在疫苗中，且疫苗不能提供针对它的保护）造成的犬瘟热。另外，本发明提供了分析RNA病毒野外分离株和新出现的病原体的方法，以便确定哪种分离株可能用于包含在广谱免疫原性的和疫苗组合物中。

几种新的分离株属于欧洲野生CDV谱系；其它属于美洲-2 (AM-2)和北极遗传谱系。已经分离了34种CDV病毒，在细胞培养物中繁殖，并已经对病毒的H基因进行部分地或完全地测序。这些病毒来自美国的不同州(例如俄克拉荷马州、佛罗里达州、乔治亚州、加利福尼亚州、密苏里州、得克萨斯州、堪萨斯州和田纳西州)。图1-33显示了与来自分离株的H基因互补的cDNA的部分序列；图37和38分别显示了分离株09041474B和08021509的完整H基因序列，包括终止序列(二者都是TGA)；且图39和40分别显示了来自分离株09041474B和08021509的H蛋白的对应的氨基酸序列。在所述氨基酸序列中，在来自09041474B的序列的位置5处的氨基酸是谷氨酰胺，在来自08021509的序列的位置5处的氨基酸是精氨酸。

本发明也提供了重组的和/或分离的核酸，其编码任一种本发明的H-蛋白，但是它们不包含信号序列(在H蛋白的氨基端处的前12个氨基酸残基)和/或终止密码子，和/或包含替代信号序列和/或替代终止密码子。在本发明中也包括包含这样的核酸的表达载体，以及由这些核酸编码的表达的重组多肽 (包括分离的重组多肽)。

图34A-F显示了与CDV-H疫苗序列和参照株相比对的来自几种野外分离株的CDV血凝素(H)序列。该数据的分析用作开发分析和选择用于疫苗中的广谱病原体分离株的相对优选的密码子选择(RPCU)方法/概念的基础。该方法是基于在本文中公开的病原体中的新识别的RPCU模式。尽管该方法可以广泛地适用于许多病原性生物体(下文详细讨论)，本文描述了用于分析RNA病毒分离株的一种示例性应用。本文使用的“分离株” (例如其可以是病原体，例如，RNA病毒)已经从生物样品基本上分离和纯化，且可以已经在合适的细胞培养物中进行传代和/或繁殖。或者，所述分离株可以已经从纯的培养物（例如从ATCC保藏物）得到。

为了实现RPCU方法，从在一个或多个目标群体中得到的动物对象(包括人)的生物样品分离出代表性数目的目标分离株。在特定目标地理区域或地区内，和/或从疑似携带病原体的动物对象，可以得到分离株。合适的生物样品是在病原体感染的急性期内收集的、含有最高浓度病毒的生物样品，且包括不同的组织样品、体液或排泄物 (痰、唾液、血液、尿、粪便、拭子[为多类样品的通用术语]等)。通过RPCU可以分析的合适的病原体(例如新出现的病原体)的实例包括、但不限于：各种病毒，诸如RNA病毒、单链DNA病毒、流感病毒、HIV病毒等；各种细菌性病原体，诸如分枝杆菌属、耶尔森菌属、立克次体属和巴尔通体属物种；各种真菌；和各种原生动物病原体，诸如疟疾、锥虫属、弓形虫属、内阿米巴属、贾第虫属和隐孢子虫属物种等。本领域技术人员会认识到，病原体分离株的“代表性数目”可以变化，但是通常是在至少20-25、通常至少30-35的范围内，且可以无限制地是分离株(或序列)的任意数目，这取决于生物样品的可用性、可进行该目的的资源的可用性等。

“目标群体”通常是易感目标病原体的个体的群体，且可以包括当被病毒感染时表现出疾病征状的个体，或可以是几乎不具有或不具有征状、但是仍然被病原体感染的携带病毒的“载体”。

目标地理区域或地区可以是例如被地理和/或法律边界限定的区域或地区，例如，国家、洲、州、县等；或被地理屏障隔开的区域，诸如水体(河、湖、海等)、山脉、沙漠等；或具有共同的气候或气象模式（例如类似的平均温度或降水、有或没有雪和冰等）的区域/地区。

选择所有分离株共有的至少一种目标蛋白、多肽或肽，进行详细的基因序列分析。通常，这样的目标蛋白、多肽或肽是已知具有免疫原性的。“免疫原性的”是指，当所述蛋白、多肽或肽存在于宿主中时(例如当包含所述蛋白、多肽或肽的病原体感染宿主时)，所述蛋白、多肽或肽在宿主中引起免疫应答(例如抗体生产)。通过本领域技术人员已知的几种方法中的任一种，可以确定主要的免疫原，所述方法包括对来自康复患者的血清进行蛋白印迹分析，所述康复患者已经恢复，并被保护免于病原体的进一步感染。本领域技术人员会认识到，使用RPCU，可以分析一种或超过一种这样的蛋白、多肽或肽，但是选择至少一种。另外，可以系统地选择更多用于分析，但是基于例如蛋白印迹分析占优势的那种可以是良好的起点。通过MALDI-TOFF，可以对未知的免疫原性的蛋白测序。这有助于设计引物来扩增序列。

选择合适的蛋白、多肽或肽以后，使用非常确定的技术，例如聚合酶链式反应(PCR)测序等，测定编码所述蛋白、多肽或肽的核苷酸序列。或者，使用该方法对比的序列可以从生物样品直接得到而无需分离病毒，或者它们可以是从数据库 (例如GenBank或其它)得到的已知序列。

然后对核苷酸序列进行分析，以鉴别三联密码子和比对在正确的翻译(阅读)框中的密码子。使用多种核苷酸分析程序中的任一种，可以进行序列分析，包括但不限于：使用BioEdit 软件的CLUSTAL W分析，由Baylor医学院提供的多序列比对程序(MAP)等。通常，分析的序列是cDNA序列，尽管所述方法不限于使用cDNA，例如，也可以分析DNA、RNA等。任选地，在分析中包括来自一个或多个参照序列(例如RNA病毒参照株)的对应序列。通常，参照株会代表例如以前在研究的群体和/或区域中占优势(例如以高频率存在)的病原体类型(例如病毒谱系)。这样的参照株可以是例如已经在针对RNA病毒感染的疫苗中使用的RNA病毒。参照序列的优选候选物是，当使用例如BLASTn和BLASTp程序分析时，表现出与病原体(例如新出现的病原体)的核苷酸和蛋白序列的最高同源性和同一性水平的那些。同源性和/或同一性水平可以是至少约90%或95%或甚至至少约99%或更大。

以可以容易地对比的形式（包括但不限于以表格形式，例如，在Excel表中），在框架内比对指定来自分离株(和任选地，一个或多个参照序列)的氨基酸的三联密码子。本领域技术人员熟知，三联体密码是众多的，超过一个密码子可以编码相同的氨基酸。对于与目标蛋白、多肽或肽中的氨基酸残基相对应的每个位置，指出编码来自每个分离株的残基的3个核苷酸的身份，并在所有分离株中进行对比。例如，在假定的目标蛋白中，如果位置50是亮氨酸，该残基的可能的密码子包括tta和ttg。指出在所有分离株的位置50处的实际密码子，并与在所有其它分离株中存在的密码子相对比。从该对比，可以确定相对优选的密码子选择(RPCU)。例如，如果75%的分离株使用“tta”来编码Leu残基且25%的分离株使用“ttg”，则tta的RPCU值是75%，ttg的RPCU值是仅25%。因而，tta是在该残基处优选的(即最常出现的或使用的)密码子。以此方式，确定对于目标序列的每个目标残基而言最常使用的或优选密码子。可以针对序列的所有残基，或仅针对残基的子集（例如已知参与关键的病原体活性的残基，或已知属于表位或抗原区的一部分的残基，或与毒力有关的残基等），进行该分析。

RPCU方法的目标是鉴别出用于广谱疫苗制品中的分离株，所述分离株的核苷酸序列具有高百分比的优选密码子。这可以通过几种方法中的任一种来实现。例如，可以测定仅包含最优选密码子的理论的“理想”序列，并可以将分离株的实际序列与该理论序列相对比。计算每个分离株和理想序列之间的同源性水平。与理想序列表现出最高同源性水平(例如量、百分比等)的分离株是使用最高数目的优选密码子的分离株。该分离株与理想物最好地“拟合”，并被选作疫苗组分。或者，可以不测定理想序列，但是如上所述制表或计算在每个位置的密码子选择，并通过本领域技术人员已知的其它方法（例如通过简单的目检），在序列之间进行对比，以从分离株中鉴别出使用非常高水平或最高水平的优选密码子数目的序列。

不受理论的约束，该选择与下述理解相一致：当在编码残基的3-核苷酸序列中发生突变时，只有当含有该突变的病原体(例如RNA病毒)与不含有该突变的病原体相比具有某种选择优势时，该突变才可能永存或变得分布广泛的（widespread）。例如，有些密码子比其它密码子更快速地或更高准确度地翻译，具有这样的突变的病原体可能比非突变型病原体更成功地再生和感染新宿主。因此，由于自然选择，这些密码子最终以更高的频率存在于病原体群体中。具有高百分比的常用密码子的分离株可能具有与所述密码子有关的累积优点，且可能表现出由所述密码子赋予的有利特征，因而，当包含在疫苗制品中时，可能提供广谱保护。RPCU考虑了与基因组核酸相互作用的病原体(诸如病毒)的内部蛋白表位(Pepin KM, J Domsic,和R McKenna. 2008. Genomic evolution in a virus under specific selection for host recognition. Infection, genetics, and evolution. : 825-834)。

RPCU会影响诸如CDV等RNA病毒的生物学功能。密码子(核苷酸的三联体)是最基础的生物学单位，因为它们编码氨基酸，所述氨基酸形成蛋白的功能单位，包括表位(例如约6-7个氨基酸)和抗原区或序列基序，它们直接地参与引起针对抗原蛋白（诸如CDV的H蛋白）的宿主免疫应答。因而，基于RPCU来选择CDV分离株，会反映病毒的表型/功能，诸如病毒的基因表达、H-蛋白表达和滴度。密码子选择也可以影响蛋白表达的宽度，并从而影响在其中表达病毒或蛋白的组织。在初步分析中，CDV的H蛋白表达的基于凝胶的PCR分析证实，与大多数EW分离株相比，大多数美洲-2分离株具有一致地更低的(低约8-10倍) H-基因PCR产物表达。该结果可能反映了大多数EW CDV分离株中稳健的且生物学上有利的H-基因密码子组成，这导致犬群体中更高的EW CDV分离株频率。在下面的实施例4中，显示了该方法适用于CDV RNA病毒。

本领域技术人员会认识到，可以开发计算机执行的软件(电脑程序)来执行RPCU方法。这样的软件包括或编码指令，所述指令造成计算机执行RPCU方法，且可以包括，例如，用于输入序列和其它有关数据(例如分离株的名称、密码子比对特征等)的装置、用于显示输入的数据的装置、用于表示分析结果的装置(例如显示在屏幕上，或以合适的形式输出[“硬拷贝”]结果，例如作为序列、作为一种或多种数字指示器 (诸如“序列#4”或“#4”作为最好的结果)，以图形形式、表格形式等)。在计算机程序中也可以包含用于统计分析的工具，且所述分析可以提供结果的分级，即该程序可以以从可能最合适的那些至最低可能的那些的方式排列候选序列，和/或可以简单地提供一个或多个最高排序(最合适的)序列。计算机程序可以包括指令，所述指令用于实现执行分析所用的算法。

RPFU方法因而是选择和/或得到用于免疫原性组合物和疫苗中的病原体分离株的方法。可以选择或以其它方式得到(例如，通过标准的基因工程技术进行修饰)这样的分离株，其具有编码目标蛋白、多肽或肽(通常是免疫原)的优选密码子。

RPFU方法可以包括下述步骤：从来自被病原体感染的多个不同动物的生物样品，得到多个病原体(例如RNA病毒)分离株；选择与所述RNA病毒有关的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽；针对多个分离株中的每个分离株，测定编码目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列；在编码目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的每个核苷酸序列中，鉴别编码目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中的目标氨基酸残基的密码子；通过对比编码目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，测定目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每个目标氨基酸残基的密码子选择数据的频率；从所述的密码子选择数据的频率，鉴别出目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每个目标氨基酸残基的最常用的密码子；并从多个病原体分离株中，选择使用一种或多种最常用的密码子来编码目标蛋白、多肽或肽的分离株。在有些RNA病毒中，通过RPCU 软件，可以分析免疫原的拟-群体。

图35显示了分离株的遗传亲缘关系的系统树，它基于H基因的序列。在该树中，非常密切相关的CDV分离株群体已经出现，即属于欧洲野生谱系的“优势CDV群体”。通过用2个其它谱系（北极和美洲，即“次要CDV群体”）的其它次要的CDV病毒进行挑战，可以检查这些欧洲野生病毒。保护性地抗欧洲-野生以及北极和美洲-2谱系病毒中的一种或另一种(或两种)的一种或多种广泛反应性的优势分离株可以用于制备CDV免疫原性组合物，用作对目前在美国或其它合适的地方循环的所有CDV谱系有效的疫苗。换而言之，所述免疫原性组合物应当引起针对欧洲野生谱系病毒和针对北极和美洲-2谱系病毒中的一种或两种的免疫反应(例如抗体生产)。本发明的疫苗应当保护性地抗欧洲野生谱系病毒、和抗北极和美洲-2谱系病毒中的一种或两种。在这样的免疫原性组合物或疫苗中使用的CDV含有核酸序列，所述核酸序列编码以前仅在欧洲野生病毒中发现且认为是其特有的抗原(抗原区、抗原决定簇等)，以及以前仅在北极或美洲谱系病毒（或优选地，北极和美洲-2谱系病毒）中发现且认为是其特有的抗原。

这样的病毒的一个实例是分离株09041474B，其完整血凝素基因序列如SEQ ID NO: 42所述。使用几个标准来选择该CDV分离株作为疫苗候选物。首先，形成一组当前的CDV分离株(在历史上，基于公开的报道，仅可以得到几个分离株。此外，研究CDV疫苗接种失败问题的报道很少)。其次，进行血凝素测序和CDV基因分型。使用BALSTn、CLUSTAL-W的全核苷酸分析和系统发生分析允许对谱系中的CDV分离株进行聚簇和表征，并确定09041474B属于EW谱系。然后，根据上述的相对优选的密码子选择(RPCU)分析方法，使用密码子选择表(显示在图34A-F中)来选择CDV疫苗分离株09041474B。

来自分离株09041474B的H基因序列 (完整序列, 图37)在几个方面不同于参照EW序列 (图34A-F中的AY964110)。首先，使用组织样品，得到AY964110的H基因的核苷酸序列，即未分离具有该序列的CDV病毒。相反，从已经在细胞培养物中培养和繁殖的分离的CDV，得到来自本文所述的09041474B的H基因序列。2个序列的密码子选择也不同。对于09041474B，在位置187处的密码子是CGA，在位置201处的密码子是CTG，在位置236处的密码子是CCT，在位置303处的密码子是TCA。进一步与AY964110相比较，在09041474B序列中，在位置303处的密码子编码丝氨酸，而不是亮氨酸(参见图34A-F)。分离株09041474B在细胞培养物中表现出稳健生长，且在施用具有该序列的病毒体的对象中引起免疫应答方面，在位置303处的丝氨酸可能赋予优点。标记为09041474B CDV-EW的09041474B CDV分离株的保藏物(完整的活病毒，在2-3的低传代)被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas, VA，保藏号为PTA-10596，保藏日期为2010年1月21日。第二种目标CDV分离株08021509 (美洲-2，标记为08021509 CDV-AM-2)也保藏在ATCC，保藏号为PTA-10597，保藏日期为2010年1月21日。两种保藏物都是完整病毒。本发明包括病毒，其具有保藏的分离株的特征，例如：本文公开的核苷酸序列；毒力和繁殖性质；合胞体性质(例如大小、形状、数目、外观([例如边界清楚的、模糊的等)、合胞体中核的数目等；以及其它。

在本发明的有些实施方案中，采用多价的CDV免疫原性组合物和/或疫苗(例如欧洲野生和美洲-2)。这2个CDV谱系可以组合在单个制品中，或作为2个单独的剂量单独施用，例如，如果它们干扰CDV免疫的诱导。

本发明提供了本文公开的所有分离株，以及从所述分离株和/或从本文所述的分离株的抗原部分（例如包含在SEQ ID NO: 1-33和42-43中所述的核苷酸序列的核酸和/或由它们编码的蛋白、多肽或肽）制备的疫苗和免疫原性组合物。本发明的疫苗可以以任何合适的方式配制，包括但不限于使用完整病毒(例如杀死的或减毒的，如下面详细描述的)。在该实施方案中，本文公开的任一种新颖的CD病毒可以用于制备疫苗。通常，可以如下鉴别这样的病毒：从具有CDV感染征状的狗（特别是以前已经接种CDV疫苗的狗）的组织样品中分离出病毒，对病毒基因组测序，并与已知序列进行对比(即与本发明之前分离的CDV、特别是目前在疫苗中使用的CDV分离株进行对比)。具体地，这样的新的病毒分离株可以具有H基因序列，该序列含有与分离株09041474B (一种示例性的分离株)相同或同源的区域。

通常，这样的病毒具有这样的H基因(或其一部分)，其与本文公开的核酸序列或其互补体具有至少约75%、优选约80%、更优选约85%、最优选约90%或甚至95、96、97、98、99或100%同源性(和/或同一性)。在本发明的一个具体实施方案中，所述CDV分离株包含这样的H-基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO: 42 (即，分离株09041474B的序列)具有大于99%同源性 (和/或同一性)。在一个有关的实施方案中，所述CDV分离株包含这样的H-基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO: 42 (即，分离株09041474B的序列)具有大于99.5% 同源性 (和/或同一性)。

在另一个实施方案中，所述CDV分离株包含这样的H-基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO: 43 (即，分离株08021509的序列)具有大于95% 同源性 (和/或同一性)。在一个有关的实施方案中，所述CDV分离株包含这样的H-基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO: 43 (即，分离株08021509的序列)具有大于99% 同源性 (和/或同一性)。

或者，这样的病毒可以编码H蛋白，该H蛋白含有与本文公开的核酸序列编码的氨基酸序列具有至少约75%、优选约80%、更优选约85%、最优选约90%或甚至95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列。本领域技术人员熟知计算%同源性或%同一性的方法。这样的变体病毒可以具有编码与本文公开的那些不同的序列的H基因，所述不同是因为分离株中的天然变化，或由于故意引入（例如通过基因工程技术）的变化。换而言之，所述病毒可以是重组的。

在其它实施方案中，仅本文所述病毒的抗原部分存在于本发明的免疫原性的或疫苗组合物中。使用例如在SEQ ID NO: 1-33和42-43中所示的编码抗原性肽或蛋白的核酸，或来自那些序列的肽或蛋白的抗原性表位或区域，可以配制这样的组合物。例如，本发明的疫苗制品可以包含含有本文所述序列或其互补体的核酸序列和/或由这样的序列编码的蛋白、多肽或肽。另外，也包括具有这样的序列的某些变化的疫苗。尽管所述序列代表cDNA，本发明也包括对应的ssRNA、ssDNA、双链(ds) DNA、dsRNA、互补的DNA和任意形式的RNA (例如mRNA、RNA/DNA杂合体等)，其基于或源自这些序列或与这些序列互补。这样的序列可以是有义或反义序列。此外，也预见到与本文公开的CDV的核酸序列表现出至少约90%同源性或甚至约95、96、97、98或99%或更大同源性的序列用于疫苗中。这样的序列的差别可以是：例如，在一个或多个位置处含有编码相同氨基酸的替代密码子，以便使表达最大化。另外，也预见到这些序列的编码例如H蛋白的表位或抗原区的部分，以及与这样的氨基酸序列表现出70%或甚至更优选约80、90或95%或甚至更大同一性(例如96、97、98或99%同一性)的序列。通常，约6-8个氨基酸构成表位。这样的序列的差别可以是：例如，含有保守的或非保守的氨基酸置换或删除(尤其是氨基或羧基端删除)、或各种插入等，只要得到的蛋白/肽具有本文所述的抗原性。这样的抗原区的长度优选是至少约10个氨基酸，但是可以更长，例如包括整个蛋白诸如H蛋白。

此外，也预见到在严谨条件 (尤其是高严谨性条件)下与本文公开的序列(或那些序列的一部分)杂交的核酸序列。严谨条件是指允许核酸序列与特定序列杂交的杂交条件。一般而言，高严谨条件是指这样的杂交条件：在约65℃、在包含约1 M盐（优选6 x SSC）的溶液或具有相当离子强度的任何其它溶液中，允许至少50个核苷酸和优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列与特定序列杂交，并在65℃、在包含约1 M盐或更低（优选0.2 x SSC）的溶液或具有相当离子强度的任何其它溶液中洗涤。这些条件允许检测具有约90%或更高序列同一性的序列。

本发明包括的核酸，例如具有在SEQ ID NO: 1-33和42-43中所述的核苷酸序列(和本文所述的它们的变体)的那些，可以以不同的方式得到。例如，可以从天然来源诸如从病毒分离株得到它们；或者，可以合成地生产它们。本领域技术人员会理解，本领域存在合成地生产非常大的序列（例如整个病毒或细菌基因组(例如支原体属)）的能力，本发明包括包含本文公开的序列的任意起源或产品的序列、以及从所述序列表达的蛋白、多肽和/或肽。

本发明也提供了重组构建体诸如重组病毒、载体和表达载体，它们表达本文所述的蛋白/多肽/肽(即由SEQ ID NO: 1-33和42-43所述的核酸序列编码的氨基酸序列，或其变体)。这样的构建体包括已经如下生产的那些：例如，通过将一种或多种本文公开的序列克隆进载体或宿主(例如质粒、粘粒、诸如腺病毒和痘病毒载体等病毒载体、或细菌载体等)中。

在一个实施方案中，所述构建体是包括以前指出的核酸和/或其片段的表达载体。在本发明中使用的重组表达载体通常是自主复制的DNA或RNA 构建体，其包含编码本发明的CDV血凝素和/或其抗原性片段的核酸，其通常可操作地连接到能够调节所述核酸在适合的宿主细胞中的表达的合适的遗传控制元件上。遗传控制元件可以包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统，且通常包括转录启动子、任选的控制转录开始的操纵基因、用于升高mRNA表达水平的转录增强子、编码合适的核糖体结合部位的序列、和终止转录和翻译的序列。表达载体也可以含有允许载体独立于宿主细胞地复制的复制起点。通过本领域技术人员已知的几种方法中的任一种，可以构建重组表达载体。例如，已知可以取出目标序列（例如从起始分离株诸如病毒中）并连接进合适的表达载体中的基因工程技术。或者，可以合成地制备表达载体的一部分或整个表达载体；或可以采用连接和合成方法的组合。

另外，可以在本文所述的构建体中包含其它有用的元件。例如，所述构建体可以编码各种序列，诸如组氨酸标签或用于促进蛋白分离的其它标签，诸如谷胱甘肽-S移换酶(GST)，和麦芽糖结合蛋白；各种接头或间隔物序列；各种佐剂和增加蛋白的抗原性的序列(例如半抗原)；引入希望的/方便的限制性酶切割位点或编码希望的蛋白酶切割位点的序列；编码荧光的或其它可检测的标记的序列，或标志或标记序列(例如绿荧光蛋白(GFP)或其部分)；指导编码的蛋白的定位、输出或加工的各种序列(例如前导序列)；异源信号序列(即在自然界中通常与CDV H蛋白无关的信号序列)；等。本领域技术人员知晓其它可能性，且也意图包括在本发明中。当在构建体中包含这样的序列时，如果它们与本文所述的病毒序列似乎邻近的，可以将整个编码序列翻译成融合或嵌合蛋白/多肽/肽，且可以对翻译后修饰敏感或不敏感(取决于序列)。本发明也提供了本发明的表达的重组蛋白/多肽/肽和它们的对应的融合或嵌合蛋白/多肽/肽。在具体实施方案中，也分离了这样的重组蛋白/多肽/肽和它们的对应的融合或嵌合蛋白/多肽/肽。

另外，本发明提供了包含这样的表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞任选地是原核生物或真核生物宿主细胞。通过常规方法，可以在原核或真核细胞中表达编码本发明的CDV血凝素的核酸。

本发明的疫苗和免疫原性组合物可以包含本文所述的序列的任一种来源，例如病毒分离株、减毒的病毒、重组构建体等。几种制备适用于针对CDV的疫苗接种的疫苗的方法是本领域已知的。参见，例如，Appel 等人的美国专利4,193,990和4,193,991，Carmichael 等人的美国专利4,303,645，Wood 等人的美国专利4,971,793；Valdes 等人的美国专利5,882,652，和Parrish 等人的美国专利5,885,585和5,814,510，它们各自提供了合适的疫苗配制方案的变化。这些专利各自的完整内容通过引用并入本文。通常，为了生产疫苗，采用含有本发明的遗传序列(天然地，或由于基因工程)的病毒或其它载体。这样的病毒载体的实例包括这样的病毒和病毒体(例如CDV)，其“被杀死”、灭活或以其它方式减毒，因而在与合适的生理载体一起施用它的动物中不会造成严重的疾病征状。通过使用化学试剂诸如福尔马林、二乙烯胺、β丙内酯，通过使用γ辐照或热，或通过本领域已知的其它方法，可以灭活CDV病毒(使其不能复制)。可以如下实现减毒：例如通过在合适的宿主细胞中重复传代病毒分离株，并随后分离得到的克隆分离株。在有些实施方案中，减毒的病毒保留在宿主内复制的能力，尽管这不是严格地必然的。优选地，给药不会引起疾病征状。但是，本领域技术人员会认识到，许多有效的疫苗组合物在给药后会造成某种不适或相对次要的痛苦。但是，保护免于充分发展的疾病的益处远远超过该可能性。减毒的病毒可以是天然地含有本发明核酸序列的病毒(例如CDV)，或所述病毒可以是重组体，其中通过基因工程将所述核酸序列插入病毒中。在重组疫苗的情况下，可与将核酸序列掺入除了CDV以外的病毒中，以形成异型重组疫苗。这样的病毒的实例包括、但不限于，各种疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、非病原性的“孤儿病毒”、肠病毒诸如肠道病毒和本领域众所周知的其它病毒。另外，可以在细菌、酵母或寄生物重组系统中表达H基因。在一个优选的实施方案中，所述病毒是活的、减毒的(修饰的)高滴度CDV，且所述核酸是ssRNA。另外，也预见到其它形式的疫苗。例如，也预见到“空”病毒体颗粒疫苗(没有核酸)，以及包含抗原性病毒体或没有装配成壳体的其它CDV蛋白的疫苗。另外，本发明的疫苗可以是多价的，包括多种病毒。或者，通过重组技术，通过交换编码区（这是本领域技术人员已知的），可以构建遗传地工程化成含有编码来自2种或更多种新颖CDV的蛋白的核酸的单个病毒。

在本文所述的组合物中使用的CDV通常是减毒的且安全的，即当施用给合适的宿主动物时，不产生或产生极少的疾病征状。CDV疫苗应当不会在宿主的脑脊液中引起抗体生产。但是，减毒的CDV的施用仍然会导致针对CDV 免疫原（诸如H蛋白）的免疫应答(例如保护性的免疫应答)。最常用的生产减毒的活病毒疫苗的方法是，在细胞培养物中连续传代病毒。例如，可以在原代犬细胞培养物中，或在不携带癌基因的犬细胞系中，传代病毒，尽管也可以使用其它细胞系(例如鸡胚胎或成纤维细胞、VERO-SLAM细胞、婴仓鼠肾细胞系以及其它仓鼠细胞系 (Sultan S, NT Lan, T Ueda, R Yamaguchi, K Maeda, and K Kai. 2009. Propagation of Asian isolates of canine distemper virus (CDV) in hamster cell lines. Acta Veterinaria Scandinavica 51:38 doi: 10.1186/1751-0147-51-38)等)。通常，对于第一次传代，用选择的CDV接种物，感染细胞培养物。得到明显的病毒复制证据(例如，感染的细胞中病毒-诱导的细胞病变效应[CPE])以后，使用第一代的细胞培养培养基或感染的细胞或二者的等分试样来感染第二代细胞培养物。重复该过程，直到病毒基因组中的一种或多种突变造成足够的减毒，使得病毒可以安全地用作疫苗。传代次数可以稍微变化，例如使用至少约20次、通常约50次传代，但是可以使用多至例如150次传代。此时，病毒被充分地减毒(即，毒力或造成疾病的能力降低)至用于疫苗制剂中。通常通过将天然宿主暴露于逐渐更大的传代水平的病毒，以经验为主地确定减毒的程度。

通过在逐渐降低的温育温度重复传代，使用或不使用诱变化学试剂，也可能减弱CDV病毒。通常，在37℃繁殖CDV病毒。但是，在连续降低的温育温度传代例如50次以后，生成例如病毒的克隆株，其不再具有在核心体温(37℃)或以上复制的能力。这样的病毒保留在通常表现出更低温度的身体区域（例如鼻腔）中复制的能力，但是不会在核心体温复制。例如，在一个实施方案中，冷适应的温度CDV在约26℃至约34℃的温度在组织培养细胞中繁殖，但是在非允许的约37℃的温度不繁殖(美国专利申请2006121521，Dowling和Younger,其整个内容通过引用并入本文)。这些病毒因此可以非常安全地用于动物使用的CDV疫苗中，所述动物包括野生和高度敏感的物种（诸如大型猫科动物、水貂和雪貂）。

本领域技术人员众所周知其它合适的疫苗组分（例如药理学上可接受的载体），以及用作疫苗的这样的组合物的制备。通常，这样的组合物被制备成液体溶液或悬浮液，但是也预见到固体形式例如片剂、丸剂、散剂等。也可以制备适合于在给药前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。活性成分可以与药学上可接受的、并与活性成分相容的赋形剂混合。适合的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油等或其组合。另外，组合物可以含有小量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。如果需要施用口服形式的组合物，可以加入各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂等。本发明的组合物可以含有任何这样的附加成分，从而提供适合于给药形式的组合物。可翻译的核酸在制剂中的最终量可以变化。但是，一般而言，该量是约1-99%。所述组合物可以另外包含佐剂，所述佐剂的合适的实例包括、但不限于，Seppic、Quil A、铝胶（Alhydrogel）、水包油乳剂、磷酸铝、聚羧乙烯、Emulsigen等。

通过本领域技术人员众所周知的许多合适的方式中的任一种，可以施用本发明的免疫原性的/疫苗制品，所述方式包括但不限于：通过注射、口服、鼻内、气管内、摄入含有抗原的食品、通过肌肉内、皮下、静脉内、透皮和真皮内途径、滴眼剂或使用喷雾器或无针器械等。但是，在一个优选的实施方案中，所述给药模式是通过注射。另外，所述组合物可以单独施用，或与其它药剂或免疫原性组合物组合施用，例如作为多组分疫苗的一部分。具体地，所述免疫原性的CDV可以与下述物质相组合：狂犬病病毒、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、犬埃里希体（Ehrlichia canis）、犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬巴贝虫（Babesia canis）、嗜吞噬细胞无浆体（Anaplasma phagocytophilium）、贾第虫属物种、利什曼原虫属物种、钩端螺旋体属物种或它们的任意组合等。此外，施用可以是单个事件，或可以不同的时间间隔施用多个加强剂量(属于相同或不同株)，以增加免疫应答。另外，施用可以是预防性的（即在已经暴露于病毒或疑似已经暴露之前，或在事实之后，即在已知的或疑似的暴露之后）或治疗性的（例如在发生与病毒感染有关的疾病征状以后）。

本发明也提供了不同类型的重组载体和/或表达载体，其含有和表达本文公开的核酸序列(或其编码抗原性肽和/或多肽的部分)。这样的载体和表达系统的实例包括、但不限于：各种细菌(例如埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）)或基于益生菌的(例如乳杆菌属)表达载体；腺病毒载体、杆状病毒、毕赤酵母和其它酵母表达系统；痘载体诸如浣熊痘载体；等。这样的重组载体和表达系统也可以用于疫苗制品中。或者，它们可以用于其它目的，诸如用于所述序列的实验室操作，或用于研究或诊断目的。

本发明提供了通过给对象施用本发明的组合物，在有此需要的对象(例如哺乳动物)中免疫或预防CDV感染征状的方法。通常，以足以在小狗和/或成年狗中提供主动免疫的量，施用所述CDV疫苗。优选地，所述免疫应答可以保护性地抗将来暴露于CDV，即与未接种疫苗的对照相比，所述组合物的施用会预防与CDV感染有关的疾病征状。但是，如果免疫应答简单地减轻或减少疾病征状的严重性，即使所有征状未消除，也可以获得更多益处。

在本发明的一个优选实施方案中，使用本发明的疫苗接种的动物是驯养的狗，包括成年狗和小狗。但是，也预见到其它潜在CDV宿主的疫苗接种。其它潜在宿主包括其它犬属诸如野生犬属(例如狼、野狗物种等)、更大的猫科动物物种(驯化的或野生的)、水貂、小熊猫、狐狸、狮子和虎、雪貂、兔、山羊等、以及其它一般的肉食动物。雪貂高度易感CDV。因而，可以使用高度减毒的、修饰的活病毒疫苗或重组CDV疫苗。根据美洲雪貂协会（American Ferret Association，MD），可以将3种CDV疫苗施用给8、11和14周龄的健康雪貂。尽管所述疫苗当然地用于驯养的动物，野生的或部分地驯化的动物也可以从这样的疫苗接种获益，例如在动物园或保护区、公园、研究场所等中的动物。尤其可以用杀死的CDV疫苗接种野生动物，因为它们对修饰的活病毒疫苗更易感，例如通过使用含有疫苗组分的可食用诱饵。通过接种本文提供的疫苗制品，携带CDV变体（无论所述病毒是否在宿主中造成疾病征状）的任意动物可以获益。给病毒感染后无征状的动物(即沉默载体)接种疫苗是有益的，以便减少病毒向更易感群体的传播。

本发明也提供了抗体，其特异性地或选择性地结合本文公开的CDV的抗原性决定簇或抗原区。在有些实施方案中，所述抗体是中和抗体，其可以中和病毒并从而预防感染。这样的有差别的抗体可以是多克隆的或单克隆的，尽管单克隆抗体通常是优选的。所述抗体可以属于犬起源。通过将病毒(例如杀死的病毒、蛋白或编码蛋白的核酸)注射进小鼠或另一种合适的宿主（诸如兔或犬宿主）中，可以制备单克隆抗体。在3次强化后，收获脾，并与骨髓瘤细胞融合。通过ELISA、HA-HI和间接的荧光抗体实验，可以筛选生产单克隆抗体的克隆。保存与本文所述的病毒或与从所述病毒分离的蛋白反应的克隆，用于开发CDV诊断试验。通过将一种或多种跨氨基酸密码子的肽（它们是优选的抗原靶标例如H蛋白）注射进兔子中，可以制备多克隆抗体。

本发明也提供了用于检测本文所述的CDV变体的诊断方法和试剂盒。这样的试剂盒包括，例如，特异性地扩增(例如通过聚合酶链式反应，PCR)本文公开的核酸序列的寡核苷酸引物。或者，这样的试剂盒可以包括抗体(例如单克隆的或多克隆的)，所述抗体选择性地或特异性地结合所述新颖的CDV变体展示的独特抗原性决定簇。所述试剂盒可以用于监测CDV状态，例如，易感CDV的任意动物、尤其是犬的CDV状态。所述试剂盒特别适用于监测从一个区域出口或运输到另一个区域的小狗和狗的CDV状态。在一个实施方案中，本发明的诊断测试和方法被用于检测CDV在已经充分接种疫苗、但是仍然已经发生CDV感染征状的狗(或其它动物)中的存在。使用本发明的方法，可能确定疾病的病原因子的基因型，并确定疾病征状是由疫苗株造成的，还是由疫苗接种未中和的遗传变体的重复感染造成的（即所述疫苗没有提供针对遗传变体的保护）。

下面的实施例进一步例证了本发明，所述实施例不应解释为以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1. 7种CDV分离株的初步研究

犬瘟热病毒(CDV)是一种高度传染性的病毒，其造成狗的多系统疾病。接收了来自美国的狗中的7个CDV病例。这些CDV分离株在表达犬信号传递淋巴细胞-活化分子(SLAM)的Vero细胞系中形成大的、多核的合胞体(下面描述)。基于血凝素基因序列，来自3个州(CA、MO和OK)的CDV分离株形成2个CDV遗传组: 组I (主要的，6/7)由与CDV的欧洲野生谱系密切相关的CDV分离株组成。组II (次要的，1/7)在遗传上与CDV的北极-样谱系有关。但是，两个CDV组都在遗传上不同于目前的疫苗菌株，后者属于老的(1930-1950) CDV分离株的美洲-1谱系。

在该研究中，使用H基因序列，进行来自美国的7种CDV分离株的进化和遗传分析。使用体外细胞培养系统，研究H基因序列变化的生物学效应。死前样品包括眼拭子、鼻拭子和用EDTA抗凝的末梢血。将所述拭子接收进1-2 ml冷的生理盐水，在收集后24 h内，放在冰上过夜递送。未测试尿样。死后样品来自扁桃体、脑、膀胱和肺(Kubo, T., Y. Kagawa, H. Taniyama,和A. Hasegawa. 2007. Distribution of inclusion bodies in tissues from 100 dogs infected with canine distemper virus. J. Vet. Med. Sci. 69:527-529)。将大约2-5 g 每个组织接收进试管中，放在冰上过夜递送，用于病毒学检测。从来自美国3个州的7个CD疑似病例(俄克拉荷马，4个；密苏里州，1个；和加利福尼亚，2个)，得到样本。

为了直接的荧光抗体检测，以8-μm厚度切割组织，并用丙酮 (75%)-甲醇(25%)混合物在室温固定。Veterinary Medical Research and Development(VMRD), Pullman, WA, USA供给预滴定的、批次之间检验过的缀合物，用于兽医诊断用途。作为质量控制/质量保证的一部分，在用于阴性和已知的阳性CDV对照之前，测试缀合物。加入现成即可使用的、预稀释的、荧光素异硫氰酸酯-标记的抗-CDV 单克隆抗体(VMRD, Pullman, WA)或多克隆抗体缀合物(VMRD, Pullman, WA)以后，在37℃温育切片30 min。洗涤未结合的抗体缀合物以后，用伊文思蓝复染色切片15 min。在缓冲的甘油 (pH 9.4)中固定化以后，通过荧光显微术，检查切片。阳性的细胞显示出在细胞质中的苹果绿荧光，阴性细胞是红棕色。

为了分离，将来自CDV-感染的样品的组织剁碎，冻融两次，以释放病毒，并在8,000 x g离心。通过0.22 μm注射过滤器，过滤澄清的上清液。Vero细胞系源自在日本的正常成年非洲绿猴(Ceropithecus)的肾。如Seki 等人以前所述 (Seki, F., N. Ono, R. Yamaguchi,和Y. Yanagi. 2003. Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in Vero cells expressing canine SLAM (CD 150) and their adaptability to marmoset B95a cells. J. Virol. 77:9943-9950)，通过用犬信号传递淋巴细胞活化分子 (SLAM, 也称作CD150) 转染Vero细胞，衍生出重组细胞系。在37℃，温育接种物(约1 ml/25-cm²培养瓶) 1 h，每20分钟进行摇动。在接种表达犬SLAM的重组Vero细胞系以后，加入含有5%胎牛血清的约3.5 ml Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(Cellgro, Hendron, VA)。每天检查细胞的细胞病变效应(多核的-合胞体形成) (Seki, 同上)。已经发现，表达犬SLAM 的Vero细胞可以用于CDV的初步分离 (Lan, N.T., R. Yamaguchi, K. Uchida, S. Sugano,和S. Tateyama. 2005. Growth profiles of recent canine distemper isolates on Vero cells expressing canine signaling lymphocyte activation molecule (SLAM). J. Comp. Path. 133:77-81)。

