CN108884447A - 冠状病毒 - Google Patents

冠状病毒 Download PDF

Info

Publication number
CN108884447A
CN108884447A CN201780006854.2A CN201780006854A CN108884447A CN 108884447 A CN108884447 A CN 108884447A CN 201780006854 A CN201780006854 A CN 201780006854A CN 108884447 A CN108884447 A CN 108884447A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coronavirus
val
gene
leu
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780006854.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108884447B (zh
Inventor
E.比克顿
S.基普
P.布里顿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pirbright Institute
Original Assignee
Pirbright Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pirbright Institute filed Critical Pirbright Institute
Publication of CN108884447A publication Critical patent/CN108884447A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108884447B publication Critical patent/CN108884447B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/20062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了活的减毒的冠状病毒，其包含非结构蛋白质nsp‑3中的突变和/或辅助蛋白质3a和3b的缺失。冠状病毒可以用作治疗和/或预防受试者中的疾病，如传染性支气管炎的疫苗。

Description

冠状病毒
发明领域
本发明涉及减毒的冠状病毒，其包含使病毒具有降低的致病性的突变。本发明还涉及此类冠状病毒在用于预防和/或治疗疾病的疫苗中的用途。
背景技术
禽传染性支气管炎病毒(IBV)，传染性支气管炎(IB)的病原体，是家禽的高感染性和传染性病原体，主要在呼吸道中复制，但也在肠道、肾和输卵管的上皮细胞中复制。IBV是巢状病毒目(Order Nidovirales)，冠状病毒科(Family Coronaviridae)，冠状病毒亚科(Subfamily Coronavirinae)和γ冠状病毒属(Gammacoronavirus)的成员；遗传上非常相似的冠状病毒引起火鸡、珍珠鸡和雉鸡的疾病。
IB的临床体征包括打喷嚏、气管罗音、鼻涕和哮鸣。肉用禽类具有减少的体重增加，而下蛋禽类下出较少的蛋并且产生较差质量的蛋。呼吸道感染使鸡对继发性细菌性感染易感，所述继发性细菌性感染对于鸡可以是致命的。病毒还可以对输卵管造成永久性损伤，特别是在鸡中，导致降低的蛋产量和质量；以及对肾脏造成永久性损伤，有时导致可以为致命性的肾脏疾病。
已经报告了IBV对家禽业造成的经济损失比任何其他传染病都要多。虽然减毒的活疫苗和灭活的疫苗普遍用于控制IBV，但是由于疫苗分解或引入与所用的疫苗无关的新IBV血清型，使用疫苗接种所获得的保护可以丧失。对家禽业造成风险。
此外，工业上需要开发适合于卵内使用的疫苗，以改善疫苗接种程序的效率和成本效益。与卵内疫苗接种相关的主要挑战是病毒必须能够在母体衍生的抗病毒抗体的情况下复制，而不会对胚胎造成致病性。目前的IBV疫苗是在含胚卵(embryonated egg)中多次传代后得到的，这导致对鸡具有降低的致病性的病毒，因此它们可以用作减毒的活疫苗。然而，此类病毒几乎总是显示对胚胎的毒力增加，因此不能用于卵内疫苗接种，因为它们引起降低的孵化率。在某些情况下看到70％的孵化率降低。
在含胚卵中多次传代后的减毒也遇到其他缺点。它是一种经验方法，因为病毒的减毒是随机的，并且每次病毒传代都会有所不同，因此为了减毒目的通过不同系列的蛋传代相同病毒会导致一组不同的导致减毒的突变。还存在与该过程相关的功效问题：一些突变将影响病毒的复制，并且一些突变可能使病毒过度减毒。突变也可以在S基因中发生，其也可以影响免疫原性，从而影响期望的免疫应答，并且潜在的疫苗不能针对期望的血清型提供保护。此外，存在与恢复毒力和疫苗稳定性相关的问题。
重要的是开发用于控制IBV的新的且更安全的疫苗。因此，需要与这些问题无关的IBV疫苗，特别是可用于卵内疫苗接种的疫苗。
发明概述
本发明人使用反向遗传学方法以合理地减弱IBV。这种方法比在含胚卵中多次传代后的随机减毒更可控，因为每个突变的位置是已知的，并且可以推导出其对病毒的影响，即减毒的原因。
使用它们的反向遗传学方法，本发明人已经鉴定出导致病毒具有降低的致病性水平的各种突变。可以降低致病性水平，使得当将病毒施用于含胚卵时，其能够复制而不会对胚胎造成致病性。此类病毒可适用于卵内疫苗接种，这是与在含胚卵中多次传代后产生的减毒IBV疫苗相比的显著优势。
因此，在第一方面，本发明提供了活的减毒的冠状病毒，其包含非结构蛋白质nsp-3中的突变和/或辅助蛋白质3a和/或3b的缺失。
nsp-3中的突变可以在腺苷二磷酸-核糖-1’-磷酸酶(ADRP)区域中。
经修饰的nsp-3基因可以编码包含选自下组的一个或多个氨基酸突变的蛋白质：
a)SEQ ID NO:6中第373位的Asn(N)至Ala(A)；和
b)SEQ ID NO:6中第379位的Gly(G)至Ser(S)。
经修饰的nsp-3基因可以编码包含SEQ ID NO:6中第373位氨基酸突变Asn(N)至Ala(A)的蛋白质。
经修饰的nsp-3基因可以编码包含SEQ ID NO:6中第379位氨基酸突变Gly(G)至Ser(S)的蛋白质。
经修饰的nsp-3基因可以包含选自下组的一个或多个核苷酸取代：
a)与以SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1116处的A至G和核苷酸位置1117处的A至C；和
b)与以SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1138处的G至A。
活的减毒的冠状病毒可以包含以SEQ ID NO:2所示的序列的核苷酸位置37至384的缺失。
冠状病毒可以是传染性支气管炎病毒(IBV)。
冠状病毒可以是IBV M41。
冠状病毒可以包含S蛋白，所述S蛋白的至少部分来自除M41之外的IBV血清型。
例如，S1亚基或整个S蛋白可以来自除M41之外的IBV血清型。
根据本发明的第一方面的冠状病毒与野生型冠状病毒相比可以具有降低的致病性，使得当将病毒施用于含胚卵时，其能够复制而对胚胎不是致病性的。
在第二方面，本发明提供了结合本发明的第一方面所定义的经修饰的nsp-3基因。
在第三方面，本发明提供了由根据本发明的第二方面的经修饰的nsp-3基因编码的蛋白质。
在第四方面，本发明提供了质粒，其包含根据本发明的第二方面的经修饰的nsp-3基因或具有辅助蛋白3a和/或3b的缺失的经修饰的基因3。
在第五方面，本发明提供了用于制备根据本发明的第一方面所述的冠状病毒的方法，其包括以下步骤：
(i)将根据本发明的第四方面的质粒转染入宿主细胞中；
(ii)用重组病毒感染宿主细胞，所述重组病毒包含具有nsp-3基因和/或基因3的冠状病毒株的基因组；
(iii)允许所述质粒中的基因序列和所述重组病毒基因组中的相应序列之间发生同源重组以产生经修饰的基因；并且
(iv)选择包含所述经修饰的基因的重组病毒。
重组病毒可以是痘苗病毒。
方法还可以包括以下步骤：
(v)从来自步骤(iv)的重组病毒的DNA中回收包含所述经修饰的基因的重组冠状病毒。
在第六方面，本发明提供了能够产生根据本发明的第一方面的冠状病毒的细胞。
在第七方面，本发明提供了疫苗，其包含根据本发明的第一方面的冠状病毒和药学可接受载体。
在第八方面，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者中的疾病的方法，该方法包括向受试者施用根据本发明的第七方面的疫苗的步骤。
本发明的其他方面提供：
·根据本发明的第七方面的疫苗，其用于治疗和/或预防受试者中的疾病。
·根据本发明的第一方面的冠状病毒在制备用于治疗和/或预防受试者中的疾病的疫苗中的用途。
疾病可能是传染性支气管炎(IB)。
疫苗的施用方法可以选自下组：滴眼剂施用、鼻内施用、饮用水施用、孵化后注射和卵内注射。
可以通过卵内疫苗接种进行疫苗接种。
本发明还提供了制备根据本发明的第七方面的疫苗的方法，该方法包括用根据本发明的第一方面的冠状病毒感染根据本发明第六方面的细胞的步骤。
附图简述
图1：用于产生rIBV M41K-S-ADRP的质粒。
图2：用于产生rIBV M41K-A-ADRP的质粒。
图3：用于产生rIBV M41K-del3ab的质粒。
图4：与M41-K相比感染rIBV M41K-S-ADRP、rIBV M41K-A-ADRP或rIBV M41K-del3ab的禽类的A)罗音；B)综合呼吸道症状(哮鸣和罗音)；C)发咔嗒声(Snicking)和D)纤毛活性(Ciliary activity)(所有条形图从左至右显示为模拟物、rIBV M41K-A-ADRP、rIBVM41K-S-ADRP、rIBV M41K-del3ab、M41-K)。
图5：感染后第4天的临床体征、病毒检测和分离的汇总。
图6：感染后第6天的临床体征，病毒检测和分离的汇总。
图7：在CK细胞上与野生型M41-K6和M41-CK EP4相比突变体M41K-S-ADRP 4、M41K-S-ADRP 2(S-ADRP突变的重复)和M41K-A-ADRP的生长动力学
图8：在CK细胞上与野生型M41-CK和M41-K相比突变体M41K-del3ab 10和M41K-del3ab 1的生长动力学
详细详述
本发明提供了突变体冠状病毒，其与相应的野生型冠状病毒相比具有降低的致病性。
冠状病毒
γ冠状病毒属是属于冠状病毒科的动物病毒属。冠状病毒是具有正义单链RNA基因组和螺旋对称性的包膜病毒。
冠状病毒的基因组大小范围为约27至32千碱基，这是任何已知RNA病毒的最长大小。
冠状病毒主要感染哺乳动物和禽类的上呼吸道或胃肠道。目前已知的五至六种不同的冠状病毒株感染人类。引起严重急性呼吸综合征(SARS)的最广为人知的人类冠状病毒SARS-CoV具有独特的发病机制，因为它引起上呼吸道感染和下呼吸道感染两者并且还可引起胃肠炎。中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)也会引起人类下呼吸道感染。认为冠状病毒在人类成人中引起所有常见感冒的相当大的百分比。
冠状病毒还会引起牲畜和家养宠物的一系列疾病，其中一些可以是严重的并且对养殖业构成威胁。家畜的经济上重要的冠状病毒包括传染性支气管炎病毒(IBV)，其主要引起鸡的呼吸道疾病并严重影响全世界的家禽业；猪冠状病毒(传染性胃肠炎，TGE)和牛冠状病毒，它们都会导致幼小的动物中的腹泻。猫冠状病毒有两种形式，猫肠道冠状病毒是一种临床意义不大的病原体，但这种病毒的自发突变可导致猫传染性腹膜炎(FIP)，一种与高死亡率相关的疾病。
还有两类犬冠状病毒(CCoV)，引起轻度胃肠道疾病的一类以及已经发现引起呼吸道疾病的一类。小鼠肝炎病毒(MHV)是一种冠状病毒，其导致高死亡率的流行性鼠病，特别是在实验室小鼠的集落中。
冠状病毒分为四组，如下所示：
α
·犬冠状病毒(CCoV)
·猫冠状病毒(FeCoV)
·人类冠状病毒229E(HCoV-229E)
·猪流行性腹泻病毒(PEDV)
·传染性胃肠炎病毒(TGEV)
·人类冠状病毒NL63(NL或New Haven)
β
·牛冠状病毒(BCoV)
·犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)-东南亚和密克罗尼西亚(Micronesia)常见
·人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)
·小鼠肝炎病毒(MHV)
·猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)
·大鼠冠状病毒(RCV)。大鼠冠状病毒在澳大利亚东部非常普遍，截至2008年3月/4月，它已在天然和野生啮齿类集群中发现。
·(尚无通用名称)(HCoV-HKU1)
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)
·中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)
γ
·传染性支气管炎病毒(IBV)
·土耳其冠状病毒(蓝冠病病毒)
·雉鸡冠状病毒
·珍珠鸡冠状病毒
δ
·鹎(Bulbul)冠状病毒(BuCoV)
·鹅口疮病毒(ThCoV)
·Munia冠状病毒(MuCoV)
·猪冠状病毒(PorCov)HKU15
本发明的重组冠状病毒可以源自α冠状病毒，如TGEV；β冠状病毒，如MHV；或者γ-冠状病毒，如IBV。
如本文所用，术语“源自”意指重组冠状病毒包含与野生型冠状病毒基本相同的核苷酸序列。例如，本发明的重组冠状病毒与野生型冠状病毒序列可以具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
IBV
禽传染性支气管炎(IB)是一种急性和高度传染性的鸡呼吸道疾病，其引起重大的经济损失。疾病的特征在于呼吸道体征，包括喘息、咳嗽，打喷嚏、气管罗音和流涕。在幼鸡中，可能发生严重呼吸性窘迫。在产蛋鸡中，呼吸性窘迫、肾炎、产蛋量减少、和内部蛋质量和蛋壳质量的丧失是常见的。
在肉鸡中，咳嗽和发嘎嘎声是常见的临床体征，在前提的所有禽类中迅速蔓延。未接种疫苗的鸡群的发病率为100％。死亡率随龄期、病毒株和继发感染而变化，但在未接种疫苗的鸡群中可能高达60％。
第一种被鉴定的IBV血清型是Massachusetts，但是在美国，除了最初鉴定的Massachusetts型之外，目前正在流行几种血清型，包括Arkansas和Delaware。
IBV株Beaudette是在鸡胚中至少150次传代后衍生的。IBV Beaudette对于孵化鸡不再是致病的，但是迅速杀死胚胎。
H120是商业活减毒IBVMassachusetts血清型疫苗株，其通过在含胚鸡蛋中传代约120次减毒。H52是另一种Massachusetts疫苗，并且代表H120发展过程中较早且略微更为致病的传代病毒(第52代)。通常使用基于H120的疫苗。
IB QX是IBV的毒性野外分离株(field isolate)。它有时被称为“中国QX”，因为它最初是在20世纪90年代中期在中国青岛地区爆发疾病后分离的。从那时起病毒就已经向欧洲蔓延。自2004年以来，在西欧部分地区(主要是荷兰，但也从德国、法国、比利时、丹麦和英国报告)在非常相似的病毒的情况下鉴定出严重的产蛋问题。
从荷兰病例中分离的病毒被代芬特尔(Deventer)的荷兰研究所鉴定为他们称为D388的新菌株。中国关联来自进一步的测试，其显示了病毒与中国QX病毒是99％相似的。现已开发出减毒活QX样IBV疫苗株。
IBV是包膜病毒，其在细胞质中复制并含有非分段的单链正义RNA基因组。IBV具有27.6kb的RNA基因组，并且像所有冠状病毒一样含有四种结构蛋白；刺突糖蛋白(S)、小膜蛋白(E)、整合膜蛋白(M)和与基因组RNA相互作用的核壳体蛋白(N)。
基因组按以下方式组织：5’UTR-聚合酶(复制酶)基因-结构蛋白基因(S-E-M-N)-UTR 3’；其中UTR是非翻译区(IBV中每约500个核苷酸)。
脂质包膜包含三种膜蛋白：S、M和E。IBV S蛋白是I型糖蛋白，其在内质网中寡聚化并组装成通过跨膜域插入病毒体膜中的同三聚体，并通过与M蛋白的非共价相互作用结合。在掺入冠状病毒颗粒后，S蛋白负责结合靶细胞受体和病毒和细胞膜的融合。S糖蛋白由四个域组成：在合成过程中切割的信号序列；胞外域，其存在于病毒体颗粒的外面；负责将S蛋白锚定到病毒体颗粒的脂质双层中的跨膜区；和胞质尾部。
本发明的重组冠状病毒可以源自IBV。例如，IBV可以是IBV Beaudette、H120、H52、IB QX、D388或M41。
IBV可以是IBV M41。M41是一种于1941年在美国分离出来的原型Massachusetts血清型。它是在世界上的许多实验室中用作病原性实验室染色剂的分离株，并且可以从ATCC(VR-21TM)购得。几个疫苗生产商也使用减毒变体作为针对Massachusetts血清型的IBV疫苗，引起该领域的问题。本发明人选择使用该菌株，因为它们已经在该病毒上工作多年，并且因为可获得完整病毒基因组的序列。本发明人使用的M41分离株M41-CK适于在原代鸡肾(CK)细胞中生长，因此认为适合从完整基因组的cDNA中作为感染性病毒回收。它是致病性IBV的代表，因此可以分析导致致病性丧失或降低的突变。
IBV M41-CK的基因组序列以SEQ ID NO:1提供。
SEQ ID NO:1IBV M41-CK序列
ACTTAAGATAGATATTAATATATATCTATCACACTAGCCTTGCGCTAGATTTCCAACTTAACAAAACGGACTTAAATACCTACAGCTGGTCCTCATAGGTGTTCCATTGCAGTGCACTTTAGTGCCCTGGATGGCACCTGGCCACCTGTCAGGTTTTTGTTATTAAAATCTTATTGTTGCTGGTATCACTGCTTGTTTTGCCGTGTCTCACTTTATACATCCGTTGCTTGGGCTACCTAGTATCCAGCGTCCTACGGGCGCCGTGGCTGGTTCGAGTGCGAAGAACCTCTGGTTCATCTAGCGGTAGGCGGGTGTGTGGAAGTAGCACTTCAGACGTACCGGTTCTGTTGTGTGAAATACGGGGTCACCTCCCCCCACATACCTCTAAGGGCTTTTGAGCCTAGCGTTGGGCTACGTTCTCGCATAAGGTCGGCTATACGACGTTTGTAGGGGGTAGTGCCAAACAACCCCTGAGGTGACAGGTTCTGGTGGTGTTTAGTGAGCAGACATACAATAGACAGTGACAACATGGCTTCAAGCCTAAAACAGGGAGTATCTCCCAAACTAAGGGATGTCATTCTTGTATCCAAAGACATTCCTGAACAACTTTGTGACGCTTTGTTTTTCTATACGTCACACAACCCTAAGGATTACGCTGATGCTTTTGCAGTTAGGCAGAAGTTTGATCGTAATCTGCAGACTGGGAAACAGTTCAAATTTGAAACTGTGTGTGGTCTCTTCCTCTTGAAGGGAGTTGACAAAATAACACCTGGCGTCCCAGCAAAAGTCTTAAAAGCCACTTCTAAGTTGGCAGATTTAGAAGACATCTTTGGTGTCTCTCCCTTTGCAAGAAAATATCGTGAACTTTTGAAGACAGCATGCCAGTGGTCTCTTACTGTAGAAACACTGGATGCTCGTGCACAAACTCTTGATGAAATTTTTGACCCTACTGAAATACTTTGGCTTCAGGTGGCAGCAAAAATCCAAGTTTCGGCTATGGCGATGCGCAGGCTTGTTGGAGAAGTAACTGCAAAAGTCATGGATGCTTTGGGCTCAAATATGAGTGCTCTTTTCCAGATTTTTAAACAACAAATAGTCAGAATTTTTCAAAAAGCGCTGGCTATTTTTGAGAATGTGAGTGAATTACCACAGCGTATTGCAGCACTTAAGATGGCTTTTGCTAAGTGTGCCAAGTCCATTACTGTTGTGGTTATGGAGAGGACTCTAGTTGTTAGAGAGTTCGCAGGAACTTGTCTTGCAAGCATTAATGGTGCTGTTGCAAAATTCTTTGAAGAACTCCCAAATGGTTTCATGGGTGCTAAAATTTTCACTACACTTGCCTTCTTTAGGGAGGCTGCAGTGAAAATTGTGGATAACATACCAAATGCACCGAGAGGCACTAAAGGGTTTGAAGTCGTTGGTAATGCCAAAGGTACACAAGTTGTTGTGCGTGGCATGCGAAATGACTTAACACTGCTTGACCAAAAAGCTGAAATTCCTGTGGAGTCAGAAGGTTGGTCTGCAATTTTGGGTGGACATCTTTGCTATGTCTTTAAGAGTGGTGATCGCTTTTACGCGGCACCTCTTTCAGGAAATTTTGCATTGCATGATGTGCATTGTTGTGAGCGTGTTGTCTGTCTTTCTGATGGTGTAACACCGGAGATAAATGATGGACTTATTCTTGCAGCAATCTACTCTTCTTTTAGTGTCGCAGAACTTGTGGCAGCCATTAAAAGGGGTGAACCATTTAAGTTTCTGGGTCATAAATTTGTGTATGCAAAGGATGCAGCAGTTTCTTTTACATTAGCGAAGGCTGCTACTATTGCAGATGTTTTGAAGCTGTTTCAATCAGCGCGTGTGAAAGTAGAAGATGTTTGGTCTTCACTTACTGAAAAGTCTTTTGAATTCTGGAGGCTTGCATATGGAAAAGTGCGTAATCTCGAAGAATTTGTTAAGACTTGTTTTTGTAAGGCTCAAATGGCGATTGTGATTTTAGCGACAGTGCTTGGAGAGGGCATTTGGCATCTTGTTTCGCAAGTCATCTATAAAGTAGGTGGTCTTTTTACTAAAGTTGTTGACTTTTGTGAAAAATATTGGAAAGGTTTTTGTGCACAGTTGAAAAGAGCTAAGCTCATTGTCACTGAAACCCTCTGTGTTTTGAAAGGAGTTGCACAGCATTGTTTTCAACTATTGCTGGATGCAATACAGTTTATGTATAAAAGTTTTAAGAAGTGTGCACTTGGTAGAATCCATGGAGACTTGCTCTTCTGGAAAGGAGGTGTGCACAAAATTATTCAAGAGGGCGATGAAATTTGGTTTGACGCCATTGATAGTATTGATGTTGAAGATCTGGGTGTTGTTCAAGAAAAATTGATTGATTTTGATGTTTGTGATAATGTGACACTTCCAGAGAACCAACCCGGTCATATGGTTCAAATCGAGGATGACGGAAAGAACTACATGTTCTTCCGCTTCAAAAAGGATGAGAACATTTATTATACACCAATGTCACAGCTTGGTGCTATTAATGTGGTTTGCAAAGCAGGCGGTAAAACTGTCACCTTTGGAGAAACTACTGTGCAAGAAATACCACCACCTGATGTTGTGTTTATTAAGGTTAGCATTGAGTGTTGTGGTGAACCATGGAATACAATCTTCAAAAAGGCTTATAAGGAGCCCATTGAAGTAGAGACAGACCTCACAGTTGAACAATTGCTCTCTGTGGTCTATGAGAAAATGTGTGATGATCTCAAGCTGTTTCCGGAGGCTCCAGAACCACCACCATTTGAGAATGTCACACTTGTTGATAAGAATGGTAAAGATTTGGATTGCATAAAATCATGCCATCTGATCTATCGTGATTATGAGAGCGATGATGACATCGAGGAAGAAGATGCAGAAGAATGTGACACGGATTCAGGTGATGCTGAGGAGTGTGACACTAATTCAGAATGTGAAGAAGAAGATGAGGATACTAAAGTGTTGGCTCTTATACAAGACCCGGCAAGTAACAAATATCCTCTGCCTCTTGATGATGATTATAGCGTCTACAATGGATGTATTGTTCATAAGGACGCTCTCGATGTTGTGAATTTACCATCTGGTGAAGAAACCTTTGTTGTCAATAACTGCTTTGAAGGGGCTGTTAAAGCTCTTCCGCAGAAAGTTATTGATGTTCTAGGTGACTGGGGTGAGGCTGTTGATGCGCAAGAACAATTGTGTCAACAAGAATCAACTCGGGTCATATCTGAGAAATCAGTTGAGGGTTTTACTGGTAGTTGTGATGCAATGGCTGAACAAGCTATTGTTGAAGAGCAGGAAATAGTACCTGTTGTTGAACAAAGTCAGGATGTAGTTGTTTTTACACCTGCAGACCTAGAAGTTGTTAAAGAAACAGCAGAAGAGGTTGATGAGTTTATTCTCATTTCTGCTGTCCCTAAAGAAGAAGTTGTGTCTCAGGAGAAAGAGGAGCCACAGGTTGAGCAAGAGCCTACCCTAGTTGTTAAAGCACAACGTGAGAAGAAGGCTAAAAAGTTCAAAGTTAAACCAGCTACATGTGAAAAACCCAAATTTTTGGAGTACAAAACATGTGTGGGTGATTTGGCTGTTGTAATTGCCAAAGCATTGGATGAGTTTAAAGAGTTCTGCATTGTAAACGCTGCAAATGAGCACATGTCGCATGGTGGTGGCGTTGCAAAGGCAATTGCAGACTTTTGTGGACCGGACTTTGTTGAATATTGCGCGGACTATGTTAAGAAACATGGTCCACAGCAAAAACTTGTCACACCTTCATTTGTTAAAGGCATTCAATGTGTGAATAATGTTGTAGGACCTCGCCATGGAGACAGCAACTTGCGTGAGAAGCTTGTTGCTGCTTACAAGAGTGTTCTTGTAGGTGGAGTGGTTAACTATGTTGTGCCAGTTCTCTCATCAGGGATTTTTGGTGTAGATTTTAAAATATCAATAGATGCTATGCGCGAAGCTTTTAAAGGTTGTGCCATACGCGTTCTTTTATTTTCTCTGAGTCAAGAACACATCGATTATTTCGATGCAACTTGTAAGCAGAAGACAATTTATCTTACGGAGGATGGTGTTAAATACCGCTCTGTTGTTTTAAAACCTGGTGATTCTTTGGGTCAATTTGGACAGGTTTTTGCAAGAAATAAGGTAGTCTTTTCGGCTGATGATGTTGAGGATAAAGAAATCCTCTTTATACCCACAACTGACAAGACTATTCTTGAATATTATGGTTTAGATGCGCAAAAGTATGTAACATATTTGCAAACGCTTGCGCAGAAATGGGATGTTCAATATAGAGACAATTTTGTTATATTAGAGTGGCGTGACGGAAATTGCTGGATTAGTTCAGCAATAGTTCTCCTTCAAGCTGCTAAAATTAGATTTAAAGGTTTTCTTGCAGAAGCATGGGCTAAACTGTTGGGTGGAGATCCTACAGACTTTGTTGCCTGGTGTTATGCAAGTTGCAATGCTAAAGTAGGTGATTTTTCAGATGCTAATTGGCTTTTGGCCAATTTAGCAGAACATTTTGACGCAGATTACACAAATGCACTTCTTAAGAAGTGTGTGTCGTGCAATTGTGGTGTTAAGAGTTATGAACTTAGGGGTCTTGAAGCCTGTATTCAGCCAGTTCGAGCACCTAATCTTCTACATTTTAAAACGCAATATTCAAATTGCCCAACCTGTGGTGCAAGTAGTACGGATGAAGTAATAGAAGCTTCATTACCGTACTTATTGCTTTTTGCTACTGATGGTCCTGCTACAGTTGATTGTGATGAAAATGCTGTAGGGACTGTTGTTTTCATTGGCTCTACTAATAGTGGCCATTGTTATACACAAGCCGATGGTAAGGCTTTTGACAATCTTGCTAAGGATAGAAAATTTGGAAGGAAGTCGCCTTACATTACAGCAATGTATACACGTTTTTCTCTTAGGAGTGAAAATCCCCTACTTGTTGTTGAACATAGTAAGGGTAAAGCTAAAGTAGTAAAAGAAGATGTTTCTAACCTTGCTACTAGTTCTAAAGCCAGTTTTGACGATCTTACTGACTTTGAACAGTGGTATGATAGCAACATCTATGAGAGTCTTAAAGTGCAGGAGACACCTGATAATCTTGATGAATATGTGTCATTTACGACAAAGGAAGATTCTAAGTTGCCACTGACACTTAAAGTTAGAGGTATCAAATCAGTTGTTGACTTTAGGTCTAAGGATGGTTTTACTTATAAGTTAACACCTGATACTGATGAAAATTCAAAAACACCAGTCTACTACCCAGTCTTGGATTCTATTAGTCTTAGGGCAATATGGGTTGAAGