KR20180104088A - 약독화된 감염성 기관지염 바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비-구조 단백질 nsp-3에서의 돌연변이 및/또는 보조 단백질 3a 및 3b의 결실을 포함하는 생 약독화된 코로나바이러스를 제공한다. 코로나바이러스는 대상체에서 질환, 예컨대 감염성 기관지염을 치료하고/거나 예방하기 위한 백신으로서 사용될 수 있다.

Description

약독화된 감염성 기관지염 바이러스
본 발명은 바이러스가 감소된 병원성을 갖도록 하는 돌연변이를 포함하는 약독화된 코로나바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환을 예방하고/거나 치료하기 위한 백신에 있어서의 이러한 코로나바이러스의 용도에 관한 것이다.
감염성 기관지염 (IB)의 병인체인 조류 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)는 주로 기도에서뿐만 아니라 장, 신장 및 난관의 상피 세포에서 복제되는, 가금류의 고도로 감염성이고 전염성인 병원체이다. IBV는 니도비랄레스(Nidovirales) 목, 코로나비리다에(Coronaviridae) 과, 코로나비리나에(Coronavirinae) 아과 및 감마코로나바이러스(Gammacoronavirus) 속의 구성원이고; 유전적으로 매우 유사한 코로나바이러스는 칠면조, 호로새 및 꿩에서 질환을 유발한다.
IB의 임상 징후는 재채기, 기관 수포음, 비루 및 천명을 포함한다. 육용형 조류는 체중 증가가 감소되는 반면, 산란 조류는 난을 보다 적게 낳고 품질이 불량한 난을 생산한다. 호흡기 감염은 닭을 2차 박테리아 감염에 취약하게 하고, 이는 병아리에서 치명적일 수 있다. 바이러스는 또한, 특히 병아리에서, 난관에 영구적 손상을 유발할 수 있고, 이는 감소된 계란 생산 및 품질로 이어지고; 신장에 영구적 손상을 유발할 수 있고, 이는 때때로 치명적일 수 있는 신장 질환으로 이어진다.
IBV는 가금업에 임의의 다른 감염성 질환보다 더 큰 경제적 손실의 원인이 되는 것으로 보고되었다. 생 약독화된 백신 및 불활성화된 백신이 보편적으로 IBV의 방제에 사용되고 있지만, 백신접종의 사용에 의해 획득되는 보호는 백신 파괴 또는 사용된 백신과 관련되지 않은 새로운 IBV 혈청형의 도입으로 인해 상실될 수 있고, 이는 가금업에 위험을 야기한다.
추가로, 가금업에서 백신접종 프로그램의 효율 및 비용 효과성을 개선시키기 위해, 난내 사용하는 데 적합한 백신을 개발할 필요가 있다. 난내 백신접종과 연관된 주요 챌린지는 바이러스가 배아에 대해 병원성이 아니면서, 바이러스에 대한 모체-유래 항체의 존재 하에 복제될 수 있어야 한다는 것이다. 현행 IBV 백신은 발육란에서의 다수회의 계대배양 후 유래되고, 이는 닭에 대해 감소된 병원성을 갖는 바이러스를 생성하므로, 이들은 생 약독화된 백신으로서 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 바이러스는 거의 항상 배아에 대해 증가된 병독성을 나타내고 따라서 이들이 부화율을 감소시키기 때문에 난내 백신접종에 사용될 수 없다. 일부 경우에 부화율의 70% 감소가 관찰된다.
발육란에서의 다수회의 계대배양 후 약독화는 또한 다른 단점을 갖는다. 이것은 바이러스의 약독화가 무작위적이고 바이러스가 계대배양될 때마다 달라질 것이므로, 약독화 목적을 위한 상이한 일련의 난을 통한 동일한 바이러스의 계대배양은 약독화를 유도하는 상이한 돌연변이 세트로 이어질 것이기 때문에 경험적 방법이다. 또한, 공정과 연관된 효능 문제가 존재하고: 일부 돌연변이는 바이러스의 복제에 영향을 미칠 것이고 돌연변이 중 일부는 바이러스를 너무 약독화시킬 수 있다. 돌연변이는 또한 면역원성에 영향을 미칠 수 있는 S 유전자에서 또한 발생할 수 있으므로, 목적하는 면역 반응이 영향을 받고 잠재적인 백신은 필요한 혈청형에 대해 보호하지 않을 수 있다. 또한 백신의 병독성 복귀 및 안정성과 연관된 문제가 존재한다.
IBV의 방제를 위한 새롭고 보다 안전한 백신이 개발되는 것이 중요하다. 따라서, 이들 문제와 연관되지 않은 IBV 백신, 특히 난내 백신접종에 사용될 수 있는 백신에 대한 필요가 있다.
본 발명자들은 IBV를 합리적으로 약독화시키기 위해 역 유전학 접근법을 사용하였다. 이 접근법은 각각의 돌연변이의 위치가 공지되어 있고 바이러스에 대한 그의 효과, 즉 약독화에 대한 이유가 도출될 수 있기 때문에 발육란에서의 다수회의 계대배양 후 무작위 약독화보다 훨씬 더 제어가능하다.
그의 역 유전학 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 바이러스가 감소된 수준의 병원성을 갖도록 하는 다양한 돌연변이를 확인하였다. 병원성의 수준은 감소될 수 있으며, 이에 따라 바이러스가 발육란에 투여되는 경우에 배아에 대해 병원성이 아니면서 복제될 수 있다. 이러한 바이러스는 난내 백신접종에 적합할 수 있고, 이는 발육란에서의 다수회의 계대배양 후 생산되는 약독화된 IBV 백신에 비해 상당한 이점이다.
따라서 제1 측면에서, 본 발명은 비-구조 단백질 nsp-3에서의 돌연변이 및/또는 보조 단백질 3a 및/또는 3b의 결실을 포함하는 생 약독화된 코로나바이러스를 제공한다.
nsp-3에서의 돌연변이는 아데노신 디포스페이트-리보스-1'-포스파타제 (ADRP) 영역 내에 있을 수 있다.
변형된 nsp-3 유전자는
a) 서열식별번호: 6의 위치 373에서의 Asn (N) → Ala (A); 및
b) 서열식별번호: 6의 위치 379에서의 Gly (G) → Ser (S)
의 목록으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변형된 nsp-3 유전자는 서열식별번호: 6의 위치 373에서의 아미노산 돌연변이 Asn (N) → Ala (A)를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변형된 nsp-3 유전자는 서열식별번호: 6의 위치 379에서의 아미노산 돌연변이 Gly (G) → Ser (S)을 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
변형된 nsp-3 유전자는
a) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1116에서의 A → G 및 뉴클레오티드 위치 1117에서의 A → C; 및
b) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1138에서의 G → A
의 목록으로부터 선택된 1개 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
생 약독화된 코로나바이러스는 서열식별번호: 2로서 제시된 서열의 뉴클레오티드 위치 37 내지 384의 결실을 포함할 수 있다.
코로나바이러스는 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)일 수 있다.
코로나바이러스는 IBV M41일 수 있다.
코로나바이러스는 적어도 그 중 일부가 M41 이외의 IBV 혈청형으로부터의 것인 S 단백질을 포함할 수 있다.
예를 들어, S1 서브유닛 또는 전체 S 단백질은 M41 이외의 IBV 혈청형으로부터의 것일 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스는 야생형 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 가질 수 있으며, 이에 따라 바이러스가 발육란에 투여되는 경우에 배아에 대해 병원성이 아니면서 복제될 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면과 관련하여 정의된 바와 같은 변형된 nsp-3 유전자를 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 변형된 nsp-3 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 변형된 nsp-3 유전자 또는 보조 단백질 3a 및/또는 3b의 결실을 갖는 변형된 유전자 3을 포함하는 플라스미드를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 하기 단계:
(i) 본 발명의 제4 측면에 따른 플라스미드를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 단계;
(ii) 숙주 세포를 nsp-3 유전자 및/또는 유전자 3을 갖는 코로나바이러스 균주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 감염시키는 단계;
(iii) 상동 재조합이 플라스미드 내의 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈 내의 상응하는 서열 사이에서 발생하도록 하여 변형된 유전자를 생산하는 단계; 및
(iv) 변형된 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 선택하는 단계
를 포함하는, 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
재조합 바이러스는 백시니아 바이러스일 수 있다.
방법은
(v) 단계 (iv)로부터의 재조합 바이러스로부터의 DNA로부터 변형된 유전자를 포함하는 재조합 코로나바이러스를 회수하는 단계
를 또한 포함할 수 있다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스를 생산할 수 있는 세포를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제공한다.
제8 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 제7 측면에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 측면은
ㆍ 대상체에서 질환을 치료하고/거나 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 제7 측면에 따른 백신
ㆍ 대상체에서 질환을 치료하고/거나 예방하기 위한 백신의 제조에 있어서의 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스의 용도
를 제공한다.
질환은 감염성 기관지염 (IB)일 수 있다.
백신의 투여 방법은 점안 투여, 비강내 투여, 음용수 투여, 부화후 주입 및 난내 주입으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
백신접종은 난내 백신접종에 의한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제6 측면에 따른 세포를 본 발명의 제1 측면에 따른 코로나바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 제7 측면에 따른 백신을 생산하는 방법을 제공한다.
도 1 - rIBV M41K-S-ADRP를 생산하는 데 사용되는 플라스미드.
도 2 - rIBV M41K-A-ADRP를 생산하는 데 사용되는 플라스미드.
도 3 - rIBV M41K-del3ab를 생산하는 데 사용되는 플라스미드.
도 4 - M41-K와 비교하여 rIBV M41K-S-ADRP, rIBV M41K-A-ADRP 또는 rIBV M41K-del3ab로 감염된 조류에서의 a) 수포음; b) 복합 호흡기 증상 (천명 및 수포음); c) 스니킹(Snicking) 및 d) 섬모 활동 (모든 막대 차트는 좌측에서 우측으로 모의, rIBV M41K-A-ADRP, rIBV M41K-S-ADRP, rIBV M41K-del3ab, M41-K로서 제시됨).
도 5 - 감염후 제4일의 임상 징후, 바이러스 검출 및 단리의 개요.
도 6 - 감염후 제6일의 임상 징후, 바이러스 검출 및 단리의 개요.
도 7 - CK 세포 상에서의 야생형 M41-K6 및 M41-CK EP4와 비교한 돌연변이체 M41K-S-ADRP 4, M41K-S-ADRP 2 (S-ADRP 돌연변이의 복제물) 및 M41K-A-ADRP의 성장 동역학
도 8 - CK 세포 상에서의 야생형 M41-CK 및 M41-K와 비교한 돌연변이체 M41K-del3ab 10 및 M41K-del3ab 1의 성장 동역학
본 발명은 상응하는 야생형 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 갖는 돌연변이체 코로나바이러스를 제공한다.
코로나바이러스
감마코로나바이러스는 코로나비리다에 과에 속하는 동물 바이러스의 속이다. 코로나바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA 게놈 및 나선 대칭을 갖는 외피보유 바이러스이다.
코로나바이러스의 게놈 크기는 임의의 공지된 RNA 바이러스에 대해 가장 긴 크기인 대략 27 내지 32 킬로염기의 범위이다.
코로나바이러스는 주로 포유동물 및 조류의 상기도 또는 위장관을 감염시킨다. 현재 공지된 5 내지 6종의 상이한 코로나바이러스 균주가 인간을 감염시킨다. 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)을 유발하는 가장 널리 알려진 인간 코로나바이러스, SARS-CoV는 이것이 상기도 및 하기도 감염 둘 다를 유발하고 또한 위장염을 유발할 수 있기 때문에, 특유한 발병기전을 갖는다. 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)는 또한 인간에서 하기도 감염을 유발한다. 코로나바이러스는 성인 인간에서 모든 감기의 상당한 백분율을 유발하는 것으로 여겨진다.
코로나바이러스는 또한 가축 동물 및 가축용 애완동물에서 다양한 질환을 유발하고, 그 중 일부는 중증일 수 있고 농업에 대해 위협이 된다. 가축 동물의 경제적으로 중요한 코로나바이러스는 주로 닭에서 호흡기 질환을 유발하고 전세계적으로 가금업에 심각한 영향을 미치는 감염성 기관지염 바이러스 (IBV); 그 둘 다 어린 동물에서 설사를 일으키는 돼지 코로나바이러스 (전염성 위장염, TGE) 및 소 코로나바이러스를 포함한다. 고양이 코로나바이러스는 2가지 형태를 갖고, 고양이 장 코로나바이러스는 부차적 임상 유의성의 병원체이지만, 이러한 바이러스의 자연 돌연변이는 높은 사망률과 연관된 질환인 고양이 감염성 복막염 (FIP)을 일으킬 수 있다.
또한 경도 위장 질환을 유발하는 것 및 호흡기 질환을 유발하는 것으로 밝혀진 것인 2가지 유형의 개 코로나바이러스 (CCoV)가 존재한다. 마우스 간염 바이러스 (MHV)는 특히 실험실 마우스의 콜로니 중에서, 높은 사망률을 갖는 유행성 뮤린 질병을 유발하는 코로나바이러스이다.
코로나바이러스는 하기 제시된 바와 같이 4개의 군으로 분류된다.
알파
ㆍ 개 코로나바이러스 (CCoV)
ㆍ 고양이 코로나바이러스 (FeCoV)
ㆍ 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E)
ㆍ 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)
ㆍ 전염성 위장염 바이러스 (TGEV)
ㆍ 인간 코로나바이러스 NL63 (NL 또는 뉴헤이븐)
베타
ㆍ 소 코로나바이러스 (BCoV)
ㆍ 개 호흡기 코로나바이러스 (CRCoV) - 동남아시아 및 미크로네시아에서 흔함
ㆍ 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43)
ㆍ 마우스 간염 바이러스 (MHV)
ㆍ 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스 (HEV)
ㆍ 래트 코로나바이러스 (RCV). 래트 코로나바이러스는 2008년 3월/4월 현재, 이것이 고유 및 야생 설치류 콜로니 중에서 발견된 호주 동부에 매우 널리 퍼져있다.
ㆍ (아직까지 일반 명칭이 없음) (HCoV-HKU1)
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV)
ㆍ 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)
감마
ㆍ 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)
ㆍ 칠면조 코로나바이러스 (블루콤병 바이러스)
ㆍ 꿩 코로나바이러스
ㆍ 호로새 코로나바이러스
델타
ㆍ 직박구리 코로나바이러스 (BuCoV)
ㆍ 개똥지빠귀 코로나바이러스 (ThCoV)
ㆍ 부리새 코로나바이러스 (MuCoV)
ㆍ 돼지 코로나바이러스 (PorCov) HKU15
본 발명의 재조합 코로나바이러스는 알파코로나바이러스 예컨대 TGEV; 베타코로나바이러스 예컨대 MHV; 또는 감마코로나바이러스 예컨대 IBV로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "로부터 유래된"은 재조합 코로나바이러스가 야생형 코로나바이러스와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 코로나바이러스는 야생형 코로나바이러스 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다.
IBV
조류 감염성 기관지염 (IB)은 상당한 경제적 손실을 유발하는 닭의 급성 및 고전염성 호흡기 질환이다. 질환은 가쁜호흡, 기침, 재채기, 기관 수포음, 및 비루를 포함하는 호흡기 징후를 특징으로 한다. 영계에서, 중증 호흡 곤란이 발생할 수 있다. 산란계에서, 호흡 곤란, 신염, 계란 생산의 감소, 및 내부 계란 품질 및 계란 껍질 품질의 손실은 통상적이다.
브로일러에서, 기침 및 래틀링(rattling)은 통상적인 임상 징후이고, 구내의 모든 조류에 급속하게 확산된다. 이환율은 백신접종되지 않은 계군(flock)에서 100%이다. 사망률은 연령, 바이러스 균주, 및 속발성 감염에 따라 달라지지만 백신접종되지 않은 계군에서 최대 60%일 수 있다.
가장 먼저 확인된 IBV 혈청형은 매사추세츠(Massachusetts)였지만, 미국에서 최초로 확인된 매사추세츠 유형에 더하여, 아칸소(Arkansas) 및 델라웨어(Delaware)를 포함하는 여러 혈청형이 현재 유행하고 있다.
IBV 균주 보우데트(Beaudette)는 병아리 배아에서의 적어도 150회의 계대배양 후 유래되었다. IBV 보우데트는 부화된 닭에 대해 더 이상 병원성이 아니지만 배아를 급속하게 사망시킨다.
H120은 발육란에서의 대략 120회의 계대배양에 의해 약독화된, 상업용 생 약독화된 IBV 매사추세츠 혈청형 백신 균주이다. H52는 또 다른 매사추세츠 백신이고, H120의 발생 동안 보다 초기 및 약간 더 병원성인 계대배양 바이러스 (52회 계대배양)를 나타낸다. H120에 기초하는 백신이 통상적으로 사용된다.
IB QX는 IBV의 병독성 영역 분리주이다. 이는 1990년대 중반에 중국의 칭다오 지역에서 질환의 발생 후 최초로 단리되었기 때문에, 때때로 "차이니즈 QX"로 공지된다. 그 때 이후로 바이러스는 유럽으로 퍼져 나갔다. 2004년으로부터, 중증 계란 생산 문제가 서유럽의 일부, 우세하게는 네덜란드에서 매우 유사한 바이러스로 확인되었을 뿐만 아니라, 독일, 프랑스, 벨기에, 덴마크 및 영국으로부터 보고되었다.
네덜란드 케이스로부터 단리된 바이러스는 데벤터르 소재의 네덜란드 연구소에 의해 D388로 칭해지는 새로운 균주로서 확인되었다. 차이니즈 관련주는 바이러스가 차이니즈 QX 바이러스와 99% 유사하다는 것을 나타내는 추가의 시험으로부터 획득되었다. 생 약독화된 QX-유사 IBV 백신 균주가 현재 개발되어 있다.
IBV는 세포 세포질에서 복제되는 외피보유 바이러스이고 비-절편화, 단일-가닥, 양성 센스 RNA 게놈을 함유한다. IBV는 27.6 kb RNA 게놈을 갖고 모든 코로나바이러스와 같이 4종의 구조 단백질; 스파이크 당단백질 (S), 소형 막 단백질 (E), 내재성 막 단백질 (M) 및 게놈 RNA와 상호작용하는 뉴클레오캡시드 단백질 (N)을 함유한다.
게놈은 하기 방식으로 조직화된다: 5'UTR - 폴리머라제 (레플리카제) 유전자 - 구조 단백질 유전자 (S-E-M-N) - UTR 3'; 여기서 UTR은 비번역 영역 (IBV에서 각각의 ∼ 500개의 뉴클레오티드)이다.
지질 외피는 3종의 막 단백질을 함유한다: S, M 및 E. IBV S 단백질은 내형질 세망에서 올리고머화되고 막횡단 도메인을 통해 비리온 막에 삽입된 동종삼량체로 조립되고 M 단백질과 비-공유 상호작용을 통해 회합되는 유형 I 당단백질이다. 코로나바이러스 입자 내로의 혼입 후, S 단백질은 표적 세포 수용체에 대한 결합 및 바이러스와 세포 막의 융합을 담당한다. S 당단백질은 4개의 도메인: 합성 동안 절단되는 신호 서열; 비리온 입자의 외부에 존재하는 엑토도메인; S 단백질을 비리온 입자의 지질 이중층 내로 고정시키는 것을 담당하는 막횡단 영역; 및 세포질 꼬리로 이루어진다.
본 발명의 재조합 코로나바이러스는 IBV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 IBV는 IBV 보우데트, H120, H52, IB QX, D388 또는 M41일 수 있다.
IBV는 IBV M41일 수 있다. M41은 1941년에 미국에서 단리된 원형 매사추세츠 혈청형이다. 이는 전세계적으로 많은 실험실에서 병원성 실험실 균주로서 사용되는 분리주이고 ATCC (VR-21TM)로부터 입수될 수 있다. 약독화된 변이체는 또한 여러 백신 생산자에 의해 관련 현장에서 문제를 유발하는 매사추세츠 혈청형에 대한 IBV 백신으로서 사용된다. 본 발명자들은 다년간 이 바이러스에 대해 연구하였고, 완전 바이러스 게놈의 서열이 입수가능하기 때문에 이 균주를 사용하는 것을 선택하였다. 본 발명자들에 의해 사용된 M41 분리주, M41-CK는 1차 병아리 신장 (CK) 세포에서 성장하도록 적합화되었고 따라서 완전 게놈의 cDNA로부터 감염성 바이러스로서 회수하기 쉬운 것으로 간주되었다. 이는 병원성 IBV를 나타내고 따라서 병원성의 손실 또는 감소를 유발하는 돌연변이에 대해 분석될 수 있다.
IBV M41-CK의 게놈 서열은 서열식별번호: 1로서 제공된다.
서열식별번호: 1 IBV M41-CK 서열
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보조 단백질
모든 코로나바이러스는 시험관내 복제에 요구되지 않지만, 발병기전에서 역할을 할 수 있는 알려지지 않은 기능의 보조 단백질 유전자 세트를 코딩한다. IBV는 둘 다 각각 2종의 보조 단백질 3a, 3b 및 5a, 5b를 발현하는 2종의 보조 유전자, 유전자 3 및 5를 코딩한다.
IBV MK41의 유전자 3에 대한 뉴클레오티드 서열 및 보조 단백질 3a 및 3b에 대한 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 2-4로서 제공된다.
서열식별번호: 2 (유전자 3 뉴클레오티드 서열 - 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 23831 내지 24539)
Figure pct00010
서열식별번호: 3 (보조 단백질 3a 아미노산 서열)
Figure pct00011
서열식별번호: 4 (보조 단백질 3b 아미노산 서열)
Figure pct00012
레플리카제
구조 및 보조 유전자에 더하여, 코로나바이러스 게놈의 2/3는 (게놈의 5' 말단에서) 2종의 폴리단백질, pp1a 및 pp1ab로서 발현되는 레플리카제 유전자를 포함하며, 여기서 pp1ab는 -1 리보솜 이동 메카니즘의 결과로서의 pp1a의 연장 생성물이다. 2종의 폴리단백질은 2가지 유형의 바이러스-코딩된 프로테이나제에 의해 절단되어 통상적으로 16종의 비-구조 단백질 (nsp1-16)을 생성하고; IBV는 nsp1이 결여되어 nsp2-16을 코딩한다.
따라서 IBV의 유전자 1은 RNA 복제 및 전사와 연관된 15종 (다른 코로나바이러스에서 16종)의 비-구조 단백질 (nsp2-16)을 코딩한다.
용어 '레플리카제 단백질'은 본원에서 pp1a 및 pp1ab 폴리단백질 또는 개별 nsp 서브유닛을 지칭하는 데 사용된다.
용어 '레플리카제 유전자'는 본원에서 레플리카제 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 지칭하는 데 사용된다.
코로나바이러스 nsp 단백질의 기능의 개요가 표 1에 제공된다.
표 1
Figure pct00013
Nsp-3은 유비퀴틴-유사 도메인, 산성 도메인, 파파인-유사 프로테아제 (PL pro) 도메인, 다중 막횡단 도메인, 및 거대 도메인을 포함하는 수많은 별개의 도메인으로 이루어진 대형 단백질이고, 이는 무질서 링커에 의해 분리된다. 거대 도메인은 nsp-3의 N 말단에 위치한 나선에 의해 플랭킹된 중앙 시트를 갖는 구상 도메인이다. 이는 ADP-리보스-1-포스파타제 (ADRP) 활성을 함유하고 다양한 형태의 ADP-리보스에 결합한다. 이 도메인은 코로나바이러스에서 고도로 보존되지만 단지 몇몇의 다른 바이러스 과에서만 발견된다.
IBV M41의 nsp-3에 대한 뉴클레오티드 및 단백질 서열은 각각 서열식별번호: 5 및 6으로서 제공된다.
서열식별번호: 5 (nsp-3 뉴클레오티드 서열 - 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 2548-7329)
Figure pct00014
Figure pct00015
서열식별번호: 6 (nsp-3 아미노산 서열)
Figure pct00016
감소된 병원성
본 발명의 생 약독화된 코로나바이러스는 상응하는 야생형 코로나바이러스와 비교하여 바이러스가 감소된 병원성을 갖도록 하는 적어도 1종의 돌연변이를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약독화"는 상기 감소된 병원성을 나타내는 바이러스를 지칭하고 비-병독성으로 분류될 수 있다. 생 약독화된 바이러스는 복제가 약화된 바이러스이면서 여전히 면역 반응을 자극시키고 면역을 일으킬 수 있지만 실제 질병을 유발하지는 않는다.
용어 "병원성"은 본원에서 그의 일반적인 의미에 따라 대상체에서 질환을 유발하는 바이러스의 잠재성을 지칭하는 데 사용된다. 전형적으로 코로나바이러스의 병원성은 질환 연관 증상, 예를 들어 천명, 스니킹 및 기관 섬모 활동의 감소를 검정함으로써 결정된다.
용어 "감소된 병원성"은 코로나바이러스의 병원성의 수준이 상응하는, 야생형 코로나바이러스와 비교하여 감소되거나, 경감되거나 또는 저하된 것을 기재하는 데 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 코로나바이러스는 이것이 유래된 모 M41-CK 바이러스 또는 대조군 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 갖는다. 대조군 코로나바이러스는 기지의 병원성을 갖는 코로나바이러스일 수 있다.
코로나바이러스의 병원성은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 전형적으로, 병원성은 바이러스로 챌린지된 대상체, 예를 들어 닭에서 임상 증상을 검정함으로써 평가된다.
예시로서, 닭은 8-24일령에 비강 또는 안구 접종에 의해 챌린지될 수 있다. IBV 감염과 연관된 임상 증상은 주사후 제3일-제10일에 평가될 수 있다. 코로나바이러스, 예를 들어 IBV의 병원성을 결정하기 위해 통상적으로 평가되는 임상 증상은 가쁜호흡, 기침, 천명, 스니킹, 우울증, 헝클어진 깃털 및 기관 섬모 활동의 손실을 포함한다.
본 발명의 약독화된 코로나바이러스는 상응하는 야생형 코로나바이러스와 비교하여 감소된 수준의 임상 증상을 유발할 수 있다.
예를 들어 약독화된 코로나바이러스는 야생형 바이러스에 의해 유발되는 스니킹의 수의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만인 조류당 분당 스니킹의 수를 유발할 수 있다.
본 발명에 따른 약독화된 코로나바이러스는 야생형 바이러스로 감염된 계군에서의 조류의 수의 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만으로 천명을 유발할 수 있다.
본 발명에 따른 약독화된 코로나바이러스는 비감염된 조류에서의 기관 섬모 활동의 수준의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%인 기관 섬모 활동을 일으킬 수 있다.
본 발명에 따른 약독화된 코로나바이러스는 표 2에 정의된 바와 같은 임상 증상을 야생형 코로나바이러스보다 더 낮은 수준으로 유발할 수 있다.
표 2 임상 징후에 기초한 IBV 중증도 한계:
Figure pct00017
본 발명의 약독화된 코로나바이러스는 난내에서 비-병원성 수준으로 복제될 수 있다.
닭 배아에게 난내 투여되는 백신을 개발하는 동안에, 2가지 쟁점: 백신에 대한 모체 항체의 효과 및 배아에 대한 백신의 효과에 주목해야 한다. 모체 항체는 능동 면역화를 방해하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 온화한 균주를 사용하는 백신은 모체 항체를 갖는 브로일러 닭에게 투여되는 경우에 이들 균주가 모체 항체 풀에 의해 중화되기 때문에 보호 항체 수준을 유도하지 않는다.
