JPWO2008032796A1 - 新規イヌ用ワクチン - Google Patents
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Abstract
経口接種可能なイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス2型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対するワクチンの提供。イヌジステンパーウイルス95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌジステンパーウイルス株、イヌアデノウイルス2型F1株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌアデノウイルス2型株及びイヌパルボウイルスF3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌパルボウイルス株。
Description
本発明はイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス2型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対するイヌ感染症用ワクチンに関する。
イヌジステンパーウイルス(Canine Distemper Virus; CDV)は、発熱、中枢神経症状、呼吸器症状、下痢症を呈するイヌの急性の全身性疾病の原因ウイルスである。子イヌで感染する確率が高く、致死率も高い。感染をして一旦は回復しても、中枢神経症状のような後遺症がでたり、ウイルスが体内に潜伏し、数ヶ月〜数年後に再発することがある。代表的な症状は、くしゃみ、鼻水、咳などの呼吸器症状であり、その他に、消化器症状、神経症状などが認められる。消化器症状は、嘔吐、水様性の下痢、血便などであり、神経症状は、興奮、てんかん様発作、チック、後躯マヒ、運動失調などである。
イヌアデノウイルス2型(Canine adeno virus type2; CAV2)は、イヌ伝染性咽頭気管炎の原因として知られている。イヌジステンパーを除く、咳、くしゃみ等の呼吸器症状を示す伝染性の急性・慢性の疾病を総称してケンネルコフと呼ぶが、イヌアデノウイルス2型は、ケンネルコフの原因ウイルスの1つである。また、CAV2からなるワクチンは、イヌ伝染性肝炎を引き起こすイヌアデノウイルス1型(CAV1)と共通の抗原性を有することが知られている。
イヌパルボウイルス(Canine parvovirus; CPV)は、強烈な下痢を主徴とする消化器症状を引き起こし、さらに仔イヌでは心筋炎を生じ、死に至らしめる。パルボウイルスは、消毒液、野外環境要因等に対して強い抵抗性を持ち、感染イヌの排泄した便に大量に含まれ、体外に排泄されたあともすぐには死滅せずに自然環境下で数年間生存する。
このように上記3種類のウイルス感染症は重症度が高く、特に仔イヌが感染した場合、その死亡率の高さが問題になっていた。
これらのウイルス感染症に対しては、すでにワクチンが開発されている(特許文献1及び2を参照)。これらの感染症に対しては、それぞれのウイルスに対する単味ワクチンの他、2種混合ワクチン及び3種混合ワクチンなどが用いられている。
使用されているワクチンは注射投与用のものであり、アナフィラキシーや過敏症等の副作用が生じ得ることが報告されている(非特許文献1参照)。また、注射投与のためイヌに痛みやストレスを与えるという問題もあった。さらに、混合ワクチンとして用いる場合、ウイルス同士の干渉により、ウイルスの増殖が抑制され該ウイルスに対する抗体価が上昇しないという問題もあった。特にジステンパーウイルスワクチンとパルボウイルスの混合ワクチンで干渉が生じやすかった(非特許文献2参照)。
特許3040157号公報
特表2004-501979号公報
Gaskell. R.M. et al., Vet,Rec.150, 126-34 (2002)
GEMMA T., et al., J.Vet.Med,Sci.57(3):535-537,1995
本発明は、経口接種可能なイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス2型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対するワクチンの提供を目的とする。
従来、用いられていたイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス2型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対するワクチンの多くは注射投与用であった。注射で投与した場合、アレルギー症状等の副作用が起こりやすいという問題があった。
また、生まれたばかりの仔イヌは、母イヌから移行抗体を付与されており、該移行抗体が仔イヌ個体に残存している時期にワクチンを接種しても、母イヌから受け継がれた移行抗体によってワクチンは中和されてしまい、免疫を獲得することができないという問題があった。初乳摂取により、生後2日以内に受動的に獲得されたこの移行抗体は、生後まもなく徐々に減少し始め、個体差があるが、一般に生まれてから12〜14週間目位でほぼ無くなる。仔イヌのワクチン接種は母イヌからの移行抗体の切れた直後の時期に行なうのが理想的と言われている。しかしながら、現実的には母イヌからの移行抗体が減少する時期に、イヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス2型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に罹患する場合が多く、これらの感染症から確実に仔イヌを防御することができないという問題があった。
本発明者は、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス2型及びイヌパルボウイルスの強毒株である野外分離株を弱毒化して新規な株を確立した。従来のワクチンが注射投与用であり、従来のワクチンを経口投与しても、イヌに免疫を成立させることはできなかった。一方、本発明者らが新たに確立した株は経口投与または経鼻投与等の経粘膜投与又は経消化器投与によりイヌに投与してもイヌに免疫を成立させることができ、注射投与による副作用の問題を回避することができることを見出した。また、本発明者等が確立した株は、混合ワクチンとして投与した場合でもウイルス同士が干渉を起こさず混合したすべての株に対して抗体価が上昇した。さらに、これらのワクチンを仔イヌに経口投与した場合、母イヌからの移行抗体により中和されることなく、仔イヌに免疫を成立させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1] 配列番号1で表される塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるVP2遺伝子を有するイヌパルボウイルスF3株。
[2] 以下の(1)〜(7)のいずれかのウイルスである[1]のイヌパルボウイルスF3株:
(1)配列番号26に表される塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(2)配列番号26に表される塩基配列の連続する500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750又は4000塩基からなる塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(3)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(4)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜480番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(5)配列番号26に表される塩基配列の500番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(6)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAに相補的な配列からなるDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするDNAからなるゲノムを有するウイルス;並びに
(7)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAと95%以上の相同性を有しているDNAからなるゲノムを有するウイルス。
(1)配列番号26に表される塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(2)配列番号26に表される塩基配列の連続する500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750又は4000塩基からなる塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(3)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(4)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜480番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(5)配列番号26に表される塩基配列の500番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(6)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAに相補的な配列からなるDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするDNAからなるゲノムを有するウイルス;並びに