为了从样本提取总RNA(宿主和病毒RNA)，使用QIAmp病毒RNA提取试剂盒(Qiagen Inc., CA)。使用Nonodrop 分光光度计 (Nanodrop Technologies, CA)，通过A₂₆₀/A₂₈₀，检查RNA的质量和数量。

为了检测CDV RNA，使用基于核衣壳(N)基因的逆转录酶 (RT)-PCR (Kim, Y.H., K.W. Cho, H.Y. Youn, H.S. Yoo,和H.R. Han. 2001. Detection of canine distemper virus (CDV) through one step RT-PCR combined with nested PCR. J. Vet. Sci. 2:59-63)。该方法会提供高灵敏度，这是由于靶基因的嵌套扩增（nested amplification）、N基因的高拷贝数、和CDV分离株中N-基因的保守序列。简而言之，使用正向引物(引物1:5’-ATTTGGGATTGCTTAGGA-3’, SEQ ID NO: 34)和反向引物(引物2: 5’-GGCGCTCATCTTGGACAT-3’, SEQ ID NO: 35)，扩增第一轮产物。该方法是：在45℃反转录1小时、95℃ 3 min；30个在94℃变性30 s、在54℃退火30 s、并在72℃延伸1 min的PCR循环；最后在72℃延伸7 min，将反应混合物保持在4℃。对第一轮反应的小部分(1-微升)产物进行第二轮扩增，其中使用引物3 (5’-GTTAGCTAGTTTCATCCT-3’, SEQ ID NO: 36)和引物4 ( 5’-GGTCCTCTGTTGTCTTGG-3’, SEQ ID NO: 37)。第二轮的方法是：在95℃变性3 min；30个在94℃变性30 s、在54℃退火30 s、并在72℃延伸1 min的循环。最后在72℃延伸7 min，并在电泳之前，将反应混合物保持在4℃。第二轮扩增子的大小是419碱基对，这通过在琼脂糖凝胶分析中包含分子大小标准品来验证。

为了CDV基因分型，使用H基因作为靶标 (Martella, V., G. Elia, M.S. Lucente, N. Decaro, E. Lorusso, K. Banyai, M.Blixenkrone-Moller, N.T. Lan, R. Yamaguchi, F. Cirone, L.E. Carmichael,和C. Buonavoglia. 2007. Canine distemper virus (CDV) by hemi-nested multiplex PCR provides a rapid approach for investigation of CDV outbreaks. Vet. Microbiol. 122:32-42)。正向引物(引物204+, 核苷酸388-409, 5’-GAATTCGACTTCCGCGATCTCC-3’, SEQ ID NO: 38)和反向引物(引物232b-,核苷酸1543-1519, 5’-TAGGCAACACCACTAATTTRGACTC-3’, SEQ ID NO: 39) 产生1160碱基对的扩增子。H-基因RT-PCR方法是：在50℃反转录30 min，并在94℃ 2 min。PCR方法是：35个94℃ 1 min、50℃ 1 min和72℃ 3 min的循环，最后在72℃延伸10 min，将反应混合物保持在4℃。在检测(N基因)和基因分型(H基因) RT-PCR方法的每个运行中，包含阳性和阴性CDV对照。对于H基因序列的系统发生分析，在俄克拉荷马州俄克拉荷马城的俄克拉荷马医学研究基金会（Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK）处，对扩增子测序。对序列进行核苷酸的基础局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool for Nucleotides (BLASTN))分析 (Altschul, S.F., T.L. Madden, A.A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller,和D.J. Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nuc. Acid Res. 25:3389-3402)，并与来自全球不同物种和地理区域的CDV分离株的GenBank H基因序列相对比。记录H基因序列的同一性百分比。此外，对H基因序列进行系统发生分析，并与保藏在GenBank中的疫苗CDV分离株(Ondersteport、Convac、Lederle和Snyder Hill CDV分离株)的H基因序列进行序列对比。与已知序列的前100个匹配比对被用于进行系统发生分析，其中使用Jukes-Cantor方法(NCBI, MD)进行邻域连接。

使用水性Romanowsky染色，对来自2个CD病例样品 (OADDL 07091030和 OADDL 07091031)的末梢血膜进行染色，并通过光学显微术进行检查。两种血膜都揭示在嗜中性粒细胞和淋巴细胞的细胞质内的众多嗜酸性粒细胞性结构，与CDV包涵体相一致(图36)。通过在两个病例中直接的荧光-抗体检验，证实CDV包涵体的存在。

在含有犬SLAM/CD150的Vero细胞系中，成功地分离出了7个CDV阳性样品中的6个。CDV分离株的细胞病变效应的特征在于，在接种后1-2天形成的多核合胞体。通过血凝素基因的RT-PCR，进一步检测CDV的存在。1个CDV样品 (OADDL 07061535)仅通过H基因的RT-PCR和测序进行检验；没有足够的样品用于病毒分离。

基于H基因的RT-PCR和随后的测序，在CDV分离株(OK-1、OK-2、OK-3、OK-4、CA-1和CA-2；主要组I)中，与来自密苏里州的犬CDV分离株19876的同一性水平最高，所述犬CDV分离株19876与丹麦貂 CDV分离株在遗传上最相关(Pardo, I.D.R., G.C.Johnson,和S.B. Kleiboeker. 2005. Phylogenetic characterization of canine distemper viruses detected in naturally infected dogs in North America. J. Clin. Microbiol. 43:5009-5017)。因而，它是该研究中的主要CDV变体(7个分离株中的6个)。这6个CDV分离株属于CDV分离株的欧洲野生谱系。但是，发现1个分离株(MO-1; 次要组II) 在遗传上与来自密苏里州的犬CDV分离株21260最类似(Pardo, 同上)，后者与小熊猫CDV分离株密切相关。该CDV分离株属于CDV分离株的北极-样谱系。在表1中总结了关于2007 OADDL CDV分离株的信息，在图1-7中提供了这些分离株的H基因的部分核苷酸序列。

表1. OADDL犬瘟热病毒(CDV)分离株

¹I -不完全疫苗接种; NV = 未接种疫苗; V = 接种疫苗

²所有分离株与当前的疫苗分离株(Ondersteport、Lederle和Convac) 具有小于90%同一性

³所有分离株与美国MO 19876 CDV分离株具有小于90%同一性，但是MO-1除外，其属于北极谱系

⁴在支持疗法后，动物完全恢复

⁵EW = 欧洲野生；A = 北极

⁶nd = 没有进行。

CDV分离株中的血凝素糖蛋白相差大约10%，包膜蛋白H决定了病毒的细胞病理学和趋性 (von Messling, V. G. Zimmer, G. Herrler, L. Haas,和R. Cattaneo. 2001)。在初步分析中，将OADDL CDV分离株与GenBank中的所有H序列相对比，发现CDV分离株簇集在地理上不同的谱系中。例如，所有阿根廷CDV分离株形成一个独特簇。基于地理学和H基因种系发生，南美洲CDV分离株未被包含在最近的CDV分离株分析中(McCarthy, 同上)。但是，它们形成一个独特的南美洲簇。在最近的文章中，术语基因型、簇和谱系已经被不同的研究人员互换使用，但是关于CDV 种系发生的结果在所有研究中是类似的(Martella, V., F. Cirone, G. Elia, E. Lorusso, N. Decaro, M. Campolo, C. Desario, M.S. Lucente, A.L. Bellacicco, M. Blixenkrone-Moller, L.E. Carmichael,和C. Buonavoglia. 2006. Heterogeneity within the hemagglutinin genes of canine distemper virus (CDV) strains in Italy. Vet. Microbiol. 116:301-309; McCarthy, supra; Mochizuki. M., M. Hashimoto, S. Hagiwara, Y. Yoshida, 和S. Ishiguro. 1999. Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutinin genes of recent isolates from dogs in Japan. J. Clin. Microbiol. 37:2936-2942)，包括本分析，因为所有研究人员使用GenBank登记序列。已经提出，CDV的特定基因型的一个成员在H基因序列的核苷酸中具有超过95%同一性(Mochizuki, 同上)，且因而，基因型内变化小于5% (Martella, 同上)。

从来自俄克拉荷马的3-月龄雌性混合品种接种疫苗的狗得到CDV分离株OK-1 (OADDL 07061535)，所述狗具有结膜炎史、鼻涕和体重减轻。所述狗尚未完成疫苗接种的完整过程，且具有漫游和咬食垃圾史。该CDV分离株与CDV分离株19876 (GenBank 登录号 AY964110.1)具有最大同一性(98%)。基于H基因分析，CDV分离株19876与OK-1一起属于CDV分离株的欧洲野生谱系。

从来自俄克拉荷马的11-月龄未接种疫苗的西伯利亚雪撬犬的组织库，得到CDV分离株OK-2 (OADDL 07091030)。在尸检后，结膜和气管上皮含有胞质内的、嗜酸性包涵体，其被透明的晕圈包围。在扁桃体中，存在显著的淋巴消耗和许多在上皮中的包涵体。该分离株与CDV分离株19876 (犬起源, 密苏里州)具有最大同一性(98%)，与来自匈牙利(GenBank 登录号 EF095750.1)、丹麦貂 (Z47759.1)和小熊猫 (AF178039.1) 的CDV分离株、CDV株A75/17 (AF164967.1) 和来自德国雪貂分离株的麻疹病毒(X84999.1)具有94%同一性。来自美国的CDV分离株A75/17被视作野外CDV分离株的毒力原型(Simon-Martinez, 同上)。H基因与疫苗分离株(Convac、Lederle和Ondersteport)的同一性水平是89%。

从在俄克拉荷马庇护所中的狗，得到CDV分离株OK-3 (OADDL 07091031)。得到血液管（blood tube），但是不可得到该病例的其它历史。在末梢血膜上的白细胞中，观察到与CDV一致的包涵体，并通过直接荧光-抗体检验来进一步证实。通过病毒分离，血样是CDV阳性的。对H基因测序，且与CDV 犬分离株19876 (GenBank 登录号 AY964110.1)具有99%同一性，与来自匈牙利 (EF095750.1)、丹麦貂 (Z47759.1)和小熊猫 (AF178039.1)的CDV分离株、CDV病毒株A75/17、CDV分离株01-2641和德国雪貂麻疹病毒株(X84999.1)具有95%同一性。

从来自俄克拉荷马动物庇护所收养的狗的组织库(膀胱和肺)，得到CDV分离株OK-4 (OADDL 07091032)。该CDV分离株与CDV分离株19876 (GenBank 登录号 AY964110.1)具有最大同一性(96%)。以递减次序，它与来自匈牙利(EF095750.1)、小熊猫(AF178039.1)和丹麦貂(Z47759.1)的CDV分离株具有93%同一性；与疫苗分离株具有84%同一性；与海豹瘟热病毒具有70%同一性。

从死于CD的来自加利福尼亚的10-周龄雄性接种疫苗的美洲牛头犬的组织库，得到CDV分离株CA-1 (OADDL 07101508)。4个同胞仔中的3个死于CD，具有呼吸道征象、角化过度和癫痫发作。在3个死亡的同胞仔中，可以得到1个同胞仔的尸检报告。尸检时，它的肺是坚硬且充血的。4个同胞仔之一的尸检结果是完全正常的。H基因序列与犬起源 CDV分离株19876 (GenBank 登录号 AY964110.1)具有98%同一性。所述CDV分离株与匈牙利CDV分离株、小熊猫分离株(AF178039.1)和CDV株A75/17 (AF164967)具有94%同一性。CDV H基因序列与CDV分离株01-2641 (AY526496.1)具有93%同一性。该CDV分离株的H基因缺少在所有疫苗CDV分离株中存在的Pst I位点(Demeter, Z., B. Lakatos, E.A. Palade, T. Kozma, P. Forgach,和M. Rusvai. 2007. Genetic diversity of Hungarian canine distemper virus strains. Vet. Microbiol. 122:258-269)。

从具有与CD一致的临床征象的CDV疫苗接种的10-周龄德国魏犬的鼻和结膜拭子，得到CDV分离株MO-1 (OADDL 07110098)。所述狗发生‘口香糖’癫痫发作、增厚的脚垫、咳嗽、鼻涕和充血的肺。在安乐死之前收集拭子，并在细胞培养物中分离CDV。CDV分离株H基因与来自密苏里州的CDV分离株21261和18133具有最大同一性(98%)，与来自意大利 (48/05和179/94)和匈牙利 (H06Bp10S、H06Bp8F、H05Bp7F、H05Bp6F和H05BpBp5F)的CDV分离株具有97%同一性。该CDV分离株的H基因序列与来自格陵兰狗的CDV分离株具有95%同一性，与CDV 19876仅具有90%同一性。它与疫苗CDV分离株具有89%同一性，与海豹瘟热病毒H基因具有70%同一性。此外，该CDV分离株缺少在所有疫苗CDV分离株中存在的Pst I 限制位点(Demeter, 同上)。基于系统发生分析，该分离株属于CDV分离株的北极-样谱系。

从具有呕吐、腹泻和淋巴细胞减少史的32-月龄的阉割的雄性的接种疫苗的边界柯利犬的鼻、咽、扁桃体和结膜拭子的组合，得到CDV分离株CA-2 (OADDL 07111080) 。H基因序列与CDV分离株19876具有最大同一性(96%)。该分离株与匈牙利CDV分离株、小熊猫CDV分离株和丹麦貂CDV分离株具有93%同一性；与CDV株A75/17 (GenBank 登录号 AF164967.1)具有92%同一性；与德国雪貂 CDV分离株具有92%同一性。基于系统发生分析，该CDV分离株与欧洲野生谱系的CDV分离株聚簇。该狗在治疗后恢复，且已经在最后的3个月中在临床上是健康的。在天然暴露于欧洲野生谱系的CDV分离株以后，该狗的存活可能是由于基于年龄的抗性、遗传抗性和用商业的CDV疫苗完整接种以后的免疫。在从CDV感染恢复后3个月，通过CDV血清中和，该狗具有1:16的CDV滴度。

发现6种OADDL 2007 CDV分离株中的5种会在表达犬SLAM受体的Vero细胞系中生成多核的合胞体。已经提出，合胞体大小与CDV分离株的毒力程度有关(Cosby, S.L., C. Lyons, S.P. Fitzgerald, S.J. Martin, S. Pressdee, I.V. Allen. 1981. J. Gen. Virol. 52:345-353)，因为它与CDV在细胞之间传播的能力有关。在细胞培养物中的侵入性传播、在天然地表达SLAM/CD150的犬淋巴细胞中生成大量包涵体的能力、和在接种疫苗的狗中造成致命感染的能力指示，欧洲野生谱系的这些犬分离株对狗是有毒力的。

该实施例表明，EW谱系正在作为美国的优势CDV分离株而出现。

实施例2. 其它的CDV分离株

使用在实施例1中所述的方法，鉴别出其它的CDV分离株，并列出在表2中。

表2. OADDL犬瘟热病毒(CDV)分离株

¹起源州；na = 不可得到

²临床征象：R = 呼吸道的(咳嗽、眼和鼻排泄物、喷嚏)；N = 神经的(震颤、颤搐、排尿变化、外表僵化)

³CPE = 细胞病变效应：+ =阳性的；- = 阴性的；+/- = 疑似；na =不可得到

⁴疫苗接种状态：V = 接种疫苗；NV = 未接种疫苗；na =不可得到

⁵CDV谱系：EW = 欧洲野生；Am-2 = 美洲-2。

实施例3. 继续研究新出现的CDV分离株：最新的美国犬瘟热病毒之间的细胞病理学(CPE)差异

在实施例1和2中得到的结果促进了分离和表征来自美国的其它CDV分离株的后续工作。如实施例1所述，进行研究。将CDV样品接种进Vero+SLAM细胞系中。大多数CDV分离株产生具有大量核的大合胞体。更小数目的CDV分离株产生具有少数细胞核的更小尺寸的合胞体。在几种CDV分离株中，在接种后18-24小时，在病毒样品接种后出现多个合胞体 (快速增长的CDV分离株)。在有些CDV分离株中，合胞体的边界被几乎圆形的边缘很好地限定。在其它CDV分离株中，合胞体的边界没有被清楚地限定。这些“模糊的”CPE CDV分离株倾向于快速传播，子代合胞体贴近母代合胞体。在其它CDV分离株中，子代合胞体出现在远处，指示病毒生长的另一个集落(多个集落)。简而言之，CDV分离株表现出变化的细胞病理学。来自美国的CDV分离株的差别在于：CDV分离株的合胞体形成的速度(快和慢)、传播(大和小)、尺寸、形状(圆形和不规则)以及对宿主细胞的侵袭力。这些生物学性质可能支持当前疫苗提供的保护。例如，关键病毒基因的密码子选择可以影响CDV的复制效率，如在实施例11中所讨论的。

实施例4. CDV分离株序列的对比遗传分析: 相对优选的密码子选择(RPCU)

已知10个血凝素残基(29、178、180、225、386、412、475、530、549和603)在CDV谱系中是在阳性选择下(McCarthy, 同上)。对分离株的血凝素(H)基因测序或部分测序，得到的序列如图1-33所示。使用具有Bio-edit程序的CLUSTAL W，将来自野生型CDV分离株的部分H-基因序列(约核苷酸534-1236血凝素基因片段)与来自GenBank的参照CDV序列相比对。应当指出，含有EW株的参照序列的病毒分离株没有被分离、在细胞系中繁殖或表征。通过在组织提取物上进行的测序，得到参照EW序列。

在图34A-F中描绘的RPCU分析的结果显示出下述内容：

在Ondersteport-样疫苗（诸如Galaxy、Proguard、Continuum、和Vanguard）中，在残基180处，密码子是AGT。但是，在欧洲野生(EW)谱系中和在所有野生型CDV分离株中，该密码子是GGT。该密码子可以用于设计Taqman RT-PCR，以将Ondersteport-样疫苗与在美国循环的野生型CDV分离株区分开。

在所有疫苗中，在残基225处，密码子是编码天冬氨酸(D)的GAC。但是，在美洲-2 CDV中，它是AAC，在浣熊瘟热病毒(RDV) 09050216中，它是CAC (编码组氨酸, H)。

在所有 Ondersteport-样疫苗 (除了Pfizer疫苗以外的全部)中，在残基386处，密码子是ACC (苏氨酸, T)。但是，在EW、AM-2和AR谱系CDV 野生型病毒中和在Pfizer疫苗中，它是TAC。该密码子因而可以用于开发示差Taqman RT-PCR，用于将大多数商业的CDV疫苗与野生型CDV分离株区分开。

在疫苗和野生型CDV病毒中，在残基412处，密码子是CCT，其编码脯氨酸(P)。但是，在分离株07110098中，它是CAT (编码组氨酸, H)，对于CDV的北极-谱系，也是如此。

从密码子选择对比分析，已经开发了相对优选的密码子选择(RPCU)。RPCU分析的一个目标是鉴别适用于制备广谱疫苗的RNA病毒分离株(例如CDV分离株)，所述广谱疫苗能够提供针对在特定地理区域(例如美国)循环的大多数分离株的保护。RFCU 也允许基于密码子选择评价在目标区域以外的分离株的遗传距离。RPCU是部分地基于下述观察，即除了氨基酸残基以外，密码子本身是在进化选择压力下(Gustavo 等人, Lost in Translation: Codon Usage and HIV-1 Evolution, AIDS Reviews 2004; 6:54-60)。