따라서 바이러스 입자는 이것이 바이러스에 대한 모체-유래 항체에 의해 중화되지 않는다는 것을 보장하기 위해 복제 및 증식에 있어서 충분히 효율적이어야 한다. 모체-유래 항체는 효과적인 항체의 한정 풀이고, 이는 닭이 노화됨에 따라 감소하고, 이러한 방식의 바이러스의 중화는 배아/병아리를 위한 장기간 면역의 확립과 동등하지 않다. 바이러스에 대한 장기간 면역을 발생시키기 위해, 배아 및 부화된 닭은 모체-유래 항체의 효과와 별개의 적절한 보호 면역 반응을 발생시켜야 한다.
난내 백신접종에 유용하기 위해, 바이러스는 또한 이것이 배아에 대해 병원성이도록 하는 수준으로 복제 및 증식되지 않아야 한다.
배아와 관련하여 감소된 병원성은 약독화된 코로나바이러스가 상응하는, 야생형 대조군 코로나바이러스와 비교하여 부화율에서 더 적은 감소를 유발한다는 것을 의미할 수 있다. 따라서 본 발명의 문맥에서 용어 "배아에 대해 병원성이 아니면서"는 대조군 코로나바이러스와 비교하여 "감소된 부화율을 유발하지 않으면서"를 의미할 수 있다.
적합한 약독화된 코로나바이러스는 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어 모체-유래 항체를 갖거나 또는 갖지 않는 배아의 난내 백신접종 후 비교 챌린지 실험이 수행될 수 있다 (즉 여기서 산란계는 IBV에 대해 백신접종되거나 또는 백신접종되지 않았음).
약독화된 코로나바이러스가 너무 높은 수준으로 증식되는 경우에, 배아는 부화되지 않을 것이거나 또는 부화 후 생존하지 않을 것이다 (즉 바이러스는 배아에 대해 병원성임). 배아에 대해 병원성인 바이러스는 배아를 사멸시킬 수 있다.
약독화된 코로나바이러스가 바이러스 복제 및 증식에서 너무 큰 감소를 입증한 경우에, 바이러스는 모체-유래 항체에 의해 중화될 것이다. 따라서, IBV를 사용한 병아리의 후속 챌린지는 바이러스에 대한 효과적인 면역을 발생시키는 데 실패하였기 때문에 챌린지된 병아리에서 임상 증상 (예를 들어 천명, 스니킹, 섬모 활동의 손실)의 발생 및 질환의 발병을 일으킬 것이다.
변이체
본원에 사용된 용어 '변이체'는 '돌연변이체'와 동의어이고 상응하는 야생형 서열과 비교하여 상이한 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
변이체/돌연변이체 서열은 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 인공적으로 (예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해) 생성될 수 있다. 돌연변이체는 야생형 서열의 상응하는 부분과 적어도 70, 80, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 돌연변이체는 야생형 서열의 상응하는 부분에 비해 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 돌연변이(들)를 가질 수 있다.
용어 "야생형"은 각각 천연 유전자 또는 단백질 (즉 바이러스 유전자 또는 단백질)과 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 갖는 유전자 또는 단백질을 의미하는 데 사용된다.
동일성 비교는 육안으로, 또는 보다 통상적으로, 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 % 동일성을 계산할 수 있다. 이러한 정렬을 수행하는 데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 Bestfit 패키지 (미국 위스콘신 대학교; 문헌 [Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387])이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지 (문헌 [Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18] 참조), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) 및 비교 도구의 GENEWORKS 스위트, 클러스탈엑스(ClustalX) (문헌 [Larkin et al. (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948] 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA 둘 다는 오프라인 및 온라인 검색에 이용가능하다 (문헌 [Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, 일부 적용의 경우, GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 서열로 칭해지는 새로운 도구가 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는 데 이용가능하다 (문헌 [FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8] 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).
서열은 침묵 변화를 생성하고 기능적 등가 분자를 생성하는, 아미노산 잔기의 1개 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 고의적 아미노산 치환은 활성이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는, 비하전된 극성 머리기를 갖는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 티로신을 포함한다.
보존적 치환은, 예를 들어 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 제2 칼럼의 동일한 블록 내 및 바람직하게는 제3 칼럼의 동일한 라인 내의 아미노산은 서로 치환될 수 있다.
Figure pct00018
문헌 [Ammayappan et al (Arch Virol (2009) 154:495-499)]은 IBV 균주 아칸소 DPI의 약독화의 원인이 되는 서열 변화의 확인을 보고한다. 연구는 발육란에서의 바이러스의 대략 100회의 다수회의 계대배양 후 다양한 IBV 단백질에서 17개의 아미노산 변화를 확인하였다. 약독화된 바이러스 (Ark DPI 101)가 배아에 대해 병원성이 아니면서, 난내에서 바이러스에 대한 모체-유래 항체의 존재 하에 복제될 수 있는지 여부는 조사되지 않았다. 이 바이러스가 전형적 IBV 백신과 유사한 방법론인 SPF 발육란에서의 다수회의 계대배양에 의해 생산된다는 것을 고려하면, 이 바이러스는 배아에 대해 병원성일 가능성이 있다. 바이러스는 또한 암탉이 유사한 혈청형으로 백신접종된 경우에 모체-유래 항체에 감수성일 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스는 비-구조 단백질 nsp-3에서의 돌연변이 및/또는 보조 단백질 3a 및/또는 3b의 결실을 포함하며, 여기서 돌연변이는 바이러스가 야생형 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 갖도록 한다.
nsp-3에서의 돌연변이는 nsp-3의 아데노신 디포스페이트-리보스-1'-포스파타제 (ADRP) 영역에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. nsp-3의 ADRP 영역은 서열식별번호: 6의 잔기 332 내지 491 (예를 들어, 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 994 내지 1473에 의해 코딩됨)을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 따라서, nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 6의 위치 332 내지 491로서 제시된 아미노산과 비교하여 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 6의 위치 332 내지 491, 350 내지 470, 350 내지 450, 350 내지 425, 350 내지 400, 350 내지 380, 360 내지 380 또는 370 내지 380으로서 제시된 아미노산과 비교하여 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 6의 위치 370 내지 380으로서 제시된 아미노산과 비교하여 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
nsp-3에서의 돌연변이는
a) 서열식별번호: 6의 위치 373에서의 Asn (N) → Ala (A); 및
b) 서열식별번호: 6의 위치 379에서의 Gly (G) → Ser (S)
의 목록으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
nsp-3에서의 돌연변이는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
nsp-3에서의 돌연변이는
a) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1116에서의 A → G 및 뉴클레오티드 위치 1117에서의 A → C; 및
b) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1138에서의 G → A
의 목록으로부터 선택된 1개 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치환"은 용어 돌연변이와 동의어이고 확인된 위치에서의 뉴클레오티드가 야생형 뉴클레오티드 서열의 것과 상이하다는 것을 의미한다.
nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 3의 위치 373에서의 아미노산 돌연변이 Asn (N) → Ala (A)를 포함할 수 있다.
nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 3의 위치 379에서의 아미노산 돌연변이 Gly (G) → Ser (S)을 포함할 수 있다.
nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 3의 위치 373에서의 아미노산 돌연변이 Asn (N) → Ala (A) 및 위치 379에서의 Gly (G) → Ser (S)을 포함할 수 있다.
약독화된 코로나바이러스는 또한 뉴클레오티드 수준으로 정의될 수 있다.
예를 들어 본 발명의 약독화된 코로나바이러스의 뉴클레오티드 서열은
a) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1116에서의 A → G 및 뉴클레오티드 위치 1117에서의 A → C; 및
b) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1138에서의 G → A
의 목록으로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1116에서의 돌연변이 A → G 및 뉴클레오티드 위치 1117에서의 A → C를 포함할 수 있다.
nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1138에서의 돌연변이 G → A를 포함할 수 있다.
nsp-3에서의 돌연변이는 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1116에서의 돌연변이 A → G, 뉴클레오티드 위치 1117에서의 A → C 및 뉴클레오티드 위치 1138에서의 G → A를 포함할 수 있다.
본 발명의 생 약독화된 코로나바이러스는 보조 단백질 3a 및/또는 3b의 결실을 포함할 수 있다. 이 돌연변이는 유전자 3의 부분 또는 완전 결실에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서 보조 단백질 3a의 전부 또는 일부는 결실된다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면 보조 단백질 3b의 전부 또는 일부는 결실된다. 본 발명의 추가 측면에서 보조 단백질 3a 및 3b 둘 다의 전부 또는 일부는 결실된다. 본 발명의 한 측면에서 보조 단백질 3a는 결실된다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면 보조 단백질 3b는 결실된다. 본 발명의 추가 측면에서 보조 단백질 3a 및 3b 둘 다는 결실된다.
보조 단백질 3a 및 3b의 결실은 서열식별번호: 2로서 제시된 유전자 3 서열의 약 뉴클레오티드 위치 37 내지 약 384의 결실을 포함할 수 있다. 보조 단백질 3a 및 3b의 결실은 서열식별번호: 2로서 제시된 유전자 3 서열의 뉴클레오티드 위치 37 내지 384의 결실을 포함할 수 있다.
보조 단백질 3a 및 3b의 결실은 서열식별번호: 1로서 제시된 IBV M41-CK 서열의 약 뉴클레오티드 위치 23867 내지 약 24214의 결실을 포함할 수 있다. 보조 단백질 3a 및 3b의 결실은 서열식별번호: 1로서 제시된 IBV M41-CK 서열의 뉴클레오티드 위치 23867 내지 24214의 결실을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 상기 열거된 뉴클레오티드 돌연변이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 코로나바이러스는 비-구조 단백질 nsp-3에서의 돌연변이 및 보조 단백질 3a 및/또는 3b의 결실을 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 코로나바이러스는 nsp-3의 ADRP 영역에서의 돌연변이 및 보조 단백질 3a 및 3b의 결실을 포함할 수 있다.
예를 들어 본 발명의 약독화된 코로나바이러스의 뉴클레오티드 서열은 하기 돌연변이를 포함할 수 있다:
a) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1116에서의 A → G 및 뉴클레오티드 위치 1117에서의 A → C; 및/또는
b) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1138에서의 G → A; 및
c) 서열식별번호: 2로서 제시된 유전자 3 서열의 뉴클레오티드 위치 37 내지 384의 결실.
뉴클레오티드 서열은 문헌 [Ammayappan et al. (상기와 같음)]에 의해 보고된 C12008T 치환에 상응하는 치환을 포함하지 않을 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 천연, 합성 또는 재조합일 수 있다. 이는 이중 또는 단일 가닥일 수 있고, 이는 DNA 또는 RNA 또는 그의 조합일 수 있다. 이는, 예를 들어, cDNA, PCR 산물, 게놈 서열 또는 mRNA일 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 선택된 숙주/숙주 세포에서의 생산을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
이는 단리될 수 있거나, 또는 플라스미드, 바이러스 또는 숙주 세포의 일부일 수 있다.
플라스미드
플라스미드는 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있는, 염색체 DNA와 별개의 염색체외 DNA 분자이다. 이들은 통상적으로 원형 및 이중-가닥이다.
플라스미드, 또는 벡터 (이들이 때때로 공지된 바와 같음)는 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 박테리아 숙주 세포는 특정한 단백질을 발현시키기 위해, 그 단백질을 코딩할 수 있는 플라스미드로 형질감염될 수 있다. 용어는 또한 DNA의 보다 긴 부분을 수용할 수 있는 효모 인공 염색체 및 박테리아 인공 염색체를 포함한다.
본 발명의 플라스미드는 약독화된 코로나바이러스의 정의된 영역을 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이는 또한 1개 이상의 추가의 코로나바이러스 뉴클레오티드 서열(들), 또는 1개 이상의 다른 코로나바이러스 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열(들) 예컨대 S 유전자를 포함할 수 있다.
플라스미드는 또한 저항성 마커, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 구아닌 크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 (gpt)를 포함할 수 있고, 이는 크산틴 및 하이포크산틴의 존재 하에 미코페놀산 (MPA)에 대한 저항성을 부여하고 백시니아 바이러스 P7.5 초기/후기 프로모터에 의해 제어된다.
재조합 백시니아 바이러스
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 변이체 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 (rVV)에 관한 것이다.
재조합 백시니아 바이러스 (rVV)는 백시니아-바이러스 기반 역 유전학 시스템을 사용하여 만들어질 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한
(i) 이전 섹션에 기재된 바와 같은 플라스미드를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 단계;
(ii) 숙주 세포를 nsp-3 유전자 또는 유전자 3을 갖는 코로나바이러스 균주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 감염시키는 단계;
(iii) 상동 재조합이 플라스미드 내의 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈 내의 상응하는 서열 사이에서 발생하도록 하여 변형된 유전자를 생산하는 단계;
(iv) 변형된 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 선택하는 단계
에 의해 바이러스 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
용어 '변형된 유전자'는 본 발명의 제1 측면과 관련하여 기재된 바와 같은 돌연변이를 포함하는 nsp-3 유전자 또는 유전자 3을 지칭한다. 구체적으로, 용어는 야생형 유전자로부터 유래되지만 이것이 본원에 정의된 바와 같은 변이체 단백질을 코딩하도록 하거나, 또는 유전자 3의 경우, 단백질 3a 및 3b의 일부 또는 전부를 코딩하지 않도록 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 지칭한다.
재조합은 변형된 유전자의 전부 또는 일부를 수반할 수 있다. 재조합은 아미노산 돌연변이를 코딩하거나 또는 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 치환을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 수반할 수 있다.
변형된 단백질이 플라스미드에 의해 제공되는 뉴클레오티드 서열의 삽입을 통해 형성되도록, 코로나바이러스 균주의 게놈은 플라스미드에 의해 제공되는 부분에 상응하는 단백질의 일부가 결여될 수 있다.
재조합 바이러스는 그의 게놈과 플라스미드 사이의 상동 재조합을 가능하게 하는 데 적합한 것이다. 백시니아 바이러스는 상동 재조합이 백시니아 바이러스 게놈에 대한 서열을 삽입하고 결실시키는 데 상용적으로 사용되기 때문에 특히 적합하다.
상기 방법은
(v) 단계 (iv)로부터의 재조합 바이러스로부터의 DNA로부터 변형된 유전자를 포함하는 재조합 코로나바이러스를 회수하는 단계
를 임의로 포함한다.
재조합 코로나바이러스, 예컨대 재조합 IBV를 회수하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (문헌 [Britton et al. (2005)] 페이지 24; 및 PCT/GB2010/001293 참조).
예를 들어, 단계 (iv)로부터의 재조합 바이러스로부터의 DNA는 플라스미드 내로 삽입되고 세포질 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 세포는, 예를 들어 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 계두 바이러스로 사전-감염될 수 있다. 이어서, 재조합 코로나바이러스는, 예를 들어, 성장 배지로부터 단리될 수 있다.
플라스미드가 백시니아 바이러스 게놈 내로 삽입된 경우에, 불안정한 중간체가 형성된다. 플라스미드를 포함하는 재조합체는 예를 들어 플라스미드 상의 저항성 마커를 사용하여 선택될 수 있다.
이어서, 양성 재조합체는, 예를 들어, PCR 및 서열분석에 의해 변형된 유전자를 함유하는 것으로 확인될 수 있다.
변형된 유전자를 포함하는 재조합 바이러스의 큰 스톡 (예를 들어 재조합 백시니아 바이러스 (rVV)는 성장될 수 있고 DNA는 단계 (v)를 수행하기 위해 추출될 수 있음).
적합한 역 유전학 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Casais et al (2001) J. Virol 75:12359-12369; Casais et al (2003) J. Virol. 77:9084-9089; Britton et al (2005) J. Virological Methods 123:203-211; Armesto et al (2008) Methods in Molecular Biology 454:255-273).
세포
코로나바이러스는 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다.
코로나바이러스 입자는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 상청액으로부터 수거될 수 있고, 임의로 정제될 수 있다.
세포는 코로나바이러스 입자를 생산하는 데 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 코로나바이러스를 생산하는 방법을 제공한다:
(i) 세포를 본 발명에 따른 코로나바이러스로 감염시키는 단계;
(ii) 바이러스가 세포에서 복제되도록 하는 단계; 및
(iii) 자손 바이러스를 수거하는 단계.
본 발명은 또한 역 유전학 시스템을 사용하여 본 발명에 따른 코로나바이러스를 생산할 수 있는 세포를 제공한다. 예를 들어, 세포는 본 발명의 변형된 유전자를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 게놈을 포함할 수 있다.
세포는 돌연변이(들)를 함유하는 재조합 재조합 바이러스 (예를 들어 백시니아 바이러스)를 생산할 수 있다.
대안적으로 세포는 역 유전학 시스템에 의해 재조합 코로나바이러스를 생산할 수 있다. 세포는 재조합 바이러스 입자를 구출하기 위해 T7 폴리머라제를 발현하거나 또는 이를 발현하도록 유도될 수 있다.
백신
코로나바이러스는 백신을 생산하는 데 사용될 수 있다. 백신은 본 발명의 코로나바이러스의 생 약독화된 형태일 수 있고 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은, 본 발명에 사용하는 데 적합한 "제약상 허용되는 담체"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 담체는, 비제한적으로, 물, 염수, 완충 염수, 포스페이트 완충제, 알콜/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 다른 통상적으로 사용되는 희석제 및 부형제는 통상적인 기술에 따라 첨가될 수 있다. 이러한 담체는 에탄올, 폴리올, 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르를 포함할 수 있다. 완충제 및 pH 조정제가 또한 사용될 수 있다. 완충제는, 비제한적으로, 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 대표적인 완충제는, 비제한적으로, 유기 산 염, 예컨대 하기의 염: 시트르산, 예를 들어, 시트레이트, 아스코르브산, 글루콘산, 히스티딘-Hel, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산, 트리스, 트리메탄아민 히드로클로라이드, 또는 포스페이트 완충제를 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 수크로스, 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥내 담체는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기초한 것 등을 포함할 수 있다. 보존제 및 다른 첨가제 예컨대, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA), 불활성 기체 등은 또한 제약 담체로 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적절한 pH 등장성, 안정성 및 다른 통상적인 특징을 갖는, 상기 기재된 성분으로부터의 이들 제약상 허용되는 조성물의 제조는 관련 기술분야 범위 내에 있다. 예를 들어, 텍스트 예컨대 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, pub!., 2000; 및 The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe et al., APhA Publications, 2003]을 참조한다.