(7)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAと95%以上の相同性を有しているDNAからなるゲノムを有するウイルス。
[3] 配列番号5で表される塩基配列又は配列番号5で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるLITR E1A2遺伝子を有し、かつ配列番号7で表される塩基配列又は配列番号7で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるRITR遺伝子を有するイヌアデノウイルス2型F1株。
[4] ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号07071601で寄託されたイヌアデノウイルス2型F1株。
[5] 配列番号9で表される塩基配列又は配列番号9で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるH遺伝子を有し、かつ配列番号12で表される塩基配列又は配列番号12で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるF遺伝子を有するイヌジステンパーウイルス95-54株。
[6] ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号07071602で寄託されたイヌジステンパーウイルス95-54株。
[7] [1]又は[2]のイヌパルボウイルスF3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌパルボウイルス株。
[8] [7]の弱毒化イヌパルボウイルス株であって、配列番号1で表されるVP2遺伝子の塩基配列において、第885、886、892、894及び895番目の1つ又は複数、好ましくはすべての塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化イヌパルボウイルス株。
[9] 第891番目と892番目の塩基の間に2塩基が挿入され、及び/又は第901番目と902番目の塩基の間に100塩基が挿入された塩基配列を有する、[7]又は[8]の弱毒化イヌパルボウイルス株。
[10] [3]又は[4]のイヌアデノウイルス2型F1株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌアデノウイルス2型株。
[11] [10]の弱毒化イヌアデノウイルス2型株であって、配列番号5で表されるLITR遺伝子において、1つ又は複数の塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化イヌアデノウイルス2型株。
[12] [5]又は[6]のイヌジステンパーウイルス95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌジステンパーウイルス株。
[13] [12]の弱毒化イヌジステンパーウイルス株であって、以下の(1)〜(3)の変異の少なくとも1つの変異を有する弱毒化イヌジステンパーウイルス株:
(1)配列番号12で表されるF遺伝子にける第394及び/又は523番目の塩基の変異、
(2)配列番号10で表されるH遺伝子における第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異、
(3)配列番号10で表されるH遺伝子における第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。
(1)配列番号12で表されるF遺伝子にける第394及び/又は523番目の塩基の変異、
(2)配列番号10で表されるH遺伝子における第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異、
(3)配列番号10で表されるH遺伝子における第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。
[14] [7]〜[9]のいずれかの弱毒化イヌパルボウイルス株、[10]若しくは[11]の弱毒化イヌアデノウイルス2型株並びに[12]若しくは[13]の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の1種、2種又は3種を含むイヌウイルス感染症ワクチン。
[15] [7]〜[9]のいずれかの弱毒化イヌパルボウイルス株、[10]若しくは[11]の弱毒化イヌアデノウイルス2型株並びに[12]若しくは[13]の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の3種類を含むイヌウイルス感染症混合ワクチン。
[16] 異なるウイルス株同士の間で干渉が生じない、[14]又は[15]のイヌウイルス感染症混合ワクチン。
[17] イヌジステンパーウイルスとイヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、[16]のイヌウイルス感染症混合ワクチン。
[18] 経口接種用である、[14]〜[17]のいずれかのイヌウイルス感染症ワクチン。
[19] 生後4〜18週までの仔イヌに接種した場合に、免疫が成立し得る仔イヌ用の[14]〜[18]のいずれかのイヌウイルス感染症ワクチン。
[20] [7]〜[9]のいずれかの弱毒化イヌパルボウイルス株、[10]若しくは[11]の弱毒化イヌアデノウイルス2型株並びに[12]若しくは[13]の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の1種、2種又は3種をイヌに経口接種することを含む、イヌのウイルス感染症を防御する方法。
[21] 異なるウイルス株同士の間で干渉が生じない、[20]のイヌのウイルス感染症を防御する方法。
[22] イヌジステンパーウイルスとイヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、[20]又は[21]のイヌのウイルス感染症を防御する方法。
[23] 生後4〜18週の仔イヌに接種する、[20]〜[22]のいずれかのイヌのウイルス感染症を防御する方法。
本発明の新規な弱毒化イヌジステンパーウイルス株、イヌアデノウイルス株及びイヌパルボウイルス株は、経口投与によりイヌに免疫を成立させることができる。経口投与が可能になることにより、ワクチン接種にかかる時間やコストが低減される。また、一度に多数のイヌに集団投与することも可能である。さらに、母イヌからの移行抗体を保持している仔イヌに対して投与した場合も、移行抗体により中和排除されることなく、仔イヌに対して免疫を成立させることが可能である。従って、イヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス1型及び2型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に罹患するリスクにさらされている、移行抗体が減少しているが、従来のワクチンを中和してしまう仔イヌにも投与することができ、仔イヌをこれらのウイルス感染症から防御することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006-248522号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、弱毒化されたイヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス2型及びイヌパルボウイルスであり、これらの弱毒化ウイルスを含むイヌジステンパー用ワクチン、イヌアデノウイルス2型感染症ワクチン及びイヌパルボウイルス感染症ワクチンである。
弱毒化は元来病原性を有する親株の毒性を低下させることをいい、弱毒化されたウイルス株は感染性はあるが、病原性を有さない。
弱毒化させる親株としては、病原性のある野外からのウイルス分離株(ビルレント株)を用いる。病原性のあるウイルス株は、イヌから単離することができる。本発明で親株として用いる病原性のあるウイルス分離株は、イヌジステンパーウイルスとしては95-54株、イヌアデノウイルス2型としてはF1株、イヌパルボウイルスとしてはF3株を用いればよい。弱毒化は親株を弱毒化する突然変異が蓄積するような時間、これらのウイルスを適当な培養細胞中で連続継代することにより、培養細胞へ馴化させて行う。連続継代は、ウイルス株による細胞系への感染、該宿主細胞からの該ウイルス子孫の回収、および該ウイルス子孫による宿主細胞への後続感染により次の継代を得ることを意味する。弱毒化のための継代のための培養細胞としては、VERO細胞(アフリカミドリザル正常腎)、MDCK細胞(イヌ正常腎)、CRFK細胞(ネコ腎由来株化細胞)、B95a(マーモセット由来のBリンパ芽球細胞)、A72(イヌ細胞)等を用いることができる。このうち、イヌジステンパーウイルスの継代には、VERO細胞又はB95a細胞、好ましくはVERO細胞が好適に用いられ、イヌアデノウイルス2型の継代には、MDCK細胞又はCRFK細胞、好ましくはMDCK細胞が好適に用いられ、イヌパルボウイルスの継代には、A72細胞又はCRFK細胞が好適に用いられる。本発明の弱毒化されたウイルス株は、培養細胞を用いて少なくとも10継代、好ましくは50継代、さらに好ましくは75継代、さらに好ましくは100継代することにより得られる。ウイルスの継代培養は以下の方法で行なう。
イヌジステンパーウイルス及びイヌアデノウイルス2型の場合
1.細胞を継代する。
1.細胞を継代する。
2.単層を形成したら、培地を除去する。
3.ウイルス液を接種する。
4. 37℃で1時間吸着させる。
5. 細胞維持培地を加える。
6.37℃のCO2インキュベーターで培養する。
7.CPEが観察されたら、−80℃で凍結するとともに更に継代する。
イヌパルボウイルスの場合
1.細胞を継代する。
1.細胞を継代する。
2.ウイルス液を接種する。
3.37℃のCO2インキュベーターで培養する。
4.CPEが観察されたら、−80℃で凍結するとともに更に継代する。
親株からの目的ウイルスを連続継代することにより、変異株を取得する。イヌに継代分離株を投与し、該イヌの臨床プロフィールを確認することにより、これらの変異株が弱毒化されたかどうか決定することができる。あるウイルス株がイヌに感染するが病気を発生させる能力を有さないと確認されたら、それは弱毒化されたと判断することができる。
弱毒化ウイルスを分離した後、そのゲノムの配列分析を行ってもよい。
本発明の弱毒化ウイルスは、ウイルスの病原性に関与する遺伝子に変異が生じ、弱毒化されている。ウイルスの病原性に関与する遺伝子として、イヌパルボウイルスでは、VP1(virion capsid) protein1、VP2(virion capsid protein2)をコードする遺伝子、等があり、イヌジステンパーウイルスでは、F(fusion protein)、H(hemagglutinin protein)、等がある。
3種類のウイルスの以下に掲げる遺伝子の親株(Challenge株)の塩基配列又は継代した株の塩基配列の配列を以下の配列番号として配列表に示す。
イヌパルボウイルス
VP2 10代継代 配列番号1
VP2 50代継代 配列番号2
N 10代継代 配列番号3
N 50代継代 配列番号4
イヌアデノウイルス2型
LITR E1A 1代継代 配列番号5
LITR E1A 50代継代 配列番号6
RITR 1代継代 配列番号7
RITR 50代継代 配列番号8
イヌジステンパーウイルス
H 親株(Challenge株) 配列番号9
H 14代継代 配列番号10
H 50代継代 配列番号11
F 親株(Challenge株) 配列番号12
F 14代継代 配列番号13
NP 14代継代 配列番号14
NP 50代継代 配列番号15
イヌパルボウイルスのVP2遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図1A〜1Cに示す。
VP2 10代継代 配列番号1
VP2 50代継代 配列番号2
N 10代継代 配列番号3
N 50代継代 配列番号4
イヌアデノウイルス2型
LITR E1A 1代継代 配列番号5
LITR E1A 50代継代 配列番号6
RITR 1代継代 配列番号7
RITR 50代継代 配列番号8
イヌジステンパーウイルス
H 親株(Challenge株) 配列番号9
H 14代継代 配列番号10
H 50代継代 配列番号11
F 親株(Challenge株) 配列番号12
F 14代継代 配列番号13
NP 14代継代 配列番号14
NP 50代継代 配列番号15
イヌパルボウイルスのVP2遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図1A〜1Cに示す。
イヌパルボウイルスのN遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図2A〜2Cに示す。
イヌアデノウイルス2型のLITR E1A遺伝子の1代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図3A〜3Dに示す。
イヌアデノウイルス2型のRITR遺伝子の1代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図4に示す。
イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の親株の塩基配列、14代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図5A〜5Eに示す。
イヌジステンパーウイルスのF遺伝子の親株の塩基配列及び14代継代した株の塩基配列の比較を図6A〜6Eに示す。
イヌジステンパーウイルスのNP遺伝子の14代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図7A〜7Cに示す。
図1〜7の塩基配列のアラインメントにより、継代により変異する遺伝子が存在することがわかる。これらの遺伝子の変異は、ウイルスの弱毒化に関与しているものと考えられる。
イヌパルボウイルスにおいては、VP2遺伝子において、50代継代したもので10代継代したものに対して、第885、886、892、894及び895番目の塩基が置換され、50代継代したものにおいて、第892及び893番目の2塩基(10代継代したものの第891番目と892番目の塩基の間)並びに第902から1003番目の塩基(10代継代したものの第901番目と902番目の塩基の間)が挿入されている。
イヌジステンパーウイルスにおいては、F遺伝子において、14代継代したもので親株に対して、第394及び523番目の塩基が置換されている。また、H遺伝子において、50代継代したもので、親株に対して、第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基が置換されている。さらに、50代継代したもので、14代継代したものに対して、第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基が置換されている。
本発明は、イヌより分離されたそれぞれのウイルスの親株である、イヌパルボウイルスF3株、イヌアデノウイルス2型F1株及びイヌジステンパーウイルス95-54株を包含する。
イヌアデノウイルス2型F1株及びイヌジステンパーウイルス95-54株は、2007年7月16日付けでECACC(European Collection of Cell Cultures, Centre for Emergency Preparedness and Response, The Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, UK)に、ブタベスト条約に基づきそれぞれ受託番号07071601及び受託番号07071602として寄託されている。
イヌパルボウイルスF3株は、配列番号1で表される塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるVP2遺伝子を有し、及び/又は配列番号3で表される塩基配列又は配列番号3で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるN遺伝子を有する。「1個又は数個」の「数個」とは9個以内、好ましくは5個以内、さらに好ましくは2個をいう。
イヌアデノウイルス2型F1株は、配列番号5で表される塩基配列又は配列番号5で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるLITR E1A2遺伝子を有し、及び/又は配列番号7で表される塩基配列又は配列番号7で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるRITR遺伝子を有する。「1個又は数個」の「数個」とは9個以内、好ましくは5個以内、さらに好ましくは2個をいう。
イヌジステンパーウイルス95-54株は、配列番号9で表される塩基配列又は配列番号9で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるH遺伝子を有し、及び/又は配列番号12で表される塩基配列又は配列番号12で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるF遺伝子を有する。また、さらに配列番号14で表される塩基配列又は配列番号14で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるNP遺伝子を有していてもよい。「1個又は数個」の「数個」とは9個以内、好ましくは5個以内、さらに好ましくは2個をいう。
配列番号26にイヌパルボウイルスF3株の全長配列に近い部分配列を示す。該配列は全長配列の約75〜80%に相当する。該配列はショットガン・シークエンシング法で解析した配列であり、一部クオリティーの低い塩基も存在する。本発明のイヌパルボウイルスF3株は以下のいずれかのウイルスであると特定される。
(1)配列番号26に表される塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
(2)配列番号26に表される塩基配列の連続する500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750又は4000塩基からなる塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(3)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
(4)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜480番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
(5)配列番号26に表される塩基配列の500番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
(6)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAに相補的な配列からなるDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするDNAからなるゲノムを有するウイルスであり、ここで、ストリンジェントな条件とは、すなわち、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる)を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件、あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にDNAを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔50% フォルムアミド、4×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10× デンハルツ(Denhardt, s)溶液、100μg/mlサケ精子DNA〕中で42℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができる条件をいう、並びに
(7)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAとBLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて)を用いて計算したときに、少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有しているDNAからなるゲノムを有するウイルス。
(2)配列番号26に表される塩基配列の連続する500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750又は4000塩基からなる塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(3)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
(4)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜480番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
(5)配列番号26に表される塩基配列の500番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
(6)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAに相補的な配列からなるDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするDNAからなるゲノムを有するウイルスであり、ここで、ストリンジェントな条件とは、すなわち、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる)を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件、あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にDNAを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔50% フォルムアミド、4×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10× デンハルツ(Denhardt, s)溶液、100μg/mlサケ精子DNA〕中で42℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができる条件をいう、並びに
(7)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAとBLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて)を用いて計算したときに、少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有しているDNAからなるゲノムを有するウイルス。
本発明のウイルスの弱毒株は、各ウイルスの親株から上記の変異部位に変異を有する塩基配列を有するウイルス株である。
すなわち、イヌパルボウイルスF3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌパルボウイルス株であって、配列番号1で表されるVP2遺伝子の塩基配列において、第885、886、892、894及び895番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべてが変異した塩基配列を有する株であり、又はさらに第891番目と892番目の塩基の間に2塩基が挿入され、及び/又は第901番目と902番目の塩基の間に100塩基が挿入されていてもよい。
イヌジステンパーウイルス95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌジステンパーウイルス株は、以下の(1)〜(3)の変異の少なくとも1つ、好ましくは2つ、さらに好ましくは3つを有する株である。
(1)配列番号12で表されるF遺伝子にける第394及び/又は523番目の塩基の変異。
(2)配列番号10で表されるH遺伝子における第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。
(3)配列番号10で表されるH遺伝子における第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。
本発明のワクチンは、イヌジステンパー用ワクチン、イヌアデノウイルス1型及び2型感染症ワクチン及びイヌパルボウイルス感染症ワクチンのそれぞれを単味ワクチンとして使用することもできるし、イヌジステンパー用ワクチンとイヌアデノウイルス1型及び2型感染症ワクチン、イヌジステンパー用ワクチンとイヌパルボウイルス感染症ワクチン、又はイヌアデノウイルス1型及び2型感染症ワクチンとイヌパルボウイルス感染症ワクチンの2種類の混合ワクチン又はイヌジステンパー用ワクチン、イヌアデノウイルス2型感染症ワクチン及びイヌパルボウイルス感染症ワクチンの3種類の混合ワクチンとしても使用することができる。
本発明のワクチンは、混合して投与した場合であっても、ウイルス同士で干渉を起こすことなく、混合した弱毒ウイルス株のすべてについて抗体価が上昇し得る。特に、イヌジステンパーウイルスワクチンとイヌパルボウイルスワクチンを含む混合ワクチンを用いた場合でも干渉は生じない。
本発明のワクチンの投与量は、公知のワクチンと同様である。ワクチン中のウイルスの含有量は、イヌジステンパーウイルスは約1×102〜約1×1012の50%組織培養感染量(TCID50)、イヌアデノウイルス2型は約1×102〜約1×1012の50%組織培養感染量(TCID50)、イヌパルボウイルスは約1×102〜約1×1012の50%組織培養感染量(TCID50)である。ワクチンのTCID50は細胞変性効果(cytopathic effect; CPE)の有無により測定する。CPEは、培養細胞が顆粒状や円形化、膨化などいろいろな形態を示し、最後には培養容器から脱落して細胞維持液中を浮遊することをいい、顕微鏡で確認することができる。
本発明のワクチンは、獣医学的に有効量の本発明のウイルスワクチンを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。ワクチンは、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内または皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮または皮内の各経路によって接種できる。この中でも経口接種、経鼻接種及び経粘膜接種が好ましい。また、本発明のワクチンは飲料水や餌に含ませた状態でイヌに摂取させてもよい。本発明は、ワクチンを含む飲料水及び餌も包含する。
本発明のワクチンは、母イヌからの移行抗体を有しており、通常の注射による接種では移行抗体によりワクチンウイルスが排除され、免疫が成立しない仔イヌに対しても免疫を成立させることができる。仔イヌとしては、移行免疫を有している生後4〜18週、好ましくは4〜8週の仔イヌが対象となる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例1 ウイルスの弱毒化
ウイルス親株は以下のようにして分離した。
ウイルス親株は以下のようにして分離した。
イヌパルボウイルスF3株は、福島県郡山市保健所より入手した雑種犬糞便より常法により分離した。
イヌアデノウイルス2型F1株は日本全薬工業株式会社内にして飼育していた自家繁殖ビーグル犬咽喉等拭い液より常法により分離した。
イヌジステンパーウイルス95-54株は、日本全薬工業株式会社に検査依頼のあった犬鼻汁検体より日本全薬工業株式会社が分離した。
ウイルスの継代培養は以下の方法で行なった。
イヌジステンパーウイルス及びイヌアデノウイルス2型の場合
1.細胞を継代する。
1.細胞を継代する。
2.単層を形成したら、培地を除去する。
3.ウイルス液を接種する。
4. 37℃で1時間吸着させる。
5. 細胞維持培地を加える。
6.37℃のCO2インキュベーターで培養する。
7.CPEが観察されたら、−80℃で凍結するとともに更に継代する。
イヌパルボウイルスの場合
1.細胞を継代する。
1.細胞を継代する。
2.ウイルス液を接種する。
3.37℃のCO2インキュベーターで培養する。
4.CPEが観察されたら、−80℃で凍結するとともに更に継代する。
実施例2 ウイルス遺伝子の特定領域の配列決定
イヌジステンパーウイルス(CDV)H及びF遺伝子配列の決定
10cm径の細胞培養用シャーレ(ファルコン製)にフルシート状に発育したVero細胞に2〜3mLのウイルス液を接種し、37℃で1時間吸着後、増殖用培地15mlを加え、37℃で3〜4日間培養した。細胞変性効果が全体の50% 程度となった時点で、市販のRNA抽出キット(TRIZOL試薬、ライフテックオリエンタル製)を用いて、ウイルス感染細胞内から全RNAを抽出した。操作は添付の使用説明書に従った。すなわち、シャーレから培地を除き、細胞に1mlのTRIZOL試薬を加え、ピペッティングによりホモジナイズし、得られた細胞溶解液を1.5ml 遠心チューブに移して室温で5分間静置した。これに0.2ml のクロロホルムを加え、混和後、室温で3分間静置した。遠心(12000 ×g、15分間、4℃)後、水層を別の遠心チューブに移してイソプロパノール沈殿操作を行った。得られた沈殿を75% エタノールで遠心洗浄(7500 ×g、5分間、4℃)し、風乾後、ジエチルピロカーボネート処理水(DEPC水)で0.5〜1.0μg /μlの濃度に溶解したものをウイルスRNA溶液とした。
イヌジステンパーウイルス(CDV)H及びF遺伝子配列の決定
10cm径の細胞培養用シャーレ(ファルコン製)にフルシート状に発育したVero細胞に2〜3mLのウイルス液を接種し、37℃で1時間吸着後、増殖用培地15mlを加え、37℃で3〜4日間培養した。細胞変性効果が全体の50% 程度となった時点で、市販のRNA抽出キット(TRIZOL試薬、ライフテックオリエンタル製)を用いて、ウイルス感染細胞内から全RNAを抽出した。操作は添付の使用説明書に従った。すなわち、シャーレから培地を除き、細胞に1mlのTRIZOL試薬を加え、ピペッティングによりホモジナイズし、得られた細胞溶解液を1.5ml 遠心チューブに移して室温で5分間静置した。これに0.2ml のクロロホルムを加え、混和後、室温で3分間静置した。遠心(12000 ×g、15分間、4℃)後、水層を別の遠心チューブに移してイソプロパノール沈殿操作を行った。得られた沈殿を75% エタノールで遠心洗浄(7500 ×g、5分間、4℃)し、風乾後、ジエチルピロカーボネート処理水(DEPC水)で0.5〜1.0μg /μlの濃度に溶解したものをウイルスRNA溶液とした。
逆転写反応には0.5ml チューブを用い、ウイルスRNA溶液1μl、CDV H 又はFリバースプライマー0.25μl 、5× 1st Strand Buffer (逆転写酵素添付品)2μl 及びDEPC水4.55μlを加えて全量を7.8μl とし、さらにミネラルオイル(Sigma製、DNase、RNase、and Proteaseフリー) を1滴重層した。70℃ で10分間加熱後、直ちに氷冷した。次いで、M-MLV逆転写酵素(200 units/μl ライフテックオリエンタル製)0.5μl、デオキシヌクレオチド混合溶液(Pharmacia製)0.5μl、0.1M ジチオスレイトール1μl 及びRNase阻害剤(RNasin; 40 units / μl、TOYOBO製)0.2μlを加えて総量10μl のRT反応液とし、37℃で1時間反応させCDV H及びF遺伝子 mRNAのcDNAを合成した。反応終了後、70℃で10分間加熱した。
このRT反応液全量に10× PCR Buffer (Taq DNA ポリメラーゼ添付品)10μl、各プライマー(CDV H フォワードプライマー及びリバースプライマー又はCDV Fフォワードプライマー及びリバースプライマー)0.5μlずつ、dNTPs Mixture(各2.5mM、Taq DNAポリメラーゼ添付品)8μl、滅菌蒸留水70.5μl 及びTaq DNAポリメラーゼ(TaKaRa EX Taq; 5 units / μl、宝酒造製)0.5μlを加えて全量100μl のPCR反応液とした。PCR用のDNA増幅装置はサーマルサイクリックリアクター(TC-100、東洋紡エンジニアリング製)を用い、これにPCR反応液をセットし、94℃ 1分間、58℃ 1分間、72℃ 2分間のサイクルを30回繰り返した。反応終了後、反応液の一部をとり、0.7% アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下でCDV H及びF遺伝子DNAの増幅を確認した。
その後、宝酒造(株)遺伝子解析センターにシークエンス及び遺伝子解析を委託した。
イヌアデノウイルス2型(CAV2)遺伝子配列の決定
75cm2角型培養フラスコにフルシート状に発育したMDCK細胞を、10ml のリン酸緩衝液で洗浄した後、ウイルス液を1ml 接種した。37℃で30分間静置してウイルスを吸着させた後、これに20ml の細胞増殖用培地を加えて、37℃で40時間静置培養した。
75cm2角型培養フラスコにフルシート状に発育したMDCK細胞を、10ml のリン酸緩衝液で洗浄した後、ウイルス液を1ml 接種した。37℃で30分間静置してウイルスを吸着させた後、これに20ml の細胞増殖用培地を加えて、37℃で40時間静置培養した。
ウイルス感染細胞からのウイルスDNAの抽出は、品川らの方法(Shinagawa et.al. Microbiol.Immunol. 27 817-822 1983)に従って実施した。
培地を除去し、2ml の細胞溶解液を加え室温に10分間静置した後、37℃で5分間保温した。これに0.5ml の5M塩化ナトリウムを加え穏やかに反転攪拌し、37℃に5分間保温後、3〜4時間氷冷した。10000×gで5分間遠心し、上清に10mM トリス- 塩酸緩衝液で飽和させたフェノールを等量加え、室温で10分間振盪後、16000×gで10分間遠心した。水層を除去し、フェノール層に等量の10mM トリス - 塩酸緩衝液を加え同様に振盪、遠心した。水層を完全に除去後、フェノール層に1.5倍容のエタノールを加えて、10分間氷冷し、4000×gで10分間遠心した。
得られた沈殿を0.5ml の80% エタノールで洗浄後、0.5mlのTENS溶液に溶解し、これに250〜500μgのProteinase K 粉末を加え、不溶性物質が確認できなくなるまで約1時間37℃で保温した。この酵素分解溶液に等量のフェノール:クロロホルム(1:1)を加えて同様の操作を行い、さらにこの水層に等量のクロロホルムを加えて同様に処理した。得られた水層に1/10容の3M酢酸ナトリウム溶液と1ml のエタノールを加え、−70℃ にて1時間静置後、10000×g で10分間遠心した。得られた沈殿を80% エタノールで洗浄後、20μlのTE緩衝液に溶解しウイルスDNA溶液とした。
その後、宝酒造(株)遺伝子解析センターにシークエンス及び遺伝子解析を委託した。
イヌパルボウイルス(CPV)VP-2遺伝子の配列決定
CPVにおけるVP-2遺伝子解析は、以下の方法にて実施した。増殖用培地で調整したA72細胞浮遊液(7×105/ml)5mlに2〜3mlのウイルス液を加え、25cm2の角型培養フラスコ(ファルコン製)に播種した。37℃で3〜4日間培養し、細胞変性効果が全面に拡がった時点で培養液を回収した。遠心(3000rpm、10分間)後、得られた上清を滅菌蒸留水で100倍希釈したものをウイルス希釈液とした。
CPVにおけるVP-2遺伝子解析は、以下の方法にて実施した。増殖用培地で調整したA72細胞浮遊液(7×105/ml)5mlに2〜3mlのウイルス液を加え、25cm2の角型培養フラスコ(ファルコン製)に播種した。37℃で3〜4日間培養し、細胞変性効果が全面に拡がった時点で培養液を回収した。遠心(3000rpm、10分間)後、得られた上清を滅菌蒸留水で100倍希釈したものをウイルス希釈液とした。
0.5ml チューブにウイルス希釈液5μl、10× PCR Buffer (Taq DNA ポリメラーゼ添付品)10μl、各プライマー(VP-2 フォワードプライマー及びリバースプライマー)0.5μlずつ、dNTPs Mixture(Taq DNAポリメラーゼ添付品)8μl および滅菌蒸留水を加えて95μlとし、さらにミネラルオイル(Sigma製、DNase、RNase and Proteaseフリー)を一滴重層し、DNA増幅装置(サーマルサイクリックリアクター・TC-100、東洋紡エンジニアリング製)にセットして、94℃で5分間加熱した。次いでTaq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa Ex Taq;5 units/μl、宝酒造製)0.5μl 及び滅菌蒸留水を加えて全量100μlのPCR反応液とし、94℃ 30秒間、55℃ 2分間、72℃ 2分間のサイクルを30回繰り返した。反応終了後、反応液の一部をとり、0.7% アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で遺伝子DNAの増幅を確認した。