为了开发和实现RPCU分析，建立了在图34A-F中描绘的密码子选择表，其中每个项目显示了单个三联密码子的3个核苷酸。使用多联体方案，例如使用具有MEGA4.1软件的Excel程序，也可以建立密码子选择表。为了建立该表，首先，使用BioEdit 软件，对所有序列进行CLUSTAL W分析。然后，将与编码序列在框架内的核苷酸的三联体手工地输入Excel表中。以此方式，分析血凝素蛋白的残基位置155-428，并在表中包括目标残基的密码子。对于每个残基位置，在列的底部，用小写字母重新书写使用的密码子，并使用单个大写字母指示编码的氨基酸。也指出了不会导致氨基酸变化(置换突变, S/-)的替代密码子。例如，残基位置176使用2个密码子(tct和tcc，二者都编码丝氨酸, S)。还通过在列底部的“O”，指出Ondersteport序列与表中的所有其它密码子唯一不同的残基位置(即是离群值)，例如残基位置180和186。在所有CDV分离株中，有些残基位置是相同的。这些相同的残基位置在密码子选择表中未显示，因为它们不会影响CDV疫苗分离株的选择。

为了鉴别在每个残基处相对优选的密码子，逐个残基地（即逐列地）检查整个表。例如，在代表在残基位置185处的密码子的列中，使用CCA或TCA来编码在该位置处的氨基酸。但是，CCA是比TCA更优选的密码子，因为CCA存在于大多数分离株中。类似地，确定在每个残余物位置处的优选密码子。对于有些残基，也鉴别最低优选的密码子。可以看出，大多数最低优选的密码子存在于美洲-2和北极分离株中。相对优选的密码子选择的这种模式可以是EW胜过AM-2和AR CDV分离株的生物学优点的主要原因之一。犬瘟热病毒在环境中是不稳定的，但是高度传染性的，类似于麻疹病毒。由于生物学上更拟合的密码子选择和更高的复制滴度和脱落（shedding）(例如在鼻分泌物和狗群体的其它递送入口中)，在具有复制优点的地理区域中的CDV分离株具有传播和影响甚至接种疫苗的狗的能力。因而，密码子选择是致病因子(诸如CDV的H蛋白)的最小功能单位，对宿主群体中的流行病学的、生物学的和疾病结果具有影响。

如上所述，本发明的RPCU分析的一个主要目的是鉴别一种或多种用于广谱CDV疫苗开发的CDV分离株。优选地，含有或基于这样的CDV分离株的疫苗制品会提供针对目前在美国循环的大多数CDV分离株的感染的保护，或至少减轻与这样的感染有关的有害征状。使用在大多数残基位置(例如在位置185、192、193、203、205等)处的优选密码子，鉴别出EW分离株09041474B，并因而选择用于进一步疫苗开发。

部分地开发了RPCU方案，因为尚未确定对于CDV H蛋白的免疫原性而言至关重要的残基。RPCU分析会提供在缺少H蛋白残基的抗原特征的详细知识的情况下鉴别稳健的CDV疫苗候选物的方法。RPCU可以用于分析并也从其它类型的RNA病毒的分离株中选择疫苗候选物，并在新出现的病毒尚未得到较好研究、但是需要紧急疫苗接种来阻止暴发扩散的情况下，是有用的。

此外，本文所述的新的变体AM-2分离株具有更高的对密码子选择特异性的分离株(通过RPCU测得)，并且，尽管这使得它们不太适合广泛反应性的CDV疫苗，这些遗传上独特的分离株会成为优秀的攻击病毒，以检查改良的CDV疫苗的效能。RPCU与自我优化相一致，因为新宿主适应是动物和人的新出现的病原体进化的根本原因之一。

实施例5. 最近的CDV序列、每个CDV遗传谱系来自Gen-Bank的参照CDV序列和所有商业的CDV疫苗的系统发生分析

图35 显示了与商业的CDV疫苗株和所有已知的CDV遗传谱系的GenBank参照序列（包括南美洲序列）相比，来自最近的美国CDV 样品的几个CDV 血凝素部分序列的系统发生分析。得到的观察结果如下：

美洲-1 (AM-1)遗传谱系：参照序列=AF378705, 来自二十世纪五十年代的Ondersteport株；来自美国病例的当前循环的CDV分离株都不属于该CDV谱系。大多数当前的商业的CDV疫苗(Continuum DAP，Intervet (n=1批)；Duramune Max 5，Fort Dodge (n=1批)；Galaxy DA2PPv，Schering Plough (n=3批)；Merial (重组金丝雀痘携带的CDV-H基因疫苗(n=1批)都是基于AM-1谱系。

美洲-2 (AM-2)遗传谱系：参照序列=AF112189；Z47762；AF259552。基于系统发生分析，3个参照序列分散在CDV树的3个位置，用具有下划线的序列显示所述位置。除了1种AM-2 CDV分离株以外，都与AF112189 参照序列一起聚簇并靠近。在该研究中分离了共8种AM-2 CDV分离株。美洲-2是现在在美国循环的第二大簇CDV。来自该谱系的分离株应当被包含在更新的CDV疫苗中，且因而已经保藏在ATCC (Manassas, VA)。

北极(AR)遗传谱系：2个参照序列(AY964112和AY964108) 构成该簇。我们在该簇中鉴别出了少数美国样品。(07110098; 08040383)样品都来自美国密苏里州。这是次要CDV遗传簇。该CDV谱系适合美国的某些部分。

亚洲-1 (AS-1)遗传谱系：3个参照序列(AB016776；AB 212963；AY378091)构成该簇。美国CDV分离株都与该谱系无关。已经在日本、中国和韩国报道了这类CDV谱系。这些亚洲国家的CDV疫苗可以包括该谱系。

亚洲-2 (AS-2)遗传谱系：2个参照序列(AB0470767和AB 252718) 构成该遗传簇。美国CDV分离株都与该谱系无关。已经在日本、中国和韩国报道了这类CDV谱系。这些亚洲国家的CDV疫苗应当包括该谱系。

欧洲-野生(EW)遗传谱系：该谱系的参照序列是AY964110。大多数来自美国的EW CDV分离株(n=14)在CDV参照株周围聚簇。但是，2个EW单独地分支。CDV分离株的该主要簇应当被包含在用于美国狗的更新的CDV疫苗中。

欧洲(E) CDV谱系：该谱系簇仅含有2个参照序列(AF478550, DQ494318)。Pfizer CDV疫苗分支接近该簇。

南美洲(SA) CDV谱系：4个参照CDV序列在该谱系中聚簇。这些分离株成为该树的新分支，表明它们是美国分离株和当前的疫苗所特有的。

麻疹病毒Edmonton B序列被用作离群值序列，用于与美国疫苗和当前的分离株进行对比，用于系统发生分析。

在南非已经描述了潜在的新的CDV谱系(Woma, 同上)。

实施例6. 疫苗开发

必须克服CDV疫苗开发的现有技术中的许多限制，以选择用于改良的CDV疫苗开发的分离株。CDV疫苗的主要限制之一是来自疫苗接种失败的病例的CDV分离株的可用性。CDV疫苗接种失败的问题尚未得到充分理解，没有大量公开的数据支持这些观察。此外，当前的兽医诊断技术尚未广泛地应用于疫苗接种失败的问题，这是由于缺少可利用的方法和表现出神经学征状的死前样品的诊断检验的成本。因而，在本发明之前，在提高CDV疫苗的质量方面，关于当前的 CDV分离株的数据是非常有限的，主要由在很大程度上被忽略的孤立的报告和单只狗的报告组成。毋庸置疑地这是因为已故狗的大多数主人不希望为进一步的医学研究付费，并简单地处理动物兽体。因此，不可得到进一步的科学信息。

使用针对在可商业得到的Onderstreport 犬瘟热疫苗中使用的美洲-1 CDV分离株的高免疫血清，对比了本文所述的34种CDV分离株。高免疫血清是一种有用的试剂，因为通过将多种疫苗施用给免疫活性的成年狗来制备它。高免疫血清会提供最好的病例方案。但是，在野外情形中，大多数狗会接受2种CDV疫苗，如小狗。因而，尽管高免疫血清是一种有用的试剂，它在设计并选择用于疫苗制品的CDV分离株方面具有限制。在这里，我们提出了一个新颖的生物信息学方案(上述的RPCU)，用于广谱CDV疫苗开发。在分析中包括了当前在美国循环的CDV的所有可利用的基因型。选择几个(例如每个CDV 基因型的至少3-5个分离株)(使用系统发生分析)，用于使用Bio-Edit的基于序列比对的抗原对比。这允许选择具有最大抗原距离的CDV分离株，并与当前的 CDV疫苗相对比。选择在血清中和试验（使用高免疫血清或来自已经接受仅2种疫苗的狗的血清）中低至少4倍的任意分离株，用于进一步的体内测试。

给血清阴性的和低血清阳性的小狗 (每组至少5只小狗)注射每种选择的(例如3种) CDV分离株谱系，作为单次注射多价CDV疫苗，或在2-3种不同遗传变体各自单独的背对背注射中（间隔3-4周）。该实验会鉴别出一种或多种广泛反应的CDV分离株，其会引起针对所有34种CDV分离株的更高水平的滴度。例如，通过RPCU分析鉴别出的分离株（诸如09041474B）被证实是广泛反应的分离株，这是由于H蛋白的共有的密码子。这翻译成更高的疫苗滴度、在挑战实验中更好的保护、在接种疫苗的狗中没有疾病的临床证据(或者，轻微的临床征状)、和更长的免疫持续时间。此外，使用RFCU选择的CDV分离株会提供针对在其它洲中存在的其它遗传和抗原变体的广泛保护。

还使用其它标准来选择用于修饰的活病毒疫苗中的CDV分离株，包括下述的：

A). CDV分离株应当在批准的非重组细胞系（诸如Vero和犬肾细胞系）上生长至高滴度(10⁶或更高)。预见到，CDV分离株会在重组Vero+ SLAM (信号传递淋巴细胞活化分子)细胞系上生长至更高的滴度(2-3 log更高的滴度)。尽管重组的Vero SLAM适合麻疹病毒的初步分离，在其中繁殖CDV分离株是昂贵的，因为需要加入选择抗生素庆大霉素。选择在USDA批准用于动物疫苗生产的一种或多种非重组Vero细胞系中生长的CDV分离株，用于进一步繁殖。

B). CDV分离株的生长速度是另一个评价标准。大多数CDV分离株可以在3天内生长至高滴度。但是，在常规Vero细胞系或狗肾细胞中，生长稍微更慢。

C). 选择来自主要EW-分支的少数CDV分离株(n=5)，用于作为疫苗抗原进一步评价。也选择来自第二大簇 (AM-2)的少数分离株(n=5)作为疫苗抗原。还评价了少数北极CDV分离株。

实施例7.  广谱CDV疫苗的制备

通过CDV- 血清中和(CDV-SN)和/或噬斑减少试验，选择和证实广泛反应性的且占优势的CDV分离株(例如通过RPCU鉴别出的候选物)。在有些实施方案中，这是从充分接种疫苗的成年狗(超过5-6月龄)得到的野生型CDV分离株，尽管所述狗被完整疫苗接种 (具体地，2种CDV疫苗)，仍然死亡。

给狗皮下地或鼻内地接种疫苗。使用来自接种疫苗的狗的血清，通过CDV-SN或噬斑减少试验，检查针对疫苗株的抗体滴度。选择的CDV株显示出与一组来自美国的最近的CDV分离株（属于在美国循环的所有CDV谱系）的高交叉反应性。检查所有分离株与来自接种疫苗的狗或雪貂 (CDV的实验室模型动物)的血清的交叉反应性。使用CDV-SN试验，在给6-8周龄的原初小狗接种1次疫苗以后，≥1:8、优选≥1:16、更优选≥1:32和最优选≥1:64的滴度是足够的。另外，所述疫苗不会诱导针对CDV的任何脑脊液(CSF)滴度。在CSF中缺少CDV滴度，指示所述疫苗病毒尚未穿过血脑屏障，对于用于小狗而言是安全的。在小狗中安全的疫苗在狗中非常可能是安全的。总之，遵循联邦管理法规(CFR)的所有指南，来开发有效的广谱且安全的CDV疫苗，其将被USDA批准用于狗和易感CDV的其它物种。

进行了挑战研究，其中给狗接种广谱CDV疫苗，然后暴露于循环的野生型CDV (例如08080696 EW; 08081112 AM-2; 09011024 EW)。这些CDV病毒在遗传上是不同的，所以适合作为攻击病毒，而不是作为疫苗组分。用本发明的疫苗制品接种的狗几乎没有发生或没有发生疾病征状。本文所述的来自美国的低传代 CDV分离株可以用作攻击病毒。未接种疫苗的对照会发生CDV的征状。

关于评价挑战研究的结果，诊断实验室通常使用相对不敏感的试验，所述试验可能不检测弱的CDV阳性病例，诸如涉及神经系统的那些。在动物死后，或处死或安乐死以后，使用脑样品的免疫组织化学，可以检测CDV。但是，CSF和脑活组织检查是昂贵的和侵入性操作，并不常用。在一项最近的研究中，已经将尿描述为敏感样品用于检测活狗中的CDV (Amude, A.M., A.A. Alfieri,和A.F. Alfieri. 2006. Antemortem diagnosis of CDV infection by RT-PCR in distemper dogs with neurological deficits without the typical clinical presentation. Vet. Res. Comm. 30:679-687)。因而，病毒尿症(在尿中存在CDV病毒或RNA) 可能是在疫苗-保护评价研究中包含的一个重要参数，且可以非侵入性地用于检测CDV疫苗接种的狗中的残余病毒。此外，在广泛的深入诊断研究后，已经发现，CDV可以造成残余CDV感染，这在过去的CDV疫苗批准过程中没有评价。使用高度敏感的PCR试验，并提供关于改良的广谱CDV疫苗的安全性数据。使用病毒尿症作为CDV疫苗效能的参数之一。

一种理想的候选CDV疫苗应当针对所有遗传上不同的CDV分离株进行保护。应当包括来自其它洲的CDV分离株，以检查广谱CDV疫苗的总覆盖范围。没有检查美洲-1，因为在过去20年中在美国在自然界中尚未发现该病毒，仅存在于在过去60多年中没有更新的疫苗中。

实施例8. 在雪貂模型中评价CDV疫苗

在大动物模型（诸如狗）中测试疫苗之前，可以在雪貂模型中评价它们。已知雪貂是CDV感染和CDV疫苗评价的适当模型 (Pillet 等人, 2009: Ferrets as a model for morbillivirus pathogenesis, complications, and vaccines. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 330:73-87)。使用雪貂来筛选大量CDV疫苗候选物。用减毒的修饰的活CDV、优选欧洲-野生类型(例如09041474B)，接种雪貂。欧洲-野生类型是优选的，因为这些CDV病毒的密切相关簇正在造成美国狗的疫苗接种失败。在疫苗接种后，检查雪貂中针对CDV的血清抗体滴度。抽血日期是疫苗接种后0、7、14和21天。然后给雪貂施用低传代的CDV病毒(例如欧洲野生、或北极、或美洲-2)，作为攻击病毒。

还已经记录，雪貂会表现出CDV疫苗接种失败，这基于最近的病例报告(Zehnder 等人, 2008: An unusual presentation of canine distemper virus infection in a domestic ferret (Mustela putorius furo) DOI: 10.1111/j)。在临床CDV问题开始之前18个月，以及此后每年，使用鸡胚胎改良的活病毒疫苗，重复接种来自美国的该驯养的雪貂。该接种疫苗的雪貂发生显示在皮肤病灶中的全身性CDV感染，具有延长的病程，仍然完全没有呼吸道和神经学征象。因而，在具有皮肤病灶的接种疫苗的雪貂中，疑似具有CDV (Zehnder, 同上)。

实施例9. 在CDV谱系中处于阳性选择的关键的H-蛋白残基：应用于诊断方法

根据诊断客户的具体要求，在关键的H-残基周围设计示差RT-PCR实验和试剂盒(包括引物) (参见实施例3)，以示差地检测CDV野生型；将Ondersteport-样疫苗与Pfizer疫苗区分开；并使用1小时出报告的快速试验，将CDV病毒细分为主要CDV谱系的水平。通过鉴别出在将来出现的新的CDV变体，通过完整H-基因测序实时监测CDV病毒可以进一步细化这些快速的CDV示差试验。

实施例10. 3种选择的CDV分离株在细胞培养物中的对比生长特征:

从在OADDL的一组当前的 CDV分离株中，选择2种CDV分离株(09041474B和08021509)，将它们保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。已经选择分离株09041474B用于开发针对当前的 CDV分离株的广谱CDV疫苗。

在细胞培养物中繁殖3种CDV分离株：09041474B (欧洲-野生)、08021509 (美洲-2)和07110098 (北极)，并基于细胞病理学观察它们的生长速率，当大部分单层(超过80%)培养物表现出细胞病理学时，冷冻培养瓶。结果表明，这些选择的分离株的生长速率如下：EW>>> AM-2>AR。换而言之，EW 09041474B分离株比AM-2和AR明显更快地生长。09041474的单个噬斑非常大。在23小时，整个培养瓶的细胞被非常大的合胞体覆盖，所述合胞体彼此接触 (融合)，在合胞体之间几乎不剩下空间。

最初，分离株08021509 (AM-2)表现出中等大小的噬斑，并生长成孤立的噬斑(未融合的噬斑)。AM-2分离株的生长速率至少是09041474B的一半或更少。在接种后约96小时，收获该分离株。

北极分离株07110098非常缓慢地生长，噬斑大小较小。仅检测到少数孤立的小噬斑。该分离株没有保藏在ATCC。在感染后7天，收获该分离株。甚至在1周，单层培养物仅表现出约25%的细胞病理学。基于这些生长特征，该分离株不适用于疫苗制品。

由09041474B表现出的活跃复制类型指示最佳(稳健)生长，该生长从表现出高“相对优选的密码子选择(RPCU)”的CDV分离株预见到。已经选择该分离株用于疫苗制品，因为它在接种后复制至更高的滴度，并表达相对更高量的血凝素蛋白，即主要CDV 免疫原。09041474B的ATCC 保藏号是PTA-10596,保藏日期为2010年1月21日。08021509的ATCC 保藏号是PTA-10597,保藏日期为2010年1月21日。

实施例11. 保藏在马里兰州ATCC的2种示例性的/选择的CDV分离株的全长血凝素序列：

为了得到这2种CDV选择的分离株的全长序列，设计了新的引物：5’-TCGAAATCCTATGTGAGATCACT-3’ (正向引物, CDVff1, SEQ IS NO: 40)和5’-ATGCTGGAGATGGTTTAATTCAATCG-3’ (反向引物, CDVHS-2, SEQ IS NO: 41)。从2010年1月21日保藏在ATCC的相同批次的CDV分离株提取RNA。根据生产商的说明书，使用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒。已经公开了全长H-蛋白的引物(Lan NT, Yamaguchi R, Inomata A, Furuya Y, Uchida K, Sugano S和S Tateyama. 2006. Comparative analyses of canine distemper viral isolates from clinical cases of canine distemper in vaccinated dogs. Vet. Microbiol. 115:32-42)，但是没有描述RT-PCR方法。因而，基于引物的性质开发了新的方法。

一步RT-PCR方法如下：在45℃反转录1小时、在95℃变性3分钟；随后是30个在94℃ 30秒、在50℃退火30秒、在72℃延伸2分钟的循环；最后在72℃延伸7分钟，将反应物保持在4℃。

对于每个PCR反应，反应方案如下：12.5 ul 2X反应缓冲液 (Invitrogen，Cat#10928-034)，两种引物各自1.7 ul (15uM)，MgSO₄(50mM)，dNTP (10mM) 0.5ul和RT/platinum-Taq (0.5ul)。通过在1.5%琼脂糖凝胶上的电泳来纯化PCR扩增子。观察到约2100碱基对的正确的全长扩增子。在Promega Wizard柱上纯化扩增子。在Noble Research Center, Stillwater，OK进行测序。对CDV分离株的正向和反向序列进行序列分析(图37和38)。CDV分离株09041474B与欧洲-野生CDV分离株具有最高匹配。CDV分离株08021509与美洲-2 CDV分离株具有最高匹配。

尽管已经以它的优选实施方案的方式描述了本发明，本领域技术人员会认识到可以在所附权利要求的精神和范围内经过修改地实现本发明。因此，本发明不应限于上述的实施方案，而是进一步包括在本文提供的描述的精神和范围内的所有修改及其等效方案。

                         序列表

 

<110>  Board of Regents for Oklahoma State University

 

<120>  基于在北美狗中循环的犬瘟热病毒的

       免疫原性组合物、疫苗和诊断方法

 

 

<130>  10-032 WO

 

<150>  US 61/148,791

<151>  2009-01-30

 

<160>  45   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  866

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  1

aaggtgaatt ttactaacta ctgcgataca attgggatca gaaaatctat tgcatcggca       60

 

gcaaatccca tcctcctgtc agcactctct gggggcagag gtgacatatt cccaccatac      120

 

agatgcagtg gagctgctac ctcagtaggc agagttttcc ccctatcagt gtcattgtcc      180

 

atgtctttga tctcaagaaa atcagagata atcaatatgc taaccgctat ctcaaacgga      240

 

gtgtatggta aaacttattt actagtgcct gattatattg aagaggagtt cgacacacaa      300

 

aagattcgag tctttgagat agggttcatc aaacggtggc tgaatgacat gccattactc      360

 

cagacaacca actatatggt cctcccagag aattccaaag ctaaggtatg tactatagca      420

 

gtgggcgagt tgacactggc ttccttgtgt gtaggtgaga gcaccgtgtt gttatatcat      480

 

gacagcaatg gttcgcaaga tagtatccta gcagtgacgc tgggaatatt tggggcaaca      540

 

actatggatc aagttgaaga ggtgatacct gttgctcacc catcagtaga aaaaatacat      600

 

ataacaaatc accgtgggtt cataaaagat tcaatagcaa cctggatggt gcctgcattg      660

 

gtctctgaga aacaggaaga gcaaaaaaat tgtctggagt cggcttgtca aagaaaatcc      720

 

taccctatgt gcaaccaaac gtcatgggaa cccttcggag gaggacagtt gccatcttat      780

 

gggcggttga cattacctct agatccaagc actgaccttc aacttaacat atcgtttaca      840

 

tacggtccgg ttatactgaa tggaga                                           866

 

 

<210>  2

<211>  1054

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  2

ggtgaatttt actaactact gcgatacaat tgggatcaga aaatctattg catcggcagc       60

 

aaatcccatc ctcctgtcag cactctctgg gggcagaggt gacatattcc caccatacag      120

 

atgcagtgga gctgctacct cagtaggcag agttttcccc ctatcagtgt cattgtccat      180

 

gtctttgatc tcaagaaaat cagagataat caatatgcta accgctatct caaacggagt      240

 

gtatggtaaa acttatttac tagtgcctga ttatattgaa gaggagttcg acacacaaaa      300

 

gattcgagtc tttgagatag ggttcatcaa acggtggctg aatgacatgc cattactcca      360

 

gacaaccaac tatatggtcc tcccagagaa ttccaaagct aaggtatgta ctataggagt      420

 

gggcgagttg acactggctt ccttgtgtgt aggtgagagc accgtgttgt tatatcatga      480

 

cagcaatggt tcgcaagata gtatcctagc ggtgacggtg ggaatatttg gggcaacatc      540

 

tatggatcaa gttgaagagg tgatacctgt tgctcaccca tcagtagaaa aaatacatat      600

 

aacaaatcac cgtgggttca taaaagattc aatagcaacc tggatggtgc ctgcattggt      660

 

ctctgagaaa caggaagagc aaaaaaattg tctggagtcg gcttgtcaaa gaaaatccta      720

 

ccctatgtgc aaccaaacgt catgggaacc cttcggagga ggacagttgc catcttatgg      780

 

gcggttgaca ttacctctag atccaagcac tgaccttcaa cttaacatat cgtttacata      840

 

cggtccggtt atactgaatg gagacggtat ggattattat gaaagcccac tgtcggactc      900

 

cggatggctt accattcctc ccaaaaacgg aacagtcctt ggattgataa acaaagcaag      960

 

tagaggagac cagttcattg taatccccca tgtgttgaca tttgcgccca gggaatcaag     1020

 

tgggaattgt tatttaccta ttcaaacatc ccag                                 1054

 

 

<210>  3

<211>  785

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  3

ggtgaatttt actaactact gcgatacaat tgggatcaga aaatctattg catcggcagc       60

 

aaatcccatc ctcctgtcag cactctctgg gggcagaggt gacatattcc caccatacag      120

 

atgcagtgga gctgctacct cagtaggcag agttttcccc ctatcagtgt cattgtccat      180

 

gtctttgacc tcaagaaaat cagagataat caatatgcta accgctatct caaacggagt      240

 

gtatggtaaa acttatttac tagtgcctga ttatattgaa gaggagttcg acacacaaaa      300

 

gattcgagtc tttgagatag ggttcatcaa acggtggctg aatgacatgc cattactcca      360

 

gacaactaac tatatggtcc tcccagagaa ttccaaagct aaggtatgta ctatagcagt      420

 

gggcgagttg acactggctt ccttgtgtgt aggtgagagc accgtgttgt tatatcatga      480

 

cagcaatggt tcgcaagata gtatcctagc agtgacgctg ggaatatttg gggcaacatc      540

 

tatggatcaa gttgaagagg tgatacctgt tgctcaccca tcagtagaaa aaatacatat      600

 

aacaaatcac cgtgggttca taaaagattc aatagcaacc tggatggtgc ctgcattggt      660

 

ctctgagaaa caggaagagc aaaaaaattg tctggagtcg gcttgtcaaa gaaaatccta      720

 

ccctatgtgc aacccaaacg tcatgggaac ccttcggagg aggacagttg ccatcttatg      780

 

ggcgg                                                                  785

 

 

<210>  4

<211>  908

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (815)..(815)

<223>  n是a、c、g或t

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (880)..(880)

<223>  n是a、c、g或t

 

<400>  4

ctagtaagat caggtgaatt ttactaatta ctgctataca attgggatca gaaaatctat       60

 

tgcatcggca gcaaatccca tcctccagtc agcactctct gggggcagag gtgacatatt      120

 

cccaccatac agatgcagtg gagctgctac ctcagtaggc agagttttcc ccctatcagt      180

 

gtcattgtcc atgtctttga tctcaagaaa atcagagata atcaatatgc taaccgctat      240

 

ctcaaacgga gtgtatggta aaacttattt actagtgcct gattatattg aagaggagtt      300

 

cgacacacaa aagattcgag tctttgagat agggttcatc aaacggtggc tgaatgacat      360

 

gccattactc cagacaacca actatatggt cctcccagag aattccaaag ctaaggtatg      420

 

tactatagca gtgggcgagt tgacactggc ttccttgtgt gtaggtgaga gcaccgtgtt      480

 

gttatatcat gacagcaatg gttcgcaaga taatatccta gtagtgacgc tgggaatatt      540

 

tggggcaaca tctatggatc aagttgaaga ggtgatacct gttgctcacc catcagtaga      600

 

aaaaatacat ataacaaatc accgtgggtt cataaaagat tcaatagcaa cctggatggt      660

 

gcctgcattg gtctctgaga aacaggaaga gcaaaaaatt tgtctggagt cggcttgtca      720

 

aagaaaatcc taccctatgt gcaaccaaac gtcatgggaa cccttcggag gaggacagtt      780

 

gccatcttat gggcggttga cattacctct agatncaagc actgaccttc aacttaacat      840

 

atcgtttaca tacggtccgg ttatactgaa tggagacggn atggattatt atgaaagccc      900

 

actgtcgg                                                               908

 

 

<210>  5

<211>  380

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  5

aacttgtatc cggctcttgg gttgcatgag ttttccgggg agttaacaac cattgaatcc       60

 

cttatgatgc tatatcaaca gatgggtgaa acagcaccgt acatggttat tctggaaaat      120

 

tctgtccaga acaaatttag tgcaggatcc tacccattgc tctggagtta tgctatggga      180

 

gttggtgttg aacttgaaaa ctccatggga gggttaaatt tcggtagatc ctactttgac      240

 

ccagcttatt tcaggctcgg gcaagaaatg gttagaagat cggccggtaa ggtaagctct      300

 

gcacttgccg ccgagcttgg catcaccaag gaagaggctc agctagtgtc agaaatagca      360

 

tccaagacaa cagaggacca                                                  380

 

 

<210>  6

<211>  847

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  6

aagtgaattt tactagttac tgtgatacaa ttgggatcag aaaatccatt gcattggcag       60

 

caaatcccgt ccttttgtca gcactctccg gaggcagagg tgacatattc ccaccataca      120

 

gatgcagtgg agctactact tcagttggca aatctttccc cctatcagta tcattatcca      180

 

tgtctttgat ctcaagaaca tcagagataa tcaatatgct gacctctatc tcagacggag      240

 

tgtatggtaa aacttatttg ctagtgcctg attatattga aggggagttc gacacgcaaa      300

 

agattcgagt ctttgagata gggttcatca aaaggtggct gaatgacatg ccattattcc      360

 

agacaaccaa ctatatgatc ctcccggaga attctaaaac caaggtatgt actatagcag      420

 

tgggcgagtt gacactggct tccttgtgtg tagatgagag cactgtatta ttatatcatg      480

 

acagcaatgg ttcacaagat ggtattctag tagtgacgct gggaatcttt ggggcaacac      540

 

ctatggatca agtcgaagag gtgatacctg tcgctcaccc atcagtcgaa aaaatacata      600

 

taacaaatca ccgtggtttc ataaaagatt cagtagcaac ctggatggtg cctgcattgg      660

 

tctctgagaa cctagaggaa caagaaaatt gtctggagtc ggcttgtcag agaaaatcct      720

 

accctatgtg caatcaaaca tcatgggaac cctttggagg aggacagttg ccatcttatg      780

 

ggcggttgac gttacatcta gatgcaagca ttgaccgtca acttaacata tcatttacat      840

 

acggtcc                                                                847

 

 

<210>  7

<211>  871

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  7

tcaagaaaat cagagataat caatatgcta cccgctatct caaacggagt gtatggtaaa       60

 

acttatttac tagtgcctga ttatatgaag aggagttcga cacacaaaag attcgagtct      120

 

ttgagatagg gttcatcaaa cggtggctga atgacatgcc attactccag acaaccaact      180

 

atatggtcct cccagagaat tccaaagcta aggtatgtac tatagcagtg ggcgagttga      240

 

cactggcttc cttgtgtgta ggtgagagca ccgtgttgtt atatcatgac agcaatggtt      300

 

cgcaagatag tatcctagca gtgacgctgg gaatatttgg ggcaacatct atggatcaag      360

 

ttgaagaggt gatacctgtt gctcactcat cagtagaaaa aatacatata acaaatcacc      420

 

gtgggttcat aaaagattca atagcaacct ggatggtgcc tgcattggtc tctgagaaac      480

 

aggaagagca aaaaaattgt ctggagtcgg cttgtcaaag aaaatcctac cctatgtgca      540

 

accaaacgtc atgggaaccc ttcggaggag gacagttgcc atcttatggg cggttgacat      600

 

tacctctaga tccaagcact gaccttcaac ttaacatatc gtttacatac ggtccggtta      660

 

tactgaatgg agacggtatg gattattatg aaagcccact gtcggactcc ggatggctta      720

 

ccattcctcc caaaaacgga acagtccttg gattgataaa taaagcaagt agaggagacc      780

 

agttcattgt aatcccccat gtgttgacat ttgcgcccag ggaatcaagt gggaattgtt      840

 

atttacctat tcaaacatcc cagattatag a                                     871

 

 

<210>  8

<211>  900

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  8

gaattttact aattactgcg atacaattgg gatcagaaaa tctattgcat cggcagcaaa       60

 

tcccatcctc ctgtcagcac tctctggggg cagaggtgac atattcccac catacagatg      120

 

cagtggagct gctacctcag taggcagagt tttcccccta tcagtgtcat tgtccatgtc      180

 

tttgatctca agaaaatcag agataatcaa tatgctaacc gctatctcaa acggagtgta      240

 

tggtaaaact tatttactag tgcctgatta tattgaagag gagttcgaca cacaaaagat      300

 

tcgagtcttt gagatagggt tcatcaaacg gtggctgaat gacatgccat tactccagac      360

 

aaccaactat atggtcctcc cagagaattc caaagctaag gtatgtacta tagcagtggg      420

 

cgagttgaca ctggcttcct tgtgtgtagg tgagagcacc gtgttgttat atcatgacag      480

 

caatggttcg caagataata tcctagtagt gacgctggga atatttgggg caacatctat      540

 

ggatcaagtt gaagaggtga tacctgttgc tcacccatca gtagaaaaaa tacatataac      600

 

aaatcaccgt gggttcataa aagattcaat agcaacctgg atggtgcctg cattggtctc      660

 

tgagaaacag gaagagcaaa aaaattgtct ggagtcggct tgtcaaagaa aatcctaccc      720

 

tatgtgcaac caaacgtcat gggaaccctt cggaggagga cagttgccat cttatgggcg      780

 

gttgacatta cctctagatc caagcactga ccttcaactt aacatatcgt ttacatacgg      840

 

tccgggttat actgaatgga gacggtatgg attattatga aagcccactg tcggactccg      900

 

 

<210>  9

<211>  1133

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  9

gccgggctgc atcaccccct agtaagacag gtgaatttta cttattactg cgatacaatt       60

 

gggatcagaa aatctattgc atcggcagca aatcccatcc tcctgtcagc actctctggg      120

 

ggcagaggtg acatattccc accatacaga tgcagtggag ctgctacctc agtaggcaga      180

 

gttttccccc tatcagtgtc attgtccatg tctttgatct caagaaaatc agagataatc      240

 

aatatgctaa ccgctatctc aaacggagtg tatggtaaaa cttatttact agtgcctgat      300

 

tatattgaag aggagttcga cacacaaaag attcgagtct ttgagatagg gttcatcaaa      360

 

cggtggctga atgacatgcc attactccag acaaccaact atatggtcct cccagagaat      420

 

tccaaagcta aggtatgtac tatagcagtg ggcgagttga cactggcttc cttgtgtgta      480

 

ggtgagagca ccgtgttgtt atatcatgac agcaatggtt cgcaagataa tatcctagta      540

 

gtgacgctgg gaatatttgg ggcaacatct atggatcaag ttgaagaggt gatacctgtt      600

 

gctcacccat cagtagaaaa aatacatata acaaatcacc gtgggttcat aaaagattca      660

 

atagcaacct ggatggtgcc tgcattggtc tctgagaaac aggaagagca aaaaaattgt      720

 

ctggagtcgg cttgtcaaag aaaatcctac cctatgtgca accaaacgtc atgggaaccc      780

 

ttcggaggag gacagttgcc atcttatggg cggttgacat tacctctaga tccaagcact      840

 

gacccttcca acttaacata tcgtttacat accgtccggt tatacttgaa tggagacggt      900

 

atggataatt atgaaagccc actgtcggac tcggatggct taccatttcc ttccaaaacg      960

 

gaacagtcct tggattgata aacaaaccag taggggagac cagttcattg tatcccccat     1020

 

gtgttgacca ttgccccagg gaatcaaggg gaatgtattt acctattcaa ccttcccaaa     1080

 

taatgggata aaggatggcc ctcctgaatc caaattacgg tgttgcccta aac            1133

 

 

<210>  10

<211>  1120

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  10

ttggttaagg ccatcctttt tccctaatct gggctgtttg aataggtaaa taacaattcc       60

 

ccacttgatt ccctgggcgc aaatgtcaac acatggggga ttacaatgaa ctggtctccc      120

 

ctacttgctt tgtttatcaa tccaaggact gttccgtttt tgggaggaat ggtaagccat      180

 

ccggagtccg acagtgggct ttcataataa tccataccgt ctccattcag tataaccgga      240

 

ccgtatgtaa acgatatgtt aagttgaagg tcagtgcttg gatctagagg taatgtcaac      300

 

cgcccataag atggcaactg tcctcctccg aagggttccc atgacgtttg gttgcacata      360

 

gggtaggatt ttctttgaca agccgactcc agacaatttt tttgctcttc ctgtttctca      420

 

gagaccaatg caggcaccat ccaggttgct attgaatctt ttatgaaccc acggtgattt      480

 

gttatatgta ttttttctac tgatgggtga gcaacaggta tcacctcttc aacttgatcc      540

 

atagatgttg ccccaaatat tcccagcgtc actactagga tattatcttg cgaaccattg      600

 

ctgtcatgat ataacaacac ggtgctctca cctacacaca aggaagccag tgtcaactcg      660

 

cccactgcta tagtacatac cttagctttg gaattctctg ggaggaccat atagttggtt      720

 

gtctggagta atggcatgtc attcagccac cgtttgatga accctatctc aaagactcga      780

 

atctttttgt gtgtcgaact cctcttcaat ataaatcagg cacctagtaa ataaagttta      840

 

ccatacacct ccgtttgaga tagccggtta gcatattgat tatctctgat cctcttgaga      900

 

tcaaagacat ggacaatgac actgataggc gggaaaactc tgcctactga ggtagcagct      960

 

ctactgcttt tgttgggtgg gaaatattta accctttgcc cccgaaagtg cttacaggag     1020

 

gatgggattt gctgccgatc caataaattt tctgatccca attgtatcga agaactaata     1080

 

aattacctgg accttacttg ggggggtgat gaaccagcgc                           1120

 

 

<210>  11

<211>  797

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  11

agatcaaggt gaattttact aattactgcg atacaattgg gatcagaaaa tctattgcat       60

 

cggcagcaaa tcccatcctc ctgtcagcac tctctggggg cagaggtgac atattcccac      120

 

catacagatg cagtggagct gctacctcag taggcagagt tttcccccta tcagtgtcat      180

 

tgtccatgtc tttgatctca agaaaatcag agataatcaa tatgctaacc gctatctcaa      240

 

acggagtgta tggtaaaact tatttactag tgcctgatta tattgaagag gagttcgaca      300

 

cacaaaagat tcgagtcttt gagatagggt tcatcaaacg gtggctgaat gacatgccat      360

 

tactccagac aaccaactat atggtcctcc cagagaattc caaagctaag gtatgtacta      420

 

tagcagtggg cgagttgaca ctggcttcct tgtgtgtagg tgagagcacc gtgttgttat      480

 

atcatgacag caatggttcg caagataata tcctagtagt gacgctggga atatttgggg      540

 

caacatctat ggatcaagtt gaagaggtga tacctgttgc tcacccatca gtagaaaaaa      600

 

tacatataac aaatcaccgt gggttcataa aagattcaat agcaacctgg atggtgcctg      660

 

cattggtctc tgagaaacag gaagagcaaa aaaattgtct ggagtcggct tgtcaaagaa      720

 

aatcctaccc tatgtgcaac caaacgtcat gggaaccctt tcggaggagg acagttgcca      780

 

tcttatgggc ggttgac                                                     797

 

 

<210>  12

<211>  745

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  12

ccccaattgg cattgaacca tgtatccggc tcttgggttg catgagtttt ccggggagtt       60

 

aacaaccatt gaatccctta tgatgctata tcaacagatg ggtgaaacag caccgtacat      120

 

ggttattctg gaaaattctg tccagaacaa atttagtgca ggctcctacc cattgctctg      180

 

gagttatgct atgggagttg gtgttgaact tgaaaactcc atgggagggt taaatttcgg      240

 

tagatcctac tttgacccag cttatttcag gctcgggcaa gaaatggtta gaagatctgc      300

 

cggtaaggta agctctgcac ttgccgccga gctcggcatc accaaggaag aggctcagct      360

 

agtgtcagaa atagcatcca agacaacaga ggacctccca tttggcattg aaactatgta      420

 

tccggctctt gggttgcatg agttttccgg ggagttaaca acccttgaat cttaatgacc      480

 

tttttccgca gggaacaaac ccacaatcgc tgaattctgt gaaatatggc tcaccacatt      540

 

gtggcagctc gacaccgact ttaaccttac ctatggaatt tggcgttgaa actgtaaatc      600

 

cctcttcggg ttaccacctc ttttgatcac tttaaccgtt atttacgccg gcagccacgt      660

 

tagaacatat ccgccttcgc aagttttcct gcctcctcct tccacccaat tagagggccc      720

 

ccctcctttg ttatgaaccc cctta                                            745

 

 

<210>  13

<211>  1167

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  13

cctgggcgcc ttaccccccc ctagtaagct caggtgaatt ttactaacta ctgcgatacc       60

 

cttgggatca gaaaatctat tgcatcggca gcaaatccca tcctcctgtc agcactctct      120

 

gggggcagag gtgacatatt cccaccatac cgatgcagtg gagctgctac ctcagtaggc      180

 

agagttttcc ccctgtcagt gtcattgtcc atgtctttga tctcaagaaa atcagagata      240

 

atcaatatgc taaccgctat ctcaaacgga gtgtatggta aaacttattt actagtgcct      300

 

gattatattg aagaggagtt cgacacacaa aagattcgag tctttgagat agggttcatc      360

 

aaacggtggc tgaatgacat gccattactc cagacaacca actatatggt cctcccagag      420

 

aattccaaag ctaaggtatg tactatagca gtgggcgagt tgacactggc ttccttgtgt      480

 

gtaggtgaga gcaccgtgtc gttatatcat gacagcaatg gttcgcaaga tagtatccta      540

 

gcagtgacgc tgggaatatt tggggcaaca tctatggatc aagttgaaga ggcgatacct      600

 

gttgctcacc catcagtaga aaaaatacat ataacaaatc accgtgggtt cataaaagat      660

 

tcaatagcaa cctggatggt gcctgcattg gtctctgaga aacaggaaga gcaaaacaat      720

 

tgtctggagt cggcttgtca aagaaaatcc taccctatgt gcaaccaaac gtcatgggaa      780

 

cccttcggag gaggacagtt gccatcttat gggcggttga cattacctta gatccaagca      840

 

ctgaccttca actcaacata tcgcttacat accgtccggc tatactgaat gggagacggt      900

 

atggatttta tgacaagccc ccctgtcgga ctcccggatg gcttaccacc ccctcccaaa      960

 

accggaacag ctccttcgat tgataaacca aaccagtacg aggagactca gtttcattgt     1020

 

tattccccta cgtgttgaca tttccgcccc aggccatcca tgtcggattg ctctttaccc     1080

 

aataacccac cccacatcat ggatacagct ctccttactg actccacact accgctgttg     1140

 

cctaccctcc cgctctccct tccccta                                         1167

 

 

<210>  14

<211>  245

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (161)..(161)

<223>  n是a、c、g或t

 

<400>  14

gtgaatttta ctaattactg cgatactatg gggatcagaa aatctattgc atcggcagca       60

 

aatcccatcc ttttatcagc actctccgga ggtagaggtg acatattccc accatacaga      120

 

tgcaatggag ctactatttc agtaggcaag attttccccc natcagtatc attatctatg      180

 

tctttgatct caagaacatc agagataatc aatatgctaa ccgctatctc agacggagtg      240

 

tatgg                                                                  245

 

 

<210>  15

<211>  835

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (764)..(764)

<223>  n是a、c、g或t

 

<400>  15

caaggtgaat tttactaatt actgcgatac aattgggatc agaaaatcta ttgcatcggc       60

 

agcaaatccc atcctcctgt cagcactctc tgggggcaga ggtgacatat tcccaccata      120

 

cagatgcagt ggagctgcta cctcagtagg cagagttttc cccctatcag tgacattgtc      180

 

catgtctttg atctcaagaa aatcagagat aatcaatatg ctaaccgcta tctcaaacgg      240

 

agtgtatggt aagacttatt tactagtgcc tgattatatt gaagaggagt tcgacacaca      300

 

aaagattcga gtctttgaga tagggttcat caaacggtgg ctgaatgaca tgccattact      360

 

ccagacaacc aactatatgg tcctcccaga gaattccaaa gctaaggtat gtactatagc      420

 

agtgggcgag ttgacactgg cttccttgtg tgtaggtgag agcaccgtgt tgttatatca      480

 

tgacagcaat ggttcgcaag ataatatcct agtagtgacg ctgggaatat ttggggcaac      540

 

atctatggat caagttgaag aggtgatacc tgttgctcac ccatcagtag aaaaaataca      600

 

tataacaaat caccgtgggt tcataaaaga ttcaatagca acctggatgg tgcctgcatt      660

 

ggtctctgag aaacaggaag agcaaaaaaa ttgtctggag tcggcttgtc aaagaaaatc      720

 

ctaccctatg tgcaaccaaa cgtcatggga acccttcgga gganggacag ttgccatctt      780

 

atgggcggtt gacattacct ctagatccaa gcactgacct tcaacttaac atatc           835

 

 

<210>  16

<211>  1119

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  16

tcctgtttgc ctttcccccc cctagtaaga tcaggtgaat tttactaaca actgcgatac       60

 

aattgggatc agaaaatcta ttgcatcggc agcaaatccc atcctcctgt cagcactctc      120

 

tgggggcaga ggtgacatat tcccaccata cagatgcagt ggagctgcta cctcagtagg      180

 

cagagttttc cccctatcag tgtcattgtc catgtctttg atctcaagaa aatcagagat      240

 

aatcaatatg ctaaccgcta tctcaaacgg agtgtatggt aaaacttatt tactagtgcc      300

 

tgattatatt gaagaggagt tcgacacaca aaagattcga gtctttgaga tagggttcat      360

 

caaacggtgg ctgaatgaca tgccattact ccagacaacc aactatatgg tcctcccaga      420

 

gaattccaaa gctaaggtat gtactatagc agtgggcgag ttgacactgg cttccttgtg      480

 

tgtaggtgag agcaccgtgt tgttatatca tgacagcaat ggttcgcaag atagtatcct      540

 

agcagtgacg ctgggaatat ttggggcaac aactatggat caagttgaag aggtgatacc      600

 

tgttgctcac ccatcagtag aaaaaataca tataacaaat caccgtgggt tcataaaaga      660

 

ttcaatagca acctggatgg tgcctgcatt ggtctctgag aaacaggaag agcaaaaaaa      720

 

ttgtctggag tcggcttgtc aaagaaaatc ctaccctatg tgcaaccaaa cgttatggga      780

 

acccttcgga ggaggacagt tgccatctta tgggcggttg acattacctc tagatccaag      840

 

cactgacctt caacttaaca tatcgtttac atacggtccg gttatcctga atggagacgg      900

 

tatggattat tatgaaagcc cactgtcgga ctcccgatgg cttaccattc ctccaaaacg      960

 

gaacagtcct tggattgata aacaaacaag tagaggagac cagttcattg aatccccatg     1020

 

tgttgacttt tcgcccaggg aatcaagtgg aattgtattt actatcaact tccagattat     1080

 

ggataagatg tccttctgat tccaatacgg tgtgcctta                            1119

 

 

<210>  17

<211>  1126

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  17

tcgtggtgct taaccccccc tagtaagatc aggtgaattt tactaattac tgcgatacta       60

 

ttgggatcag aaaatctatt gcatcggcag caaatcccat ccttttatca gcactctccg      120

 

gaggtagagg tgacatattc ccaccataca gatgcaatgg agctactatt tcagtaggca      180

 

agattttccc cctatcagta tcattatcta tgtctttgat ctcaagaaca tcagagataa      240

 

tcaatatgct aaccgctatc tcagacggag tgtatggtaa aacttattta ctaatgcctg      300

 

attatattga aggggagttc gacacgcaaa agattcgagt ctttgagata gggttcatca      360

 

aacggtggct gaatgacatg ccattactcc agacaaccaa ctatatggtc ctcccagaga      420

 

attccaaagc caaggtatgt actatagcag tgggcgagtt gacactggct tctttgtgtg      480

 

tagatgagag caccgtattg ttatatcatg acagcaatgg ttcacaagat ggtgttctag      540

 

tagtgacgct gggaatattc ggggcaacat ctatggatca agttgaagag gtgatacctg      600

 

tcgctgaccc attagcagaa aaaatacata taacaaatca ccgtgggatc ataaaagact      660

 

caatagcaac ctggatggtg cctgcattag tttctgagaa acaagaggaa caaacaaatt      720

 

gtctggagtc agcttgtcaa agaaaatcct accctatgtg caatcaaacg tcatgggaac      780

 

cctttggagg aggacagttg ccatcttatg ggcggctgac attacctcta catccaagca      840

 

ttgacctcca cttaacatat catttacata cggtccgact atactgaatg gagacggatg      900

 

gctattatga gagccccctg cggactccgg atggcttacc tttccctcca gcacggcaca      960

 

gcctggattg ataaacaaag agtagaggac gaccagttat tgtcattccc ctgtgttgac     1020

 

atttcgcccc cggcatccac ccgaaattgc tattacccta tcccacattc cccttcgcgc     1080

 

tcaagatccc cctcctgctc cccaccacgg cgcgctccct atctcc                    1126

 

 

<210>  18

<211>  623

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  18

cctagtagat caaggtgaat tttactaatt actgcgatac aattgggatc agaaaatcta       60

 

ttgcatcggc agcaaatcca atcctcctgt cagcactctc tgggggcaga ggtgacatat      120

 

tcccaccata cagatgcagt ggagctgcta cctcagtagg cagagttttc cccctatcag      180

 

tgtcattgtc catgtctttg atctcaagaa aatcagagat aatcaatatg ctaaccgcta      240

 

tctcaaacgg agtgtatggt aaaacttatt tactagtgcc tgattatatt gaagaggagt      300

 

tcgacacaca aaagattcga gtctttgaga tagggttcat caaacggtgg ctgaatgaca      360

 

tgccattact ccagacaacc aactatatgg tcctcccaga gaattccaaa gctaaggtat      420

 

gtactatagc agtgggcgag ttgacactgg cttccttgtg tgtaggtgag agcaccgtgt      480

 

tgttatatca tgacagcaat ggttcgcaag atagtatcct agcagtgacg ctgggaatat      540

 

ttggggcaac atctatggat caagttgaag aggtgatacc tgttgctcac ccatcagtag      600

 

aaaaaataca tataacaaat cac                                              623

 

 

<210>  19

<211>  866

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  19

gtttgatagg taaataacag tttccacttg attccctggg tgcaaatgac aacacatgag       60

 

ggaccacagt gaactggtct cctctacttg ctttgtttat caatccaaga attgttccat      120

 

tcttaggagg aatggtaagc catccggatt ccaaaagtgg gctttcataa taatccatac      180

 

catctccatt cagtataacc ggaccgtatg taaatgatat gttaagttta cggtcaatgc      240

 

ttgcatctag atgtaacgtc aaccgcccat aagatggcaa ctgtcctcct ccaaagggtt      300

 

cccatgatgt ttgattgcac atggggtagg attttctctg acaagccgac tccagacaat      360

 

tttcttgttc ctctaggttc tcagagacca atgcaggcac catccaggtt gctactgaat      420

 

cttttatgaa accacggtga tttgttatat gtattttttc gactgatggg tgagcgacag      480

 

gtatcacctc ttcgacttga tccataggtg ttgccccaaa gattcccagc gtcactacta      540

 

gaataccatc ttgtgaacca ttgctgtcat gatataataa tacagtgctc tcatctacac      600

 

acaaggaagc cagtgtcaac tcgcccactg ctatagtaca taccttggtt ttagaattct      660

 

ccgggaggat catatagttg gttgtctgga ataatggcat gtcattcagc caccttttga      720

 

tgaaccctat ctcaaagact cgaatctttt gcgtgtcgaa ctccccttca atataatcag      780

 

gcactagcaa ataagtttta ccatacactc cgtctgagat agaggtcagc atattgatta      840

 

tctctgatgt tcttgagatc aaagac                                           866

 

 

<210>  20

<211>  1134

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  20

aatgcttcct ttacccaccc tagtaagatc aagtaaattt tacggtaaat aaatagcgat       60

 

acaattggga tcagaaaatc tattgcatcg gcagcaaatc ctatcctttt atcagcactc      120

 

tccggaggta gaggtgacat attcccacca tacaggtgca gtggagctac tacttcagta      180

 

ggcagagtct tccccctatc agtatcattg tccatgtctt tggtctcaag aacatctgaa      240

 

ataatcaata tgctaaccgc tatctcagac ggtgtgtatg gtaaaactta tttgctagtt      300

 

cctgattatc ttgaagggga gttcgacacg caaaagattc gagtctttga gatagggttc      360

 

atcaaacggt ggctgaacaa catgccatta ctccagacaa ccaactatat ggtcctcccg      420

 

gaggattcca aagccaaggt atgtactata gcggtgggcg agttgacact ggcttccttg      480

 

tgtgtagatg agagcaccgt attgttatat catgacagca gtggttcaca agatggtatt      540

 

ctagtggtga cgctgggaat atttggggca acacctatgg atcaagttga agaggtgata      600

 

cctgttgctc acccatcagt agaaaaaata catatagcaa accaccgtgg gttcatcaaa      660

 

gattcaatag caacctggat ggtgcctgca ttggtctctg agaaacaaga ggaacaaaaa      720

 

aattgtctgg agtcggcttg tcaaagaaaa tcctacccta tgtgcaacca aacgtcatgg      780

 

gaaccctttg gaggaggaca gttgccatct tatgggcggt tgacattacc tctagatcaa      840

 

agcattgacc tccagcttaa catctcattt acatatggtc cggttatact gaatggagac      900

 

ggtatggatt attatgaaag tccgcttttg aactccggat ggcttaccat tcctcccaag      960

 

aacggaacag tccttggatt gataaacaaa gcaagtagag gagaccagtt cactgtatcc     1020

 

ccatgtgtga catttgcgcc cagggaatca agtggaattg tatttaccta ttcaaacatc     1080

 

ccagatatgg ataaagatgt ccttactgaa tccaaattag tggtgttgcc taac           1134

 

 

<210>  21

<211>  1124

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  21

accggggtgc ttaccccccc tagtaagatc aagtgaattt tacgaaaaac tgcgatccaa       60

 

ttgggatcag gaaatctatt gcaacggcag caaatcctat ccttttatca gcaccctccg      120

 

gaggtagagg tgacatattc ccatcataca gatgcagtgg agctactact tcagtaggca      180

 

gagtcttccc cctatcagta tcattgtcca tgtctttgat ctcaagaaca tctgaaataa      240

 

tcaatatgct aaccgctatc tcagacggag tgtatggtaa aacttatctg ctagttcctg      300

 

attatcttga aggggagttc gacacgcaaa agattcgagt ctttgagata gggttcatca      360

 

aacggtggct gaacaacatg ccattactcc agacaaccaa ctatatggtc ctcccagagg      420

 

attccaaagc caaggtatgt actatagcag tgggcgagtt gacactggct tccttgtgtg      480

 

tagatgagag caccatattg ttatatcatg acagcaatgg ttcacaagat ggtattctag      540

 

tggtgacgct gggaatattt ggggcaacac ctatggatca agttgaagag gtgatacctg      600

 

ttgctcaccc atcagtagaa aaaatacata tagcaaacca tcgtgggttt atcaaagatt      660

 

caatagcaac ctggatggtg cctgcattgg tctctgagaa acaagaggaa caaaaaaatt      720

 

gtctggagtc ggcttgtcaa agaaaatcct accctatgtg caaccaaacg tcatgggaac      780

 

cctttggagg aggacagttg ccatcttatg ggcggttgac attacctcta gatccaagca      840

 

ttgaccttca gcttacatct catttacata cggcccgtta tactgaatgg agacggtatg      900

 

gatactatga aagcccactt ttagactccg gatggcttac cattcctcca agaacggaac      960

 

agtccttgga ttgataaaca aagcaagtag aggagaccag ttcactgtat ccccatgtgt     1020

 

tgacatttgc gccaggaatc agtggaaatt gttatttacc tattcaaact tcccaattat     1080

 

ggataagagt cctactggat ccaaattatg gtgtttccct aacc                      1124

 

 

<210>  22

<211>  1145

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  22

cattggtgca ttaacccacc tagtaagaca agtgaatttt actaatatac tgcgatacaa       60

 

ttgggatcag gaaatctatt gcatcggcag caaatcctat ccttttatca gcaccctccg      120

 

gaggtagagg tgacatattc ccatcataca gatgcagtgg agctactact tcagtaggca      180

 

gagtcttccc cctatcagta tcattgtcca tgtctttgat ctcaagaaca tctgaaataa      240

 

tcaatatgct aaccgctatc tcagacggag tgtatggtaa aacttatctg ctagttcctg      300

 

attatcttga aggggagttc gacacgcaaa agattcgagt ctttgagata gggttcatca      360

 

aacggtggct gaacaacatg ccattactcc agacaaccaa ctatatggtc ctcccagagg      420

 

attccaaagc caaggtatgt actatagcag tgggcgagtt gacactggct tccttgtgtg      480

 

tagatgagag caccatattg ttatatcatg acagcaatgg ttcacaagat ggtattctag      540

 

tggtgacgct gggaatattt ggggcaacac ctatggatca agttgaagag gtgatacctg      600

 

ttgctcaccc atcagtagaa aaaatacata tagcaaacca tcgtgggttt atcaaagatt      660

 

caatagcaac ctggatggtg cctgcattgg tctctgagaa acaagaggaa caaaaaaatt      720

 

gtctggagtc ggcttgtcaa agaaaatcct accctatgtg caaccaaacg tcatgggaac      780

 

cctttggagg aggacagttg ccatcttatg ggcggttgac attacctcta gatccaagca      840

 

ttgaccttca gcttaacatc tcatttacat acggtccggt tatactgaat ggagacggta      900

 

tggattacta tgaaagccca cttttagact ccggatggct taccattcct cccaagaacg      960

 

gaacagtcct tggattgata aacaaagcaa gtagaggaga ccagttcact gtaatccccc     1020

 

atgtgttgac atttgcgccc agggaatcaa gtggaaattg ttatttacct attccaaaca     1080

 

tcccagatta tggataaagg atgtccttac tgaagttcta aattagtggg ggtttgccct     1140

 

aagac                                                                 1145

 

 

<210>  23

<211>  321

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  23

gcctcccagg ggcaccttcc ccccccagta gctcaggtga atctcactta aaactgcgcc       60

 

ccccttggga tcttacaatc tattgcatcg gcagcaaatc ccctcctttt atcagcactc      120

 

tcccgaggta gaggtgacat attcccacca taccgatgca atggagctac tatttcacta      180

 

ggcaagattt cccccctatc agtatcatta tctatgtctt tgatctcacg aacatcagag      240

 

ataatcaata tgctaaccgc tatctcatac ggagtgtatg gtaaaactta tttactaatg      300

 

cccgactata ttgaagggga g                                                321

 

 

<210>  24

<211>  1135

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  24

ttgatttcga ctccccgatt ttccactgtg cattaaccac ctagtaagat caaggtgaat       60

 

tttactgact ctggaacaaa tgggatcaag aaatttattg catggcagca aatcccatct      120

 

cctgtcagca ctctatgggg gcagaggtga catattccca ccatacaaga tgcagtggag      180

 

ctgctacctc agtaggcaga gttttccccc tatcagtgtc attggccatg tctttgacct      240

 

caagaaaatc agaggataat caatatgcta accgctatct caaaacggag tgtatggtaa      300

 

aacttattta ctagtgcctg attatattga agaggagttc gacacacaaa aagattcgag      360

 

tctttgagat agggttcatc aaacggtggc tgaataacat gccattactc cagacaacta      420

 

actatatggt cctcccagag aattccaaag ctaaggtatg tactatagca gtgggcgagt      480

 

tgacactggc ttccttgtgt gtaggtgaga gcaccgtgtt gttatatcat gacagcaatg      540

 

gttcgcaaga tagtatccta gcagtgacgc tgggaatatt tggggcaaca tctatggatc      600

 

aagttgaaga ggtgatacct gttgctcacc catcagtaga aaaaatacat ataacaaatc      660

 

accgtgggtt cataaaagat tcaatagcaa cctggatggt gcctgcattg gtctctgaga      720

 

aacaggaaga gcaaaaaaat tgtctggagt cggcttgtca aagaaaatcc taccctatgt      780

 

gcaaccaaac gtcatgggaa cccttcggag gaggacagtt gccatcttat gggcggttga      840

 

cattacctct agatccaagc actgaccttc aacttaacat atcgtttacg tacggtccgg      900

 

ttatactgaa tggagacggt atggattatt atgaaagccc actgtcggac tccggatggc      960

 

ttaccattcc tcccaaaaac ggaacagtcc ttggattgat aaacaaagca agtagaggag     1020

 

atcagttcat tgtaatcccc catgtgttga catttgcgcc cagagaatca agtgggaatt     1080

 

gttatttacc tattcaaaca tcccatatta ggaaaaaggg aggcctaccc gggga          1135

 

 

<210>  25

<211>  796

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  25

tatggttcat taccccccgg cgtaagtgaa tttgaatcgt agtaattgct gtgataaaat       60

 

tgggattgga aatgtattgc attgttatga aattctacct tttcagcact tgcctccgtt      120

 

ggttgagggg acttattccc atcatacata tgcagtggag ctactacctc atccggcaga      180

 

gttatatttg atcatcatta ttgcacatgt ttgtgaccta aaaaacatct ggcatatgca      240

 

atctgctaac cgcgatctca tgtggagtgt atggcaaaac ttatctgcta cttcctgatt      300

 

ttcttgaagg ggagtccgac actctgccga tgtccgacaa gctgatcggg ttcatcaaac      360

 

tctggctgaa caacatgttg cgcgtctgac aacctccgat ttggcctgcc cagaggattt      420

 

tacagccaag gtatgtacca tatcccaggg gaacttcaca ctgccttcct tgtgtgttag      480

 

ccagagcccc atattgtccc ataatgatat gaatgtccta caagaggtca ttttccatgt      540

 

gaccccgcgt tcatttgtgg caatggcggt ggttcaattg gaacagggta tatctgaccc      600

 

tatctttcac tagagaaatt acatatgaca aaccatcatg gcttgatcaa agaataactt      660

 

cctttctggc tgacgcttga cttgccctta tatataccat attttcttaa taaatcgcgg      720

 

tcaattgcct gtggagccaa attttaccac tcttccaacc ttatgttacg ggctttcctt      780

 

gccggaggac cgttgc                                                      796

 

 

<210>  26

<211>  1122

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  26

gcgattttgc cctgtgcatt aacccaccta gtaagatcaa ggtaaatttt actaaattct       60

 

gcgaaacatg tggatcagaa aatctatggc atcggcagca atcccatcct cctgcagccc      120

 

tcttggggca gaggtgacat attcccacca tacagatgca gtgaggctgc tacctcagta      180

 

ggccagagtt ttcccctatc agggtcattg tgcatgtctt tgacctcaag aaagtcagag      240

 

ataatcaaat atgctaaccc gctatctcaa acggagtgta tgggaaaaac ttatttacta      300

 

gtgcctggat tatattgaag aggagttcga cacacaaaag attcgagtct ttgagatagg      360

 

gttcatcaaa cggtggctga ataacatgcc attactccag acaactaact atatggtcct      420

 

cccagagaat tccaaagcta aggtatgtac tatagcagtg ggcgagttga cactggcttc      480

 

cttgtgtgta ggtgagagca ccgtgttgtt atatcatgac agcaatggtt cgcaagatag      540

 

tatcctagca gtgacgctgg gaatatttgg ggcaacatct atggatcaag ttgaagaggt      600

 

gatacctgtt gctcacccat cagtagaaaa aatacatata acaaatcacc gtgggttcat      660

 

aaaagattca atagcaacct ggatggtgcc tgcattggtc tctgagaaac aggaagagca      720

 

aaaaaattgt ctggagtcgg cttgtcaaag aaaatcctac cctatgtgca accaaacgtc      780

 

atgggaaccc ttcggaggag gacagttgcc atcttatggg cggttgacat tacctctaga      840

 

tccaagcact gaccttcaac ttaacatatc gtttacatac ggtccggtta tactgaatgg      900

 

agacggtatg gattattatg aaagcccact gtcggactcc ggatggctta ccattcctcc      960

 

caaaaacgga acagtccttg gattgataaa caaagcaagt agaggagatc agttcattgt     1020

 

aatcccccat gtgttaacat ttgcgcccag agaatcaagt gggggattgt tattttccta     1080

 

ttcaaacatg cccatattat gataaaggat ggccttaacc cg                        1122

 

 

<210>  27

<211>  798

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  27

agttcgacgc acaaaagatt cgagtgttga gatagggttg atcggacgag gaggtgaagg       60

 

acatgccatt actccagaca gctaactata tggtccgccc agagaattcc aaagctaagg      120

 

tatgtactat agcagtgggc gaggtggcac tggcttcctt gtgtgtaggg gagagcgccg      180

 

tgttgttata tcatggcagc aatggttcgc aagatagtat cgtagcagtg acgctgggaa      240

 

tatttggggc aacatctatg gatcaagttg aagaggtgat acctgttgct cacccatcag      300

 

tagagaaaat acatatagca aatcaccgtg ggttcataaa agattcaata gcaacctgga      360

 

tggtgcctgc attggtctct gagaaacagg aagagcaaaa aaattgtctg gagtcggctt      420

 

gtcaaagaaa atcctaccgt atgtgcagcc aaacggcatg ggaacccttc ggaggaggac      480

 

agttgccatc ttatgggcgg ttgacattac ctctagatcc aagcgctgcc ttcaacttaa      540

 

catatcgttt acatacggtc cggttatact gaatggagac ggtatggatt attatgaaag      600

 

cccactgtcg ggctccggat ggcttgccat tcctcccaaa aacggaacag tccttggatt      660

 

gataaacaaa gcaagtagag gagatcagtt cattgtaatc ccccatgtgt ggacatttgc      720

 

gcccagagaa tcaagtgggg gattgttttt taaactatgc aaacggcgca tatgaggggg      780

 

gagggggggc gggaggct                                                    798

 

 

<210>  28

<211>  1035

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  28

cagtgagagc aaaaatgtag gaaagggcag gaattccatg ctcaaggagc ggatgtgggg       60

 

agaggttgcg agtcccgcca gcagtgcagg aaggggtact cagtagcggg gtttccccct      120

 

aggaggggga ttgtccagtc tttgatatca gaaaagaagg atatcaatat gctaaccgct      180

 

atcgccaaag gagggtatgg taagagctta ttgggagtgc ctgattagag ggagggaagt      240

 

tctacaggag agagattgga gtggtgagat gggggttcgt caagcggtgg atgaatgaca      300

 

taccattact ccagacaacc aagtataggg gcctcccaga gaatgccaaa gctaaggtat      360

 

gtactatagc agtgggcgag ttacgctggc ttccttgtgt gtaggtgaga gcgccgtgtt      420

 

gttatatcat gacagcaatg gttcgcaaga tagtatccta gctgtgacgc tgggaatatt      480

 

tggggcagca tctatggatc aagttgaaga ggtgatgcct gttgctcacc catcagtaga      540

 

aaaaatacat ataacaaatc gccgtgggtt cataaaagat tcaatagcag catggatggt      600

 

gcctgcattg gtctctgaga agcaggaaga gcaaaaaaat tgtcaggagt cgggttgtca      660

 

aagaaaatcc tacccgatgt gcaaccaaac gtcatgggaa cccttcggag gaggacaggt      720

 

gccatcttat gggcggttgg cattacctct agagccaagc actggccttc aacttgacat      780

 

atcgtttaca tacgggccgg ttatactgaa tggagacggt atggattatt atgaaagccc      840

 

actgtcggac gccggatggc ttaccattcc tcccaaaaac ggaacagtcc gtggattgat      900

 

aaacaaagca agtagaggag gccagttcat tgtaatcccc catgtgttga catttgcgcc      960

 

cagggaatca agtgggaatt gctattttcc tattcagaac accccagatt aggatagaag     1020

 

gaggggcctg ggccg                                                      1035

 

 

<210>  29

<211>  1131

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  29

cttgtgggct taaaccacct agtaatacaa agtgaatttt actaattact gcgatacaat       60

 

tgggatcaaa aaatctattg catcggcagc aaatcctatc cttttatcag cactctccgg      120

 

aggcagaggt gacatattcc caccatacag atgcagtgga gctactactt cagtaggcag      180

 

agtcttcccc ttatcagtat cattgtccat gtctttgatc tcaagaacat ctgaaataat      240

 

caatatgcta accgctatct cagacggagt gtatggtaaa acttatttgc tagttcctga      300

 

ttatcttgaa ggggagttcg acacgccgaa gattcgagtc tttgagatag ggttcatcaa      360

 

acggtggctg aacaacatgc cattaatcca gacaaccaac tatatggtcc tcccggagga      420

 

ttccaaagct aaggtatgta ctatagcagt gggcgagttg acactggctt ccttatgtgt      480

 

agatgagagc accgtattgt tatatcatga cagcaatggt tcacaagatg gtattctagt      540

 

ggtgacgctg ggaatatttg gggcaacacc tatggatcga gttgaagagg tgatacctgt      600

 

tgctcacccg tcagtagaaa aaatacatat ggcaaaccac cgtgggttca tcaaagattc      660

 

aatagcaacc tggatggtgc ctgcattggt ctctgagaaa caagaggaac aaaaaaattg      720

 

tctggagtcg gcttgtcaaa gaaaatccct accctatgtg caaccaaacg tcatgggaaa      780

 

ccctttggag gaggacagtt gccatcttat gggcggttga cattacctct agatccaagc      840

 

attgaccttc accttaacat ctcatttaca tacggcccag ttatactgaa tggggacggt      900

 

atggattatt atgaaagccc acttttggac tccggatggc ttaccattcc tcccaagaac      960

 

ggaacagtcc ttggattgat aaacagagca gtagaggaga acagttcact gtaatcccca     1020

 

tgtgttgact tgcgcaaggg gatcaagtgg aaattgtatt tacctattca aacatcttaa     1080

 

attatggata aagatgccct caccgagccc aaattagtgg tgttgcctca t              1131

 

 

<210>  30

<211>  759

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  30

ctccctttcg gcttgaacat gtatccggct cttgggttgc atgagttttc cggggagtta       60

 

acaaccattg aatcccttat gatgctatat caacagatgg gtgaaacagc accgtacatg      120

 

gttattctgg aaaattctgt ccagaacaaa tttagtgcag gatcctaccc attgctctgg      180

 

agttatgcta tgggagttgg tgttgaactt gaaaactcta tgggagggtt aaatttcggt      240

 

agatcctact ttgacccagc ttatttcagg ctcgggcaag aaatggttag aagatcggcc      300

 

ggtaaggtaa gctctgcact tgccgccgag cttggcatca ccaaggaaga ggctcagcta      360

 

gtgtcagaaa tagcatccaa gacaacagag gacccgcatt tggcattgaa actatgtatc      420

 

cggctcttgg gttgcatgag ttttccgggg agttaacaac cattgaatcc cttgtgatgc      480

 

tttaccacca aatgggtgaa ggacccccca tggttattct tggaaaattt gtccgacaaa      540

 

attagtgcag gatctaccat tgctctggag ttatgctatg ggagttggtg gtgaacttga      600

 

aaaccccatg ggggggttaa atttcggcag attcttcttt gacagttaat tttaggctcg      660

 

gccagaaaat ggttagaaaa ctcggccggt taggggaaag ctttgtcttt gcccgcttgg      720

 

gttccccccc cgaaaggttt cccccctttt ctatatatt                             759

 

 

<210>  31

<211>  1132

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  31

tgtgaatgtg aacttccgcg atctccactg gtgcattaac ccactagtaa gatcaaggtg       60

 

aatttactaa ctacgcgata caattgggat cagaaaatct attgcatcgg cagcaaatcc      120

 

catcctcctg tcagcactct ctgggggcag aggtgacata ttcccaccat accgatgcag      180

 

tggagctgct acctcagtag gcagagtttt ccccctgtca gtgtcattgt ccatgtcttt      240

 

gatctcaaga aaatcagaga taatcaatat gctaaccgct atctcaaacg gagtgtatgg      300

 

taaaacttat ttactagtgc ctgattatat tgaagaggag ttcgacacac aaaagattcg      360

 

agtctttgag atagggttca tcaaacggtg gctgaatgac atgccattac tccagacaac      420

 

caactatatg gtcctcccag agaattccaa agctaaggta tgtactatag cagtgggcga      480

 

gttgacactg gcttccttgt gtgtaggtga gagcaccgtg tcattatatc atgacagcaa      540

 

tggttcgcaa gatagtatcc tagcagtgac gctgggaata tttggggcaa catctatgga      600

 

tcaagttgaa gaggtgatac ctgttgctca cccatcagta gaaaaaatac atataacaaa      660

 

tcaccgtggg ttcataaaag attcaatagc aacctggatg gtgcctgcat tggtctctga      720

 

gaaacaggaa gagcaaaaaa attgtctgga gtcggcttgt caaagaaaat cctaccctat      780

 

gtgcaaccaa acgtcatggg aacccttcgg aggaggacag ttgccatctt atgggcggtt      840

 

gacattacct ctagatccaa gcactgacct tcaacttaac atatcgttta catacggtcc      900

 

ggttatactg aatggagacg gtatggatta ttatgaaagc ccactgtcgg actccggatg      960

 

gcttaccatt cctcccaaaa acggaacagt ccttggattg ataaacaaag caagtagagg     1020

 

agaccagttc attgtaatcc cccatgtgtt gacatttgcg cccagggaat caagtgggaa     1080

 

ttgttattta cctattcaaa catcccagat tatgaaaaga tgccttaacc cg             1132

 

 

<210>  32

<211>  1127

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  32

tctgctgctt aaccacctag taagatcagg tgaattttac taactactgc gatacaattg       60

 

ggatcagaaa atctattgca tcggcagcaa atcccatcct cctgtcagca ctctctgggg      120

 

gcagaggtga catattccca ccataccgat gcagtggagc tgctacctca gtaggcagag      180

 

ttttccccct gtcagtgtca ttgtccatgt ctttgatctc aagaaaatca gagataatca      240

 

atatgctaac cgctatctca aacggagtgt atggtaaaac ttatttacta gtgcctgatt      300

 

atattgaaga ggagttcgac acacaaaaga ttcgagtctt tgagataggg ttcatcaaac      360

 

ggtggctgaa tgacatgcca ttactccaga caaccaacta tatggtcctc ccagagaatt      420

 

ccaaagctaa ggtatgtact atagcagtgg gcgagttgac actggcttcc ttgtgtgtag      480

 

gtgagagcac cgtgtcatta tatcatgaca gcaatggttc gcaagatagt atcctagcag      540

 

tgacgctggg aatatttggg gcaacatcta tggatcaagt tgaagaggtg aacctgttgc      600

 

tcacccatca gtagaaaaaa tacatataac aaatcaccgt gggttcataa aagattcaat      660

 

agcaactgga tggtgcctgc attggtctct gagaaacagg aagagcaaaa aaattgtctg      720

 

gagtcggctt gtcaaagaaa atcctaccct atgtgcaacc aaacgtcatg ggaacccttc      780

 

ggaggaggac agttgccatc ttatgggcgg ttgacattac ctctagatcc aagcactgac      840

 

cttcaactta acatatcgtt tacatacggt ccggttatac tgaatggaga cggtatggat      900

 

tattatgaaa gcccactgtc ggactccgga tggcttacca ttcctcccaa aaacggaaca      960

 

gtccttggat tgataaacaa agcagtagag gagaccagtt cattgtaatc ccccatgtgt     1020

 

tgacatttgc gcccagggaa tcaagtggga attgttattt acctattcaa acatccagat     1080

 

tatggataaa gatgtcctta ctgagtccaa attagtgtgt gtgccta                   1127

 

 

<210>  33

<211>  1128

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  33

attggttgcc cttaacccac ctagtaagat caggtgaatt ttactaacta ctgcgataca       60

 

attgggatca gaaaatctat tgcatcggca gcaaatccca tcctcctgtc agcactctct      120

 

gggggcagag gtgacatatt cccaccatac cgatgcagtg gagctgctac ctcagtaggc      180

 

agagttttcc ccctgtcagt gtcattgtcc atgtctttga tctcaagaaa atcagagata      240

 

atcaatatgc taaccgctat ctcaaacgga gtgtatggta aaacttattt actagtgcct      300

 

gattatattg aagaggagtt cgacacacaa aagattcgag tctttgagat agggttcatc      360

 

aaacggtggc tgaatgacat gccattactc cagacaacca actatatggt cctcccagag      420

 

aattccaaag ctaaggtatg tactatagca gtgggcgagt tgacactggc ttccttgtgt      480

 

gtaggtgaga gcaccgtgtc attatatcat gacagcaatg gttcgcaaga tagtatccta      540

 

gcagtgacgc tgggaatatt tggggcaaca tctatggatc aagttgaaga ggtgatacct      600

 

gttgctcacc catcagtaga aaaaatacat ataacaaatc accgtgggtt cataaaagat      660

 

tcaatagcaa cctggatggt gcctgcattg gtctctgaga aacaggaaga gcaaaaaaat      720

 

tgtctggagt cggcttgtca aagaaaatcc taccctatgt gcaaccaaac gtcatgggaa      780

 

cccttcggag gaggacagtt gccatcttat gggcggttga cattacctct agatccaagc      840

 

actgaccttc aacttaacat atcgtttaca tacggtccgg ttatactgaa tggagacggt      900

 

atggattatt atgaaagccc actgtcggac tccggatggc ttaccattcc tcccaaaaac      960

 

ggaacagtcc ttgaatgata aacaaagcaa gtagaggaga ccagtttatt gtactccctc     1020

 

tgtgtttgac atttgcgccc aggatcaagt ggcattgttt ctacctatcc aaacttccga     1080

 

attatggata aagatgtcct tactgatcca aactagtgcg ttgctcaa                  1128

 

 

<210>  34

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  合成的寡核苷酸引物

 

<400>  34

atttgggatt gcttagga                                                     18

 

 

<210>  35

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  合成的寡核苷酸引物

 

<400>  35

ggcgctcatc ttggacat                                                     18

 

 

<210>  36

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  合成的寡核苷酸引物

 

<400>  36

gttagctagt ttcatcct                                                     18

 

 

<210>  37

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  合成的寡核苷酸引物

 

<400>  37

ggtcctctgt tgtcttgg                                                     18

 

 

<210>  38

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  合成的寡核苷酸引物

 

<400>  38

gaattcgact tccgcgatct cc                                                22

 

 

<210>  39

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  合成的寡核苷酸引物

 

<400>  39

taggcaacac cactaatttr gactc                                             25

 

 

<210>  40

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  合成的寡核苷酸引物

 

<400>  40

tcgaaatcct atgtgagatc act                                               23

 

 

<210>  41

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  合成的寡核苷酸引物

 

<400>  41

atgctggaga tggtttaatt caatcg                                            26

 

 

<210>  42

<211>  1824

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  42

atgctctcct accaagacaa ggtgggtgcc ttctataagg ataatgcaag agctaattca       60

 

tccaagctgt ccctagtgac agaagagcaa gggggcagga gaccacccta tttgctgttt      120

 

gtccttctca tcctactggt tggaatcctg gccttgcttg ctatcactgg agttcgattt      180

 

caccaagtat caactagcaa cgtggaattt agcagattgc taaaagagga tatggagaaa      240

 

tcagaggctg tacatcacca agtcatagat gttttgacgc cgctcttcaa aattattgga      300

 

gatgagattg ggttacggct gccacaaaaa ctaaacgaga tcaaacaatt catccttcaa      360

 

aagacaaact tcttcaatcc taacagggaa ttcgacttcc gtgatctcca ctggtgcatt      420

 

aacccaccta gtaagatcaa ggtgaatttt actaactact gcgatacaat tgggatcaga      480

 

aaatctattg catcggcagc aaatcccatc ctcctgtcag cactctctgg gggcagaggt      540

 

gacatattcc caccataccg atgcagtgga gctgctacct cagtaggcag agttttcccc      600

 

ctgtcagtgt cattgtccat gtctttgatc tcaagaaaat cagagataat caatatgcta      660

 

accgctatct caaacggagt gtatggtaaa acttatttac tagtgcctga ttatattgaa      720

 

gaggagttcg acacacaaaa gattcgagtc tttgagatag ggttcatcaa acggtggctg      780

 

aatgacatgc cattactcca gacaaccaac tatatggtcc tcccagagaa ttccaaagct      840

 

aaagtatgta ctatagcagt gggcgagttg acactggctt ccttgtgtgt aggtgagagc      900

 

accgtgtcat tatatcatga cagcaatggt tcgcaagata gtatcctagc agtgacgctg      960

 

ggaatatttg gggcaacatc tatggatcaa gttgaagagg tgatacctgt tgctcaccca     1020

 

tcagtagaaa aaatacatat aacaaatcac cgtgggttca taaaagattc aatagcaacc     1080

 

tggatggtgc ctgcattggt ctctgagaaa caggaagagc aaaaaaattg tctggagtcg     1140

 

gcttgtcaaa gaaaatccta ccctatgtgc aaccaaacgt catgggaacc cttcggagga     1200

 

ggacagttgc catcttatgg gcggttgaca ttacctctag atccaagcac tgaccttcaa     1260

 

cttaacatat cgtttacata cggtccggtt atactgaatg gagacggtat ggattattat     1320

 

gaaagcccac tgtcggactc cggatggctt accattcctc ccaaaaacgg aacagtcctt     1380

 

ggattgataa acaaagcaag tagaggagac cagttcattg taatccccca tgtgttgaca     1440

 

tttgcgccca gggaatcaag tgggaattgt tatttaccta ttcaaacatc ccagattatg     1500

 

gataaagatg tccttactga gtccaattta gtggtgttgc ctacacagaa ttttagatat     1560

 

gtcatagcaa catatgatat atcccgggac aatcatgcga tcgtttacta tgtctatgac     1620

 

ccaattcgga cgatttctta tacgtaccca tttagactaa ctaccaaagg tagacctgat     1680

 

ttcctaagga ttgaatgttt tgtttgggat gatgatttgt ggtgtcacca gttctaccga     1740

 

ttcgaggctg acatcactaa ctctaccacc agtgttgaga atttagtccg tataagattc     1800

 

tcatgtaacc gttcaagacc ttga                                            1824

 

 

<210>  43

<211>  1824

<212>  DNA

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  43

atgctctcct accgagacaa ggtgggtgcc ttctataagg acaatgctag agctaattca       60

 

tccaagctgt ccttagtgac agaagagcaa gggggcagga gaccacccta tttgctgttt      120

 

gtccttctca tcctactggt tggaatcatg gccttgcttg ctatcactgg agttcgattt      180

 

caccaagtat caactagcaa tatggagttt agcagattgc tgaaagagga tctggagaaa      240

 

tcagaggccg tacatcacca agtcatagat gtcttgacgc cgctcttcaa aattattgga      300

 

gatgagattg ggttacggtt gccacaaaaa ctaaacgaga tcaaacaatt tatccttcaa      360

 

aagacaaact tcttcaatcc gaacagggaa ttcgacttcc gcgatctcca ctggtgcatt      420

 

aacccaccta gtaagatcaa ggtgaatttt actaattact gcgatactat ggggatcaga      480

 

aaatctattg catcggcagc aaatcccatc cttttatcag cactctccgg aggtagaggt      540

 

gacatattcc caccatacag atgcaatgga gctactattt cagtaggcaa gattttcccc      600

 

ctatcagtat cattatctat gtctttgatc tcaagaacat cagagataat caatatgcta      660

 

accgctatct cagacggagt gtatggtaaa acttatttac taatgcctga ttatattgaa      720

 

ggggagttcg acacgcaaaa gattcgagtc tttgagatag ggttcatcaa acggtggctg      780

 

aatgacatgc cattactcca gacaaccaac tatatggtcc tcccagagaa ttccaaagct      840

 

aaggtatgta ctatagcagt gggcgagttg acactggctt ctttgtgtgt aggtgagagc      900

 

accgtattgt tatatcatga cagcaatggt tcacaagatg gtattctagt agtgacgctg      960

 

ggaatattcg gggcaacatc tatggatcaa gttgaagagg tgatacctgt cgctgaccca     1020

 

ttagtagaaa aaatacatat aacaaatcac cgcgggatca taaaagattc aatagcaacc     1080

 

tggatggtgc ctgcattagt ttctgagaaa caagaggaac aaaaaaattg tctggagtca     1140

 

gcttgtcaaa gaaaatccta ccctatgtgc aatcaaacgt catgggaacc ctttggagga     1200

 

ggacagttgc catcttatgg gcggttgaca ttacctctag atccaagcat tgaccttcaa     1260

 

cttaacatat catttacata cggtccgatt atactgaatg gggacggtat ggattattat     1320

 

gagagcccac tgttggactc cggatggctt accattcctc ccaagaacgg aacagtcctt     1380

 

ggattgataa acaaagcaag tagaggagac cagttcactg taatccccca tgtgttgaca     1440

 

tttgcgccca gggaatcaag tggaaattgt tatttaccta ttcaaacatc ccagattatg     1500

 

gataaagatg tccttactga gtccaattta gtggtgttgc ctacacagaa ttttagatat     1560

 

gtcgtagcaa catatgatat atctcgggac gatcatgcga ttgtttatta tgtttatgac     1620

 

ccaatacgga cgatttctta tacgtaccca tttagactaa ctactaaggg tagacctgat     1680

 

ttcttaagga ttgagtgttt tgtgtgggat gacgatttgt ggtgtcacca gttttaccga     1740

 

ttcgaggccg acatcaccaa ctctacaacc agtgtcgaga atttagtccg tatgagattc     1800

 

tcatgtaacc gttccagacc ttga                                            1824

 

 

<210>  44

<211>  607

<212>  PRT

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  44

 

Met Leu Ser Tyr Gln Asp Lys Val Gly Ala Phe Tyr Lys Asp Asn Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Arg Ala Asn Ser Ser Lys Leu Ser Leu Val Thr Glu Glu Gln Gly Gly

            20                  25                  30         

 

 

Arg Arg Pro Pro Tyr Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Val Gly

        35                  40                  45              

 

 

Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Thr Gly Val Arg Phe His Gln Val Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Thr Ser Asn Val Glu Phe Ser Arg Leu Leu Lys Glu Asp Met Glu Lys

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Glu Ala Val His His Gln Val Ile Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe

                85                  90                  95     

 

 

Lys Ile Ile Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Leu Pro Gln Lys Leu Asn

            100                 105                 110        

 

 

Glu Ile Lys Gln Phe Ile Leu Gln Lys Thr Asn Phe Phe Asn Pro Asn

        115                 120                 125            

 

 

Arg Glu Phe Asp Phe Arg Asp Leu His Trp Cys Ile Asn Pro Pro Ser

    130                 135                 140                

 

 

Lys Ile Lys Val Asn Phe Thr Asn Tyr Cys Asp Thr Ile Gly Ile Arg

145                 150                 155                 160

 

 

Lys Ser Ile Ala Ser Ala Ala Asn Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ser

                165                 170                 175    

 

 

Gly Gly Arg Gly Asp Ile Phe Pro Pro Tyr Arg Cys Ser Gly Ala Ala

            180                 185                 190        

 

 

Thr Ser Val Gly Arg Val Phe Pro Leu Ser Val Ser Leu Ser Met Ser

        195                 200                 205            

 

 

Leu Ile Ser Arg Lys Ser Glu Ile Ile Asn Met Leu Thr Ala Ile Ser

    210                 215                 220                

 

 

Asn Gly Val Tyr Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Val Pro Asp Tyr Ile Glu

225                 230                 235                 240

 

 

Glu Glu Phe Asp Thr Gln Lys Ile Arg Val Phe Glu Ile Gly Phe Ile

                245                 250                 255    

 

 

Lys Arg Trp Leu Asn Asp Met Pro Leu Leu Gln Thr Thr Asn Tyr Met

            260                 265                 270        

 

 

Val Leu Pro Glu Asn Ser Lys Ala Lys Val Cys Thr Ile Ala Val Gly

        275                 280                 285            

 

 

Glu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Cys Val Gly Glu Ser Thr Val Ser Leu

    290                 295                 300                

 

 

Tyr His Asp Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ser Ile Leu Ala Val Thr Leu

305                 310                 315                 320

 

 

Gly Ile Phe Gly Ala Thr Ser Met Asp Gln Val Glu Glu Val Ile Pro

                325                 330                 335    

 

 

Val Ala His Pro Ser Val Glu Lys Ile His Ile Thr Asn His Arg Gly

            340                 345                 350        

 

 

Phe Ile Lys Asp Ser Ile Ala Thr Trp Met Val Pro Ala Leu Val Ser

        355                 360                 365            

 

 

Glu Lys Gln Glu Glu Gln Lys Asn Cys Leu Glu Ser Ala Cys Gln Arg

    370                 375                 380                

 

 

Lys Ser Tyr Pro Met Cys Asn Gln Thr Ser Trp Glu Pro Phe Gly Gly

385                 390                 395                 400

 

 

Gly Gln Leu Pro Ser Tyr Gly Arg Leu Thr Leu Pro Leu Asp Pro Ser

                405                 410                 415    

 

 

Thr Asp Leu Gln Leu Asn Ile Ser Phe Thr Tyr Gly Pro Val Ile Leu

            420                 425                 430        

 

 

Asn Gly Asp Gly Met Asp Tyr Tyr Glu Ser Pro Leu Ser Asp Ser Gly

        435                 440                 445            

 

 

Trp Leu Thr Ile Pro Pro Lys Asn Gly Thr Val Leu Gly Leu Ile Asn

    450                 455                 460                

 

 

Lys Ala Ser Arg Gly Asp Gln Phe Ile Val Ile Pro His Val Leu Thr

465                 470                 475                 480

 

 

Phe Ala Pro Arg Glu Ser Ser Gly Asn Cys Tyr Leu Pro Ile Gln Thr

                485                 490                 495    

 

 

Ser Gln Ile Met Asp Lys Asp Val Leu Thr Glu Ser Asn Leu Val Val

            500                 505                 510        

 

 

Leu Pro Thr Gln Asn Phe Arg Tyr Val Ile Ala Thr Tyr Asp Ile Ser

        515                 520                 525            

 

 

Arg Asp Asn His Ala Ile Val Tyr Tyr Val Tyr Asp Pro Ile Arg Thr

    530                 535                 540                 

 

 

Ile Ser Tyr Thr Tyr Pro Phe Arg Leu Thr Thr Lys Gly Arg Pro Asp

545                 550                 555                 560

 

 

Phe Leu Arg Ile Glu Cys Phe Val Trp Asp Asp Asp Leu Trp Cys His

                565                 570                 575    

 

 

Gln Phe Tyr Arg Phe Glu Ala Asp Ile Thr Asn Ser Thr Thr Ser Val

            580                 585                 590        

 

 

Glu Asn Leu Val Arg Ile Arg Phe Ser Cys Asn Arg Ser Arg Pro

        595                 600                 605        

 

 

<210>  45

<211>  607

<212>  PRT

<213>  犬瘟热病毒

 

<400>  45

 

Met Leu Ser Tyr Arg Asp Lys Val Gly Ala Phe Tyr Lys Asp Asn Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Arg Ala Asn Ser Ser Lys Leu Ser Leu Val Thr Glu Glu Gln Gly Gly

            20                  25                  30         

 

 

Arg Arg Pro Pro Tyr Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Val Gly

        35                  40                  45             

 

 

Ile Met Ala Leu Leu Ala Ile Thr Gly Val Arg Phe His Gln Val Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Thr Ser Asn Met Glu Phe Ser Arg Leu Leu Lys Glu Asp Leu Glu Lys

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Glu Ala Val His His Gln Val Ile Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe

                85                  90                  95     

 

 

Lys Ile Ile Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Leu Pro Gln Lys Leu Asn

            100                 105                 110        

 

 

Glu Ile Lys Gln Phe Ile Leu Gln Lys Thr Asn Phe Phe Asn Pro Asn

        115                 120                 125            

 

 

Arg Glu Phe Asp Phe Arg Asp Leu His Trp Cys Ile Asn Pro Pro Ser

    130                 135                 140                

 

 

Lys Ile Lys Val Asn Phe Thr Asn Tyr Cys Asp Thr Met Gly Ile Arg

145                 150                 155                 160

 

 

Lys Ser Ile Ala Ser Ala Ala Asn Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ser

                165                 170                 175    

 

 

Gly Gly Arg Gly Asp Ile Phe Pro Pro Tyr Arg Cys Asn Gly Ala Thr

            180                 185                 190        

 

 

Ile Ser Val Gly Lys Ile Phe Pro Leu Ser Val Ser Leu Ser Met Ser

        195                 200                 205            

 

 

Leu Ile Ser Arg Thr Ser Glu Ile Ile Asn Met Leu Thr Ala Ile Ser

    210                 215                 220                

 

 

Asp Gly Val Tyr Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Met Pro Asp Tyr Ile Glu

225                 230                 235                 240

 

 

Gly Glu Phe Asp Thr Gln Lys Ile Arg Val Phe Glu Ile Gly Phe Ile

                245                 250                 255    

 

 

Lys Arg Trp Leu Asn Asp Met Pro Leu Leu Gln Thr Thr Asn Tyr Met

            260                 265                 270        

 

 

Val Leu Pro Glu Asn Ser Lys Ala Lys Val Cys Thr Ile Ala Val Gly

        275                 280                 285            

 

 

Glu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Cys Val Gly Glu Ser Thr Val Leu Leu

    290                 295                 300                

 

 

Tyr His Asp Ser Asn Gly Ser Gln Asp Gly Ile Leu Val Val Thr Leu

305                 310                 315                 320

 

 

Gly Ile Phe Gly Ala Thr Ser Met Asp Gln Val Glu Glu Val Ile Pro

                325                 330                 335    

 

 

Val Ala Asp Pro Leu Val Glu Lys Ile His Ile Thr Asn His Arg Gly

            340                 345                 350        

 

 

Ile Ile Lys Asp Ser Ile Ala Thr Trp Met Val Pro Ala Leu Val Ser

        355                 360                 365            

 

 

Glu Lys Gln Glu Glu Gln Lys Asn Cys Leu Glu Ser Ala Cys Gln Arg

    370                 375                 380                

 

 

Lys Ser Tyr Pro Met Cys Asn Gln Thr Ser Trp Glu Pro Phe Gly Gly

385                 390                 395                 400

 

 

Gly Gln Leu Pro Ser Tyr Gly Arg Leu Thr Leu Pro Leu Asp Pro Ser

                405                 410                 415    

 

 

Ile Asp Leu Gln Leu Asn Ile Ser Phe Thr Tyr Gly Pro Ile Ile Leu

            420                 425                 430        

 

 

Asn Gly Asp Gly Met Asp Tyr Tyr Glu Ser Pro Leu Leu Asp Ser Gly

        435                 440                 445            

 

 

Trp Leu Thr Ile Pro Pro Lys Asn Gly Thr Val Leu Gly Leu Ile Asn

    450                 455                 460                 

 

 

Lys Ala Ser Arg Gly Asp Gln Phe Thr Val Ile Pro His Val Leu Thr

465                 470                 475                 480

 

 

Phe Ala Pro Arg Glu Ser Ser Gly Asn Cys Tyr Leu Pro Ile Gln Thr

                485                 490                 495    

 

 

Ser Gln Ile Met Asp Lys Asp Val Leu Thr Glu Ser Asn Leu Val Val

            500                 505                 510        

 

 

Leu Pro Thr Gln Asn Phe Arg Tyr Val Val Ala Thr Tyr Asp Ile Ser

        515                 520                 525            

 

 

Arg Asp Asp His Ala Ile Val Tyr Tyr Val Tyr Asp Pro Ile Arg Thr

    530                 535                 540                

 

 

Ile Ser Tyr Thr Tyr Pro Phe Arg Leu Thr Thr Lys Gly Arg Pro Asp

545                 550                 555                 560

 

 

Phe Leu Arg Ile Glu Cys Phe Val Trp Asp Asp Asp Leu Trp Cys His

                565                 570                 575    

 

 

Gln Phe Tyr Arg Phe Glu Ala Asp Ile Thr Asn Ser Thr Thr Ser Val

            580                 585                 590        

 

 

Glu Asn Leu Val Arg Met Arg Phe Ser Cys Asn Arg Ser Arg Pro

        595                 600                 605        

Claims (26)

1.一种分离的欧洲野生(EW)谱系的犬瘟热病毒(CDV)，其包含CDV 9041474B CDV-EW (ATCC保藏号 PTA-10596)的特征。

2.一种CDV减毒株，其从如权利要求1所述的CDV株或其后代株已经在其中繁殖的细胞培养物中分离出。

3.一种免疫原性组合物，其包含：

如权利要求1所述的分离的CDV或其后代。

4.一种在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：

给所述对象施用如权利要求3所述的免疫原性组合物。

5.一种诊断试剂盒，其包含特异性地用于扩增在SEQ ID NO: 42中所述的核苷酸序列的寡核苷酸引物。

6.一种编码SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的分离的核酸分子或其互补体。

7.如权利要求6所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO: 42的核苷酸序列或其互补体。

8.一种表达载体，其包含如权利要求6所述的分离的核酸分子。

9.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求8所述的表达载体。

10.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列。

11.一种欧洲野生(EW)谱系的分离的犬瘟热病毒(CDV)，其编码包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的多肽。

12.一种美洲-2 (AM-2)谱系的分离的犬瘟热病毒(CDV)，其具有CDV 08021509 CDV-AM-2 (ATCC保藏号 PTA-10597)的特征。

13.一种CDV减毒株，其从如权利要求12所述的CDV株或其后代株已经在其中繁殖的细胞培养物中分离出。

14.一种免疫原性组合物，其包含：

如权利要求12所述的分离的CDV或其后代。

15.一种在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：

给所述对象施用如权利要求14所述的免疫原性组合物。

16.一种诊断试剂盒，其包含特异性地用于扩增在SEQ ID NO: 43中所述的核苷酸序列的寡核苷酸引物。

17.一种编码SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的分离的核酸分子或其互补体。

18.如权利要求17所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO: 43的核苷酸序列或其互补体。

19.一种表达载体，其包含如权利要求17所述的分离的核酸分子。

20.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求19所述的表达载体。

21.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列。

22.一种欧洲野生(EW)谱系的分离的犬瘟热病毒(CDV)，其编码包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的多肽。

23.一种免疫原性组合物，其包含：

编码血凝素蛋白的CDV病毒体，所述CDV病毒体包含核酸，所述核酸包含如SEQ ID NO: 1-33所述的一个或多个核苷酸序列。

24.一种在有此需要的对象中引起针对犬瘟热病毒的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：

给所述对象施用组合物，所述组合物包含编码血凝素蛋白的CDV病毒体，所述CDV病毒体包含核酸，所述核酸包含如SEQ ID NO: 1-33所述的一个或多个核苷酸序列。

25.一种选择用于免疫原性组合物中的病原体分离株的方法，其中所述分离株使用一种或多种最常用的密码子来编码选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽，所述方法包括下述步骤：

对于多种病原体分离株中的每种分离株，测定编码所述选择的目标免疫原性的蛋白、多肽或肽的核苷酸序列；

对于在所述测定步骤中得到的核苷酸序列，得到所述目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中一个或多个目标氨基酸残基的密码子选择数据，由此得到密码子选择频率数据；

从所述密码子选择频率数据，鉴别出所述目标免疫原性的蛋白、多肽或肽中每一个所述目标氨基酸残基的最常用的密码子；和

从所述多种病原体分离株中，选择使用一种或多种所述最常用的密码子来编码所述目标蛋白、多肽或肽的分离株。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述病原体是犬瘟热病毒。

Images