본 발명의 백신은 대상체 또는 환자에게 투여되는 경우에 유익하거나 또는 목적하는 결과를 가져오기에 충분한 활성 성분, 예를 들어, 본 발명에 따른 작용제의 양을 지칭하는 "치료 유효량"으로 투여될 것이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 치료 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, "치료 유효량"은 유익하거나 또는 목적하는 결과를 가져오기에 충분한, 감염성 기관지염 상태와 연관된 하나 이상의 파라미터에서의 객관적으로 측정되는 변화를 생성하는 것이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물, 또는 제약 조성물의 유효량은 감염성 기관지염의 발생을 감소시키기에 충분한 양이다. 본원에 사용된 용어 "치료"는 질환, 상태 또는 장애를 위한 치료의 전체 스펙트럼을 포괄한다. 본 발명의 "치료"제는 위험이 있는 것으로 확인될 수 있는 동물을 표적화하도록 설계된 절차를 포함하는 것 (약리유전학)을 포함하는, 예방적 또는 방지적인 방식으로; 또는 사실상 호전적 또는 치유적인 방식으로 작용할 수 있거나; 또는 치료될 질환 또는 장애의 적어도 1종의 증상의 진행의 속도 및 정도를 저속화시키는 작용을 할 수 있다.
본 발명은 또한 세포, 예를 들어 Vero 세포를 본 발명의 제1 측면과 관련하여 정의된 바와 같은 변형된 단백질을 포함하는 바이러스 입자로 감염시키는 단계를 포함하는, 이러한 백신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
백신접종 방법
본 발명의 코로나바이러스는 질환을 치료하고/거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
"치료하다"는 질환과 연관된 적어도 1종의 증상을 경감, 감소 또는 개선시키고/거나 질환의 진행을 저속화, 감소 또는 차단시키기 위해 기존 질환을 갖는 대상체에게 백신을 투여하는 것을 의미한다.
"예방하다"는 질환의 원인 (예를 들어 감염)을 방지하거나 또는 손상시키거나 또는 질환과 연관된 적어도 1종의 증상의 발생을 감소시키거나 또는 방지하기 위해 아직 질환에 걸리지 않았고/거나 질환의 어떠한 증상도 나타내지 않는 대상체에게 백신을 투여하는 것을 의미한다.
질환은 코로나바이러스에 의해 유발되는 임의의 질환, 예컨대 인간에서의 호흡기 질환 및/또는 위장염 및 다른 동물에서의 간염, 위장염, 뇌염, 또는 호흡기 질환일 수 있다.
질환은 감염성 기관지염 (IB); 돼지 유행성 설사; 전염성 위장염; 마우스 간염 바이러스; 돼지 혈구응집성 뇌척수염; 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS); 또는 블루콤병일 수 있다.
질환은 감염성 기관지염일 수 있다.
백신은, 예를 들어 점안 또는 비강내 투여에 의해 부화된 병아리 또는 닭에게 투여될 수 있다. 비록 정확하지만, 이들 방법은 예를 들어 큰 브로일러 계군의 경우 고비용일 수 있다. 대안은 음용수에의 분무 접종 또는 투여를 포함하지만, 이러한 방법을 사용하여 균일한 백신 적용을 보장하는 것은 어려울 수 있다.
백신은 그의 투여에 적합한 형태, 예컨대 안내 사용을 위한 점안기로 제공될 수 있다.
백신은 난내 접종, 예를 들어 발육란의 주입에 의해 투여될 수 있다. 난내 백신접종은 이것이 초기 단계에 질환에 대한 저항성을 제공한다는 이점을 갖는다. 이는 또한 음용수를 통한 분무 접종 및 투여와 달리 대상체당 균일한 용량의 투여를 용이하게 한다.
백신은 요막액, 난황낭, 양막, 기실 또는 배아를 포함하는 난의 임의의 적합한 구획에 투여될 수 있다. 이는 난각막 (기실) 및 융모요막 아래에 투여될 수 있다.
통상적으로 백신은 배아 발생의 후기 단계 동안, 일반적으로 인큐베이션 기간의 마지막 사분기 동안, 예컨대 부화 3-4일 전에 발육란 내로 주입된다. 닭에서, 백신은 21일 인큐베이션 기간 중 제15일-제19일 사이에, 예를 들어 제17일 또는 제18일에 투여될 수 있다.
공정은 로봇 주입 공정, 예컨대 WO 2004/078203에 기재된 것을 사용하여 자동화될 수 있다.
백신은 1종 이상의 다른 백신, 예를 들어, 다른 질환, 예컨대 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)를 위한 백신과 함께 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 백신을 1종 이상의 다른 백신(들)과 함께 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 개별, 순차적 또는 동시 투여를 위한, 본 발명에 따른 백신을 1종 이상의 다른 백신(들)과 함께 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 백신 또는 백신 조성물은 인간, 동물 또는 조류 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 병아리, 닭 또는 마우스 (예컨대 실험실 마우스, 예를 들어 트랜스제닉 마우스)일 수 있다.
전형적으로, 의사 또는 수의사는 개별 대상체 또는 대상체의 군에 가장 적합할 실제 투여량을 결정할 것이고 이는 특정한 대상체(들)의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
조성물은 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 임의로 포함할 수 있다. 제약 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 제약 실시와 관련하여 선택될 수 있다. 제약 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 (또는 이에 더하여), 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들), 및 바이러스의 전달 또는 면역원성을 보조하거나 또는 증가시킬 수 있는 다른 담체 작용제를 포함할 수 있다.
용어의 정의가 본 명세서 전반에 걸쳐 나타난다. 예시적인 실시양태가 보다 상세하게 기재되기 전에, 본 개시내용은 기재된 특정한 실시양태로 제한되지 않으므로, 당연히 달라질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 범주가 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하는 목적만을 위한 것이고, 제한되는 것으로 의도되지 않는다는 것이 또한 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)]은 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적 사전을 제공한다.
본 개시내용은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지 않고, 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시양태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 각각 임의의 핵산 서열은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재되고; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 기재된다.
값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한치와 하한치 사이에서 하한치의 단위의 1/10까지의 각각의 개재 값이 또한 구체적으로 개시된다는 것이 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 언급된 값 또는 중간 값과 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재 값 사이의 각각의 보다 작은 범위가 본 개시내용 내에 포괄된다. 이들 보다 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 범위 내에 포함되거나 또는 배제될 수 있고, 보다 작은 범위 내에 한계 중 어느 하나, 둘 다가 포함되거나 또는 둘 다 포함되지 않는 각각의 범위가 또한 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로 본 개시내용 내에 포괄된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "효소"에 대한 언급은 복수의 이러한 후보 작용제 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는", "포함하다" 및 "로 구성되다"는 "포괄하는", "포괄하다" 또는 "함유하는", "함유하다"와 동의어이고, 포괄적이거나 또는 개방형이고 추가의, 열거되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는", "포함하다" 및 "로 구성되는"은 또한 용어 "로 이루어진"을 포함한다.
본 발명은 이제 실시예에 의해 추가로 기재될 것이고, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 수행하는 것을 돕는 역할을 하는 것으로 의도되고 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 - M41-CK에 기초한 IBV 역 유전학 시스템의 생성
M41-CK 전장 cDNA를 PCT/GB2010/001293 (본원에 참조로 포함됨)에 이전에 기재된 백시니아 바이러스 역 유전학 시스템에서의 보우데트 cDNA를 M41 컨센서스 서열로부터 유래된 합성 cDNA로 대체함으로써 생산하였다.
IBV 보우데트 균주로부터 유래된 레플리카제 및 IBV M41-CK로부터의 구조 및 보조 유전자 및 3' UTR로 이루어진, 문헌 [Armesto, Cavanagh and Britton (2009). PLoS ONE 4(10): e7384. doi:10.1371/journal.pone.0007384]에 기재된 재조합 백시니아 바이러스 (rVV) rVV-BeauR-Rep-M41 구조물 내의 IBV cDNA를 보우데트 5' UTR-Nsp2-Nsp3 서열을 IBV M41-CK로부터의 상응하는 서열로 대체함으로써 추가로 변형시켰다. 생성된 IBV cDNA는 M41로부터의 5' UTR-Nsp2-Nsp3, 보우데트로부터의 Nsp4-Nsp16 및 M41로부터의 구조 및 보조 유전자 및 3' UTR로 이루어졌다. 이 cDNA를 보우데트 Nsp4-Nsp16 서열의 결실에 의해 추가로 변형시켰다. Nsp4-16이 결여된 생성된 cDNA를 4개의 추가의 단계로 변형시켰으며, 여기서 결실된 Nsp를 순차적으로 M41-CK로부터의 상응하는 서열로 대체하였고, 대체 cDNA는 M41-CK Nsp4-8, Nsp9-12, Nsp12-14 및 마지막으로 Nsp15-16을 나타냈다. 각각의 대체 cDNA는 5' 말단에서 앞서 삽입된 가장 3'인 M41 서열에 상응하는 대략 500개의 뉴클레오티드 및 3' 말단에서 M41 S 유전자 서열에 상응하는 대략 500개의 뉴클레오티드를 함유하였다. 이는 상동 재조합에 의한 M41 cDNA 서열의 삽입 및 인접 M41 레플리카제 유전자 서열의 순차적 부가를 가능하게 하였다. M41-유래 Nsp 서열을 함유하는 합성 cDNA를 상동 재조합에 의해 본 발명자들의 이전에 기재된 일시적 우성 선택 (TDS) 시스템 (PCT/GB2010/001293 참조)을 이용하여 부가하였다.
실시예 2 - 재조합 M41 바이러스의 병원성 결정
3종의 재조합체를 실시예 1에 기재된 역 유전학 시스템을 사용하여 생산하였다. 이들 재조합체를 rIBV M41K-S-ADRP, rIBV M41K-A-ADRP 및 rIBV M41K-del3ab로 명명하였다.
3종의 재조합체는 닭 신장 세포에서 야생형 M41-CK /M41-K와 유사한 방식으로 성장하는 것으로 밝혀졌다 (도 7 및 8).
rIBV M41K-S-ADRP는 nsp-3의 아데노신 디포스페이트-리보스-1'-포스파타제 (ADRP) 영역의 뉴클레오티드 위치 G3685A에서 돌연변이를 갖고, 이는 아미노산 돌연변이 G → S를 일으킨다. 이 돌연변이를 도 1에 제시된 플라스미드를 사용하여 M41-K를 함유하는 rVV 내로 도입하였다.
rIBV M41K-A-ADRP는 nsp-3의 ADRP 영역의 뉴클레오티드 위치 A3664G 및 A3665C에서 2개의 돌연변이를 갖고, 이는 아미노산 돌연변이 N → A를 일으킨다. 이 돌연변이를 도 2에 제시된 플라스미드를 사용하여 M41-K를 함유하는 rVV 내로 도입하였다.
rIBV M41K-del3ab는 유전자 3의 뉴클레오티드 위치 23867 내지 24214의 결실을 갖고, 이는 보조 단백질 3a 및 3b의 결여를 일으킨다. 이 영역을 도 3에 제시된 플라스미드를 사용하여 M41-K를 함유하는 rVV로부터 결실시켰다.
3종의 재조합 바이러스를 사용하여 안구 및 비강 접종에 의해 8일령 특정 병원체 무함유 (SPF) 병아리를 감염시켜 이들을 감염후 제3일-제7일에 매일 기준으로 임상 징후 및 감염후 제4일 및 제6일에 섬모 활동에 의해 관찰된 바와 같은 병원성에 대해 시험하였다. 섬모 활동의 손실은 IBV의 병원성을 결정하는 널리 확립된 방법이다. 각각의 이들 재조합체는 도 4-6에 제시된 바와 같이 모 바이러스 M41-CK보다 덜 병원성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 3 - M41-R을 사용한 백신접종/챌린지 연구
후보 백신 바이러스는 수정 계란을 배아형성 제19일에 난내 백신접종시키고 접종된 계란의 부화율을 결정하는 연구에서 시험한다. 닭의 임상 건강을 조사하고 닭을 21일령에 용량당 103.65 EID50에서의 병독성 IB M41 챌린지 바이러스를 사용하여 챌린지한다.
임상 징후를 백신에 의한 챌린지 보호 후 조사하고 섬모정체 시험을 챌린지 후 제5일에 수행하여 섬모의 운동에 대한 챌린지 바이러스의 효과 및 섬모정체 (섬모 운동의 억제)에 대한 백신에 의한 보호를 조사한다.
표 3
Figure pct00019
부화율 연구의 결과
SPF 브로일러 계란을 상용 인큐베이션 절차에 따라 인큐베이션하였다. 인큐베이션 제19일에 30개의 계란의 6개의 군에게 용량당 104 EID50의 IB 백신 균주 IB M41-K-A-ADRP, IB M41-K-S-ADRP 및 IB M41-K-3ab를 접종시켰다. 30개의 계란의 또 다른 군에게 위약, 즉 PBS를 접종시켰다. 인큐베이션 제21일에 계란은 부화하였고 하기 결과가 수득되었다.
- PBS 87% (26/30) 부화됨, 1마리의 병아리는 부화 후 사망하였고 3개의 계란은 열리지 않고 배아 주입에 대해 표시되지 않은 상태를 유지하였다.
- M41-K-A-ARDP 97% (29/30) 부화됨, 1개의 계란은 열리지 않고 배아 주입에 대해 표시되지 않은 상태를 유지하였다.
- M41-K-S-ARDP 50% (15/30) 부화됨, 4개의 계란은 열리지 않은 상태를 유지하였고 그 중 1개는 배아 주입에 대해 표시되었다. 다른 계란/동물은 생존할 수 없었다.
- M41-K-3ab 47% (18/30) 부화됨, 7개의 계란은 열리지 않은 상태를 유지하였고 그 중 3개는 배아 주입에 대해 표시되었다. 다른 계란/동물은 생존할 수 없었다.
IB M41-K-A-ADRP는 접종된 계란의 우수한 부화율을 입증하였고 따라서 난내 백신접종을 위한 백신으로서 적합한 것으로 간주된다. 이 균주는 상기 상술된 바와 같은 챌린지 시험에서 효능에 대해 시험될 것이다.
상기 명세서에 언급된 모든 공개는 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경은 본 발명의 범주 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명이 구체적 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 구체적 실시양태로 지나치게 제한되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 분자 생물학, 바이러스학 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범주 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Pirbright Institute <120> CORONAVIRUS <130> P107816PCT <150> GB 1601498.7 <151> 2016-01-27 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27500 <212> DNA <213> Avian infectious bronchitis virus <400> 1 acttaagata gatattaata tatatctatc acactagcct tgcgctagat ttccaactta 60 acaaaacgga cttaaatacc tacagctggt cctcataggt gttccattgc agtgcacttt 120 agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggtttttgt tattaaaatc ttattgttgc 180 tggtatcact gcttgttttg ccgtgtctca ctttatacat ccgttgcttg ggctacctag 240 tatccagcgt cctacgggcg ccgtggctgg ttcgagtgcg aagaacctct ggttcatcta 300 gcggtaggcg ggtgtgtgga agtagcactt cagacgtacc ggttctgttg tgtgaaatac 360 ggggtcacct ccccccacat acctctaagg gcttttgagc ctagcgttgg gctacgttct 420 cgcataaggt cggctatacg acgtttgtag ggggtagtgc caaacaaccc ctgaggtgac 480 aggttctggt ggtgtttagt gagcagacat acaatagaca gtgacaacat ggcttcaagc 540 ctaaaacagg gagtatctcc caaactaagg gatgtcattc ttgtatccaa agacattcct 600 gaacaacttt gtgacgcttt gtttttctat acgtcacaca accctaagga ttacgctgat 660 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ttcaattaga tttagtttat aggttggcgt atacgcctac tcaatcgctg gtatgaataa 25740 tagtaaagat aatccttttt gcggagcaat agcaagaaaa gcgcgaattt atctgagaga 25800 aggattagat tgtgtttact ttcttaacaa agcaggacaa gcagagtctt gtcccgcgtg 25860 tacctctcta gtattccagg ggaaaacttg tgaggaacac aaatataata ataatctttt 25920 gtcatggcaa gcggtaaggc aactggaaag acagatgccc cagctccagt catcaaacta 25980 ggaggaccaa agccacctaa agttggttct tctggaaatg tatcttggtt tcaagcaata 26040 aaagccaaga agttaaattc acctccgcct aagtttgaag gtagcggtgt tcctgataat 26100 gaaaatctaa aaccaagtca gcagcatgga tattggagac gccaagctag gtttaagcca 26160 ggtaaaggtg gaagaaaacc agtcccagat gcttggtatt tttactatac tggaacagga 26220 ccagccgcta acctgaattg gggtgatagc caagatggta tagtgtgggt tgctggtaag 26280 ggtgctgata ctaaatttag atctaatcag ggtactcgtg actctgacaa gtttgaccaa 26340 tatccgctac ggttttcaga cggaggacct gatggtaatt tccgttggga tttcattcct 26400 ctgaatcgtg gcaggagtgg gagatcaaca gcagcttcat cagcagcatc tagtagagca 26460 ccatcacgtg aagtttcgcg tggtcgcagg agtggttctg aagatgatct 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Asn Leu Leu His Phe Lys Thr Gln Tyr Ser Asn Cys Pro Thr Cys Gly 705 710 715 720 Ala Ser Ser Thr Asp Glu Val Ile Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Leu Leu 725 730 735 Leu Phe Ala Thr Asp Gly Pro Ala Thr Val Asp Cys Asp Glu Asn Ala 740 745 750 Val Gly Thr Val Val Phe Ile Gly Ser Thr Asn Ser Gly His Cys Tyr 755 760 765 Thr Gln Ala Asp Gly Lys Ala Phe Asp Asn Leu Ala Lys Asp Arg Lys 770 775 780 Phe Gly Arg Lys Ser Pro Tyr Ile Thr Ala Met Tyr Thr Arg Phe Ser 785 790 795 800 Leu Arg Ser Glu Asn Pro Leu Leu Val Val Glu His Ser Lys Gly Lys 805 810 815 Ala Lys Val Val Lys Glu Asp Val Ser Asn Leu Ala Thr Ser Ser Lys 820 825 830 Ala Ser Phe Asp Asp Leu Thr Asp Phe Glu Gln Trp Tyr Asp Ser Asn 835 840 845 Ile Tyr Glu Ser Leu Lys Val Gln Glu Thr Pro Asp Asn Leu Asp Glu 850 855 860 Tyr Val Ser Phe Thr Thr Lys Glu Asp Ser Lys Leu Pro Leu Thr Leu 865 870 875 880 Lys Val Arg Gly Ile Lys Ser Val Val Asp Phe Arg Ser Lys Asp Gly 885 890 895 Phe Thr Tyr Lys Leu Thr Pro Asp Thr Asp Glu Asn Ser Lys Thr Pro 900 905 910 Val Tyr Tyr Pro Val Leu Asp Ser Ile Ser Leu Arg Ala Ile Trp Val 915 920 925 Glu Gly Ser Ala Asn Phe Val Val Gly His Pro Asn Tyr Tyr Ser Lys 930 935 940 Ser Leu Arg Ile Pro Thr Phe Trp Glu Asn Ala Glu Ser Phe Val Lys 945 950 955 960 Met Gly Tyr Lys Ile Asp Gly Val Thr Met Gly Leu Trp Arg Ala Glu 965 970 975 His Leu Asn Lys Pro Asn Leu Glu Arg Ile Phe Asn Ile Ala Lys Lys 980 985 990 Ala Ile Val Gly Ser Ser Val Val Thr Thr Gln Cys Gly Lys Ile Leu 995 1000 1005 Val Lys Ala Ala Thr Tyr Val Ala Asp Lys Val Gly Asp Gly Val 1010 1015 1020 Val Arg Asn Ile Thr Asp Arg Ile Lys Gly Leu Cys Gly Phe Thr 1025 1030 1035 Arg Gly His Phe Glu Lys Lys Met Ser Leu Gln Phe Leu Lys Thr 1040 1045 1050 Leu Val Phe Phe Phe Phe Tyr Phe Leu Lys Ala Ser Ala Lys Ser 1055 1060 1065 Leu Val Ser Ser Tyr Lys Ile Val Leu Cys Lys Val Val Phe Ala 1070 1075 1080 Thr Leu Leu Ile Val Trp Phe Ile Tyr Thr Ser Asn Pro Val Val 1085 1090 1095 Phe Thr Gly Ile Arg Val Leu Asp Phe Leu Phe Glu Gly Ser Leu 1100 1105 1110 Cys Gly Pro Tyr Asn Asp Tyr Gly Lys Asp Ser Phe Asp Val Leu 1115 1120 1125 Arg Tyr Cys Ala Gly Asp Phe Thr Cys Arg Val Cys Leu His Asp 1130 1135 1140 Arg Asp Ser Leu His Leu Tyr Lys His Ala Tyr Ser Val Glu Gln 1145 1150 1155 Ile Tyr Lys Asp Ala Ala Ser Gly Ile Asn Phe Asn Trp Asn Trp 1160 1165 1170 Leu Tyr Leu Val Phe Leu Ile Leu Phe Val Lys Pro Val Ala Gly 1175 1180 1185 Phe Val Ile Ile Cys Tyr Cys Val Lys Tyr Leu Val Leu Ser Ser 1190 1195 1200 Thr Val Leu Gln Thr Gly Val Gly Phe Leu Asp Trp Phe Val Lys 1205 1210 1215 Thr Val Phe Thr His Phe Asn Phe Met Gly Ala Gly Phe Tyr Phe 1220 1225 1230 Trp Leu Phe Tyr Lys Ile Tyr Val Gln Val His His Ile Leu Tyr 1235 1240 1245 Cys Lys Asp Val Thr Cys Glu Val Cys Lys Arg Val Ala Arg Ser 1250 1255 1260 Asn Arg Gln Glu Val Ser Val Val Val Gly Gly Arg Lys Gln Ile 1265 1270 1275 Val His Val Tyr Thr Asn Ser Gly Tyr Asn Phe Cys Lys Arg His 1280 1285 1290 Asn Trp Tyr Cys Arg Asn Cys Asp Asp Tyr Gly His Gln Asn Thr 1295 1300 1305 Phe Met Ser Pro Glu Val Ala Gly Glu Leu Ser Glu Lys Leu Lys 1310 1315 1320 Arg His Val Lys Pro Thr Ala Tyr Ala Tyr His Val Val Tyr Glu 1325 1330 1335 Ala Cys Val Val Asp Asp Phe Val Asn Leu Lys Tyr Lys Ala Ala 1340 1345 1350 Ile Pro Gly Lys Asp Asn Ala Ser Ser Ala Val Lys Cys Phe Ser 1355 1360 1365 Val Thr Asp Phe Leu Lys Lys Ala Val Phe Leu Lys Glu Ala Leu 1370 1375 1380 Lys Cys Glu Gln Ile Ser Asn Asp Gly Phe Ile Val Cys Asn Thr 1385 1390 1395 Gln Ser Ala His Ala Leu Glu Glu Ala Lys Asn Ala Ala Val Tyr 1400 1405 1410 Tyr Ala Gln Tyr Leu Cys Lys Pro Ile Leu Ile Leu Asp Gln Ala 1415 1420 1425 Leu Tyr Glu Gln Leu Ile Val Glu Pro Val Ser Lys Ser Val Ile 1430 1435 1440 Asp Lys Val Cys Ser Ile Leu Ser Asn Ile Ile Ser Val Asp Thr 1445 1450 1455 Ala Ala Leu Asn Tyr Lys Ala Gly Thr Leu Arg Asp Ala Leu Leu 1460 1465 1470 Ser Ile Thr Lys Asp Glu Glu Ala Val Asp Met Ala Ile Phe Cys 1475 1480 1485 His Asn His Glu Val Glu Tyr Thr Gly Asp Gly Phe Thr Asn Val 1490 1495 1500 Ile Pro Ser Tyr Gly Met Asp Thr Asp Lys Leu Thr Pro Arg Asp 1505 1510 1515 Arg Gly Phe Leu Ile Asn Ala Asp Ala Ser Ile Ala Asn Leu Arg 1520 1525 1530 Val Lys Asn Ala Pro Pro Val Val Trp Lys Phe Ser Asp Leu Ile 1535 1540 1545 Lys Leu Ser Asp Ser Cys Leu Lys Tyr Leu Ile Ser Ala Thr Val 1550 1555 1560 Lys Ser Gly Gly Arg Phe Phe Ile Thr Lys Ser Gly Ala Lys Gln 1565 1570 1575 Val Ile Ser Cys His Thr Gln Lys Leu Leu Val Glu Lys Lys Ala 1580 1585 1590 Gly

Claims (27)

  1. 비-구조 단백질 nsp-3에서의 돌연변이 및/또는 보조 단백질 3a 및/또는 3b의 결실을 포함하는 생 약독화된 코로나바이러스.
  2. 제1항에 있어서, nsp-3에서의 돌연변이가 아데노신 디포스페이트-리보스-1'-포스파타제 (ADRP) 영역 내에 있는 것인 코로나바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, nsp-3 유전자가
    a) 서열식별번호: 6의 위치 373에서의 Asn (N) → Ala (A); 및
    b) 서열식별번호: 6의 위치 379에서의 Gly (G) → Ser (S)
    의 목록으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 코로나바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, nsp-3 유전자가 서열식별번호: 6의 위치 373에서의 아미노산 돌연변이 Asn (N) → Ala (A)를 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 코로나바이러스.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, nsp-3 유전자가 서열식별번호: 6의 위치 379에서의 아미노산 돌연변이 Gly (G) → Ser (S)을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 코로나바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, nsp-3 유전자가
    a) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1116에서의 A → G 및 뉴클레오티드 위치 1117에서의 A → C; 및
    b) 서열식별번호: 5로서 제시된 서열과 비교하여 뉴클레오티드 위치 1138에서의 G → A
    의 목록으로부터 선택된 1개 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것인 코로나바이러스.
  7. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 2로서 제시된 서열의 뉴클레오티드 위치 37 내지 384의 결실을 포함하는 코로나바이러스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)인 코로나바이러스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IBV M41인 코로나바이러스.
  10. 제9항에 있어서, S 단백질을 포함하며, 여기서 적어도 그 중 일부가 M41 이외의 IBV 혈청형으로부터의 것인 코로나바이러스.
  11. 제10항에 있어서, S1 서브유닛이 M41 이외의 IBV 혈청형으로부터의 것인 코로나바이러스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 코로나바이러스와 비교하여 감소된 병원성을 가지며, 이에 따라 바이러스가 발육란에 투여되는 경우에 배아에 대해 병원성이 아니면서 복제될 수 있는 것인 코로나바이러스.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 변형된 nsp-3 유전자.
  14. 제13항에 따른 변형된 nsp-3 유전자에 의해 코딩되는 단백질.
  15. 제13항에 따른 변형된 nsp-3 유전자 또는 보조 단백질 3a 및/또는 3b의 결실을 갖는 변형된 유전자 3을 포함하는 플라스미드.
  16. 하기 단계:
    (i) 제15항에 따른 플라스미드를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 단계;
    (ii) 숙주 세포를 nsp-3 유전자 및/또는 유전자 3을 갖는 코로나바이러스 균주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 감염시키는 단계;
    (iii) 상동 재조합이 플라스미드 내의 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈 내의 상응하는 서열 사이에서 발생하도록 하여 변형된 유전자를 생산하는 단계; 및
    (iv) 변형된 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 선택하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 재조합 바이러스가 백시니아 바이러스인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    (v) 단계 (iv)로부터의 재조합 바이러스로부터의 DNA로부터 변형된 유전자를 포함하는 재조합 코로나바이러스를 회수하는 단계
    를 또한 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스를 생산할 수 있는 세포.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  21. 대상체에게 제20항에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하고/거나 예방하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 대상체에서 질환을 치료하고/거나 예방하는 데 사용하기 위한 백신.
  23. 대상체에서 질환을 치료하고/거나 예방하기 위한 백신의 제조에 있어서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스의 용도.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 감염성 기관지염 (IB)인 방법, 백신 또는 용도.
  25. 제21항에 있어서, 투여 방법이 점안 투여, 비강내 투여, 음용수 투여, 부화후 주입 및 난내 주입으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 백신접종이 난내 백신접종인 방법.
  27. 제19항에 따른 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 코로나바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는, 제20항에 따른 백신을 생산하는 방법.
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