その後、宝酒造(株)遺伝子解析センターにシークエンス及び遺伝子解析を委託した。
配列決定において、RT-PCRは以下のプライマーを用いて行った。
CDV H フォワードプライマー 5’-AATGCTAGAGATGGTTTAATT-3’(配列番号16)
リバースプライマー 5’-AGGGCTCAGGTAGTCCAGC-3’(配列番号17)
CDV F フォワードプライマー 5’-CATAGCAAGCCAACAGGTCAACCAGG-3’(配列番号18)
リバースプライマー5’-CCTGGCAATCAAGCGAGATATATG-3 (配列番号19)
CPV VP-2 フォワードプライマー 5’-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCA-3’(配列番号20)
リバースプライマー 5’-ATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAG-3’(配列番号21)
実施例3 イヌジステンパーウイルスワクチンについての免疫原性試験及び感染防御試験からなる有効性評価試験、並びに病原性復帰試験からなる安全性評価試験
(1)有効性評価試験
イヌジステンパーウイルス(CDV)95-54株が経口接種で高い免疫原性を有する株であるかを調べるため、Vero細胞で24代継代し弱毒化した株をイヌに接種しCDVに対する中和抗体の産生について比較した。
リバースプライマー 5’-AGGGCTCAGGTAGTCCAGC-3’(配列番号17)
CDV F フォワードプライマー 5’-CATAGCAAGCCAACAGGTCAACCAGG-3’(配列番号18)
リバースプライマー5’-CCTGGCAATCAAGCGAGATATATG-3 (配列番号19)
CPV VP-2 フォワードプライマー 5’-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCA-3’(配列番号20)
リバースプライマー 5’-ATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAG-3’(配列番号21)
実施例3 イヌジステンパーウイルスワクチンについての免疫原性試験及び感染防御試験からなる有効性評価試験、並びに病原性復帰試験からなる安全性評価試験
(1)有効性評価試験
イヌジステンパーウイルス(CDV)95-54株が経口接種で高い免疫原性を有する株であるかを調べるため、Vero細胞で24代継代し弱毒化した株をイヌに接種しCDVに対する中和抗体の産生について比較した。
約3か月齢のビーグル犬 12頭を性別および月齢から経口投与群5頭、皮下注射群2頭、非接種群5頭の3群に分けた。経口投与群の供試犬には105.5/mLの濃度のCDV95-54株 培養上清 2mL/頭 を3週間間隔で2回経口および経鼻(各1mL)投与した。経鼻・経口による強毒株の攻撃は、約10cmの長さに切断したファイバースコープ用噴霧カテーテル(PW-6C-1、オリンパス光学工業製)の先端ノズル部分を19Gの注射針に取り付け、CDV抗体陰性犬の右側鼻腔内に挿入し、鼻咽頭部に噴霧して行った。皮下注射群の供試犬には105.5/mLの濃度のCDV 95-54株 培養上清 2mL/頭を3週間間隔で2回皮下注射した。1回目接種2日前から2回目接種後3週間目まで毎日、供試犬の一般臨床観察を行った。両群ともに1回目接種日から試験終了まで一週ごとに採血し、CDV抗体価測定を実施した。
また、免疫を付与した犬が経鼻・経口攻撃して感染を防御することができるかどうかを、感染防御用の攻撃用ウイルスとして弱毒していないCDV95-54強毒株を用い確認した。経鼻・経口による強毒株の攻撃は、105.5/mLの濃度のCDV95-54強毒株培養上清1mlを、免疫原生を確認した方法と同様に1回投与した。ウイルス接種前から接種後21日目まで毎週血清を採取し、CDV中和抗体価の測定を常法に従って実施した。
(2) 安全性評価試験
病原性復帰試験免疫用ウイルスとして、95-54株 培養上清(Vero細胞で24代継代、105.89 TCID50/mL)を用いた。
病原性復帰試験免疫用ウイルスとして、95-54株 培養上清(Vero細胞で24代継代、105.89 TCID50/mL)を用いた。
病原性復帰試験の1代目及び継代5代目には病原性試験を実施した。すなわち、供試犬5頭に対し、Vero細胞で24代継代した95-54株培養上清を鼻腔及び口腔内へそれぞれ1 mLずつ、シリンジを用いて滴下することで接種を行った。試験期間はワクチン接種前4日目(−4d)から接種後21日目までとし、下記の検査を実施した。
病原性復帰試験のウイルス継代用として、血液と糞便からウイルス検出を毎日行い、常法に従って継代した。
病原性試験の結果、弱毒化ウイルス株は、1頭にのみ、一過性の軽度の発熱が認められたが、ワクチンとして問題となるような病原性を有しないことが判明した。また、病原性の復帰も認められなかった。
実施例4 イヌパルボウイルスワクチンについての免疫原性試験及び感染防御試験からなる有効性評価試験、並びに病原性復帰試験からなる安全性評価試験
(1)有効性評価試験
CPV免疫原性試験
供試ウイルスとしてCPV F3株 培養上清(105.30/mL)(Vero細胞 68代継代)を用いた。
(1)有効性評価試験
CPV免疫原性試験
供試ウイルスとしてCPV F3株 培養上清(105.30/mL)(Vero細胞 68代継代)を用いた。
供試動物として約3か月齢のビーグル犬 5頭を用いた。約3か月齢のビーグル犬 5頭をCPV F3株 培養上清 2mL/頭 を3週間間隔で2回経口および経鼻(各1mL)投与した。1回目接種2日前から2回目接種後3週間目まで毎日、供試犬の一般臨床観察を行った。1回目接種日から試験終了まで一週ごとに採血し、CPV-HI価を測定することにより、CPV抗体価測定を実施した。
CPV感染防御試験
供試ウイルスとしてF3株 Vero細胞 68代継代培養上清(105.00TCID50/mL)を用いた。
供試ウイルスとしてF3株 Vero細胞 68代継代培養上清(105.00TCID50/mL)を用いた。
攻撃用ウイルスとしてF3野外強毒株を用いた。
供試動物として4〜5か月齢の健康でCPV抗体陰性のビーグル犬を用い、ワクチン候補株接種群として5頭、対照群として3頭、計8頭用いた。
免疫期間を終了した6Wに、供試犬全頭にF3強毒株1mLを経口投与し、攻撃した。試験期間は攻撃前2日目(-2d)から攻撃後14日目(14d)までとし、毎日採血を行い、血中のCPVの有無をPCRによるCPV DNAの検出により行なうとともに、表3に示した試験検査を行なった(但し、抗体価測定はHI抗体価)。
結果を図8及び9に示す。用いた弱毒化パルボウイルスは、ワクチンとして十分な免疫原性を有し、また感染を防御することもできた。
(2) 安全性評価試験
CPV病原性復帰試験
供試ウイルスとしてF3株 Vero細胞 68代継代培養上清(105.00TCID50/mL)を用いた。
CPV病原性復帰試験
供試ウイルスとしてF3株 Vero細胞 68代継代培養上清(105.00TCID50/mL)を用いた。
供試動物として約3ヶ月齢の健康でCPV抗体陰性のビーグル犬17頭を用いた。
病原性復帰試験の1代目及び継代5代目には病原性試験を実施した。まず、供試犬5頭に対し、F3 株培養上清を鼻腔及び口腔内へそれぞれ1 mLずつ、シリンジを用いて滴下することで接種を行った。病原性復帰試験のウイルス継代用として、血液と糞便からウイルス検出を毎日行い、常法に従って継代した。病原性試験検査項目は以下の通りであった。
検査項目は表3に示すとおりであり、抗体価のみHI価を測定した。
結果を図10に示す。病原性試験の結果、弱毒化ウイルス株は病原性を有しないことが判明した。また、病原性の復帰も認められなかった。
実施例5 CAV2免疫原性試験
供試ウイルスとしてCAV F1株 培養上清(104、105.5、107/mL、対照区)(MDCK細胞 105代継代)を用いた。
供試ウイルスとしてCAV F1株 培養上清(104、105.5、107/mL、対照区)(MDCK細胞 105代継代)を用いた。
供試動物として約3か月齢のビーグル犬 16頭を用いた。
約3か月齢のビーグル犬4頭/群をCAV F1株 培養上清 1mL/頭 を経口(各1mL)投与した。1回目接種日から試験終了まで一週ごとに採血し、CAV抗体価測定を実施した。弱毒化イヌアデノウイルス2型ワクチンは免疫原性を有していた。
実施例6 混合ワクチンの有効性試験
上述したそれぞれのワクチン株を混合し経口投与した際に、免疫を賦与する能力を有しているかどうかを確認した。比較用の供試ワクチンには、次の日本国内で市販されている代表的なワクチンを用いた。
上述したそれぞれのワクチン株を混合し経口投与した際に、免疫を賦与する能力を有しているかどうかを確認した。比較用の供試ワクチンには、次の日本国内で市販されている代表的なワクチンを用いた。
本発明のワクチンとしてはVero細胞で24代継代し弱毒したイヌジステンパーウイルス(CDV)、MDCK細胞で105代継代し弱毒したイヌアデノウイルス2型(CAV2)及びA72細胞で68代継代し弱毒したイヌパルボウイルス(CPV)の3種類のワクチン株のウイルス液を混合したものを用いた。
1.バンガード5:ジステンパー・イヌアデノウイルス(2型)感染症・イヌパラインフルエンザ・イヌパルボウイルス感染症混合生ワクチン(ファイザー株式会社、製造番号:478101)
2.デュラミューン5:ジステンパー・イヌアデノウイルス(2型)感染症・大パラインフルエンザ・イヌパルボウイルス感染症混合生ワクチン(共立製薬株式会社、製造番号:101152A)
3.“京都微研”キャナイン6:ジステンパー・イヌアデノウイルス(2型)感染症・イヌパラインフルエンザ・イヌパルボウイルス感染症・イヌコロナウイルス感染症混合生ワクチン(株式会社微生物化学研究所、製造番号:7-2)
4.本発明のワクチン:ジステンパー・イヌアデノウイルス(2型)感染症・イヌパルボ
ウイルス感染症混合ウイルス液
生後約3か月のCDV抗体陰性のビーグル犬を、各社のワクチンにつき3頭ずつ無作為に割り当て、ワクチン1ドース分(ウイルス液1mL(105.89TCID50/ml))を3週間間隔で2回、経口接種した。ワクチン接種前から接種後6週目まで毎週血清を採取し、CDV中和抗体価の測定を常法に従って実施した。なお、ワクチン株によって抗原交差性の異なることが考えられるため、中和用ウイルスはそれぞれのワクチンから分離したワクチン株を用いた。
2.デュラミューン5:ジステンパー・イヌアデノウイルス(2型)感染症・大パラインフルエンザ・イヌパルボウイルス感染症混合生ワクチン(共立製薬株式会社、製造番号:101152A)
3.“京都微研”キャナイン6:ジステンパー・イヌアデノウイルス(2型)感染症・イヌパラインフルエンザ・イヌパルボウイルス感染症・イヌコロナウイルス感染症混合生ワクチン(株式会社微生物化学研究所、製造番号:7-2)
4.本発明のワクチン:ジステンパー・イヌアデノウイルス(2型)感染症・イヌパルボ
ウイルス感染症混合ウイルス液
生後約3か月のCDV抗体陰性のビーグル犬を、各社のワクチンにつき3頭ずつ無作為に割り当て、ワクチン1ドース分(ウイルス液1mL(105.89TCID50/ml))を3週間間隔で2回、経口接種した。ワクチン接種前から接種後6週目まで毎週血清を採取し、CDV中和抗体価の測定を常法に従って実施した。なお、ワクチン株によって抗原交差性の異なることが考えられるため、中和用ウイルスはそれぞれのワクチンから分離したワクチン株を用いた。
各ワクチンを経口接種したイヌにおけるCDV中和抗体価を表1に示した。バンガード接種イヌでは3頭中1頭にワクチン接種後2週目より抗体産生がみられたが、残る2頭は抗体陰性のままであった。デュラミューン接種イヌでは1頭に5週目より抗体産生がみられたが低力価で、残る2頭は抗体陰性のままであった。キャナイン接種イヌでは1頭が3週目に、もう1頭では6週目に抗体産生がみられたが、残る1頭は抗体陰性のままであった。これらの結果から、市販ワクチンの経口接種によりCDVに対する免疫を確実に賦与させることはできないことが明らかとなった。
実施例7 移行抗体保有犬に対する経口生ワクチンの免疫原性確認
母親からの移行抗体のレベルが高い子犬にワクチン接種をしても、ワクチンウイルスが中和されてしまい、免疫が成立しない。最近ではワクチン中のウイルス含量を高めることにより、高レベルの移行抗体を乗り越えるワクチンも市販されている。
母親からの移行抗体のレベルが高い子犬にワクチン接種をしても、ワクチンウイルスが中和されてしまい、免疫が成立しない。最近ではワクチン中のウイルス含量を高めることにより、高レベルの移行抗体を乗り越えるワクチンも市販されている。
本発明者は、作製したワクチンウイルスを注射ではなく、自然感染ルートである経口から投与した場合、低レベルの移行抗体であれば乗り越えられて抗体応答がみられるのではないかという仮説を立てた。
そこで本実施例では、移行抗体を保有する子犬にワクチンウイルスを経口投与して抗体価を測定し、その免疫原性を確認した。
材料と方法
(1)供試動物
ワクチンウイルス投与時に約7〜8週齢で、移行抗体を保有する健康なビーグル種の子犬10頭を日本農産工業株式会社(Nosan:Beagle)から導入した(表5)。供試犬はアイソレータ内で個別飼育した。
(1)供試動物
ワクチンウイルス投与時に約7〜8週齢で、移行抗体を保有する健康なビーグル種の子犬10頭を日本農産工業株式会社(Nosan:Beagle)から導入した(表5)。供試犬はアイソレータ内で個別飼育した。
(2)供試ワクチン
日本全薬工業株式会社中央研究所において弱毒化したジステンパーウイルス(CDV)、犬アデノウイルス2型(CAV2)及び犬パルボウイルス(CPV)を用い、各ウイルス液を混合しての供試ワクチンを作製した。各ウイルスの含有量は下記のとおりである(表6)。
日本全薬工業株式会社中央研究所において弱毒化したジステンパーウイルス(CDV)、犬アデノウイルス2型(CAV2)及び犬パルボウイルス(CPV)を用い、各ウイルス液を混合しての供試ワクチンを作製した。各ウイルスの含有量は下記のとおりである(表6)。
ジステンパーウイルス 95-54/666株は、ジステンパーウイルス 95-54株をVero細胞を用いて24代継代した株であり、アデノウイルス2型 F1-HP株は、アデノウイルス2型 F1株をMDCK細胞を用いて105代継代した株であり、パルボウイルスF3/666株は、パルボウイルス F3株をVero細胞を用いて68代継代した株である。
(3)試験方法
試験日程を表7に示した。導入から3日間の馴致後、0Wに第一回目のワクチンウイルスの投与を行った。経口投与はウイルス液1 mLをシリンジに採り、これを飲ませることで行った。さらにその3週後にも同ウイルス液を経口投与した。第一回目投与前から第二回目投与後2週目まで1週間ごとに血清を採取し(計6時点)、CDV及びCAV2は中和抗体価、CPVはHI価を測定した。抗体応答の判定基準は、各抗体価がワクチン投与前と同等以上に上昇した場合、抗体応答ありと判定した。
試験日程を表7に示した。導入から3日間の馴致後、0Wに第一回目のワクチンウイルスの投与を行った。経口投与はウイルス液1 mLをシリンジに採り、これを飲ませることで行った。さらにその3週後にも同ウイルス液を経口投与した。第一回目投与前から第二回目投与後2週目まで1週間ごとに血清を採取し(計6時点)、CDV及びCAV2は中和抗体価、CPVはHI価を測定した。抗体応答の判定基準は、各抗体価がワクチン投与前と同等以上に上昇した場合、抗体応答ありと判定した。
結果及び考察
1)CDV中和抗体価
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCDV中和抗体価の推移を表8に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表9に示した。第一回投与前にはすべての個体が移行抗体を保有(1:4から1:22)していた。第一回ワクチン投与後1週目には10頭中9頭が抗体陰性となったが、2週目には1頭を除き抗体陽転化し、第二回ワクチン投与後2週目(試験終了時)には1:512から1:2,048となった(表8)。
1)CDV中和抗体価
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCDV中和抗体価の推移を表8に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表9に示した。第一回投与前にはすべての個体が移行抗体を保有(1:4から1:22)していた。第一回ワクチン投与後1週目には10頭中9頭が抗体陰性となったが、2週目には1頭を除き抗体陽転化し、第二回ワクチン投与後2週目(試験終了時)には1:512から1:2,048となった(表8)。
移行抗体価が1:8以下ではワクチン1回投与で抗体応答率が100%(7頭中7頭)となった。一方、1:10以上では3頭中1頭が1回投与では応答がみられなかったものの、2回投与後には全頭陽転化した(表9)。
2)CAV2中和抗体価
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCAV2中和抗体価の推移を表10に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表9に示した。第一回投与前にはすべての個体が移行抗体を保有(1:4から1:128)していた。試験終了時には全頭陽転化しており、抗体価は1:64から1:6,472までの範囲となった。
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCAV2中和抗体価の推移を表10に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表9に示した。第一回投与前にはすべての個体が移行抗体を保有(1:4から1:128)していた。試験終了時には全頭陽転化しており、抗体価は1:64から1:6,472までの範囲となった。
3)CPV中和抗体価
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCPV-HI抗体価の推移を表11に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表9に示した。供試犬10頭中2頭はワクチン投与時に抗体陰性であったため、移行抗体保有犬のデータには含めなかった。参考までに、この2頭は第一回ワクチン投与後1週目に陽転化した。残る8頭は1:16から1:128の移行抗体を保有していた。試験終了時の抗体応答率は75%(8頭中6頭)で、抗体価は1:128から1:2,048の範囲であった。
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCPV-HI抗体価の推移を表11に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表9に示した。供試犬10頭中2頭はワクチン投与時に抗体陰性であったため、移行抗体保有犬のデータには含めなかった。参考までに、この2頭は第一回ワクチン投与後1週目に陽転化した。残る8頭は1:16から1:128の移行抗体を保有していた。試験終了時の抗体応答率は75%(8頭中6頭)で、抗体価は1:128から1:2,048の範囲であった。
移行抗体価が1:16以下ではワクチン1回投与で抗体応答率が100%(2頭中2頭)となった。一方、1:32以上になると1回投与では全頭応答がみられなかったが、2回投与後で75%(6頭中4頭)の応答率となった。
一般に高いレベルの移行抗体を乗り越えるためには、ワクチン株の免疫原性とともに接種ウイルス量が重要であることが知られている。本実施例において作製したワクチンのCPV含有量は市販ワクチンのものと比べると低く、そのため移行抗体が高レベルの個体では応答が得られにくかったと考えられる。したがってワクチン中のウイルス含有量を高めることにより、高いレベルの移行抗体を保有する子犬に対しても免疫を付与できる可能性がある。
本実施例の成績から、1回または2回のワクチン投与により各ウイルスに対する抗体応答が得られたことから、ワクチンの経口接種は移行抗体保有犬に対しても有効であることが証明された。
経口接種可能なイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス2型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対する本発明のワクチンは、これらの感染症に対するイヌの予防又は治療のために有用である。
配列番号16〜25 人工配列の説明:プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (23)
- 配列番号1で表される塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるVP2遺伝子を有するイヌパルボウイルスF3株。
- 以下の(1)〜(7)のいずれかのウイルスである請求項1記載のイヌパルボウイルスF3株:
(1)配列番号26に表される塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(2)配列番号26に表される塩基配列の連続する500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750又は4000塩基からなる塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(3)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(4)配列番号26に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜480番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(5)配列番号26に表される塩基配列の500番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス;
(6)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAに相補的な配列からなるDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするDNAからなるゲノムを有するウイルス;並びに
(7)上記(1)〜(5)のゲノムの塩基配列からなるDNAと95%以上の相同性を有しているDNAからなるゲノムを有するウイルス。 - 配列番号5で表される塩基配列又は配列番号5で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるLITR E1A2遺伝子を有し、かつ配列番号7で表される塩基配列又は配列番号7で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるRITR遺伝子を有するイヌアデノウイルス2型F1株。
- ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号07071601で寄託されたイヌアデノウイルス2型F1株。
- 配列番号9で表される塩基配列又は配列番号9で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるH遺伝子を有し、かつ配列番号12で表される塩基配列又は配列番号12で表される塩基配列において、1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるF遺伝子を有するイヌジステンパーウイルス95-54株。
- ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号07071602で寄託されたイヌジステンパーウイルス95-54株。
- 請求項1又は2に記載のイヌパルボウイルスF3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌパルボウイルス株。
- 請求項7に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株であって、配列番号1で表されるVP2遺伝子の塩基配列において、第885、886、892、894及び895番目の1つ又は複数、好ましくはすべての塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化イヌパルボウイルス株。
- 第891番目と892番目の塩基の間に2塩基が挿入され、及び/又は第901番目と902番目の塩基の間に100塩基が挿入された塩基配列を有する、請求項7又は8に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株。
- 請求項3又は4に記載のイヌアデノウイルス2型F1株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌアデノウイルス2型株。
- 請求項10に記載の弱毒化イヌアデノウイルス2型株であって、配列番号5で表されるLITR E1A2遺伝子において、1つ又は複数の塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化イヌアデノウイルス2型株。
- 請求項5又は6に記載のイヌジステンパーウイルス95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌジステンパーウイルス株。
- 請求項12に記載の弱毒化イヌジステンパーウイルス株であって、以下の(1)〜(3)の変異の少なくとも1つの変異を有する弱毒化イヌジステンパーウイルス株:
(1)配列番号12で表されるF遺伝子にける第394及び/又は523番目の塩基の変異、
(2)配列番号10で表されるH遺伝子における第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異、
(3)配列番号10で表されるH遺伝子における第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。 - 請求項7〜9のいずれか1項に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株、請求項10若しくは11に記載の弱毒化イヌアデノウイルス2型株並びに請求項12若しくは13に記載の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の1種、2種又は3種を含むイヌウイルス感染症ワクチン。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株、請求項10若しくは11に記載の弱毒化イヌアデノウイルス2型株並びに請求項12若しくは13に記載の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の3種類を含むイヌウイルス感染症混合ワクチン。
- 異なるウイルス株同士の間で干渉が生じない、請求項14又は15に記載のイヌウイルス感染症混合ワクチン。
- イヌジステンパーウイルスとイヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、請求項16記載のイヌウイルス感染症混合ワクチン。
- 経口接種用である、請求項14〜17のいずれか1項に記載のイヌウイルス感染症ワクチン。
- 生後4〜18週までの仔イヌに接種した場合に、免疫が成立し得る仔イヌ用の請求項14〜18のいずれか1項に記載のイヌウイルス感染症ワクチン。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株、請求項10若しくは11に記載の弱毒化イヌアデノウイルス2型株並びに請求項12若しくは13に記載の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の1種、2種又は3種をイヌに経口接種することを含む、イヌのウイルス感染症を防御する方法。
- 異なるウイルス株同士の間で干渉が生じない、請求項20記載のイヌのウイルス感染症を防御する方法。
- イヌジステンパーウイルスとイヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、請求項20又は21に記載のイヌのウイルス感染症を防御する方法。
- 生後4〜18週の仔イヌに接種する、請求項20〜22のいずれか1項に記載のイヌのウイルス感染症を防御する方法。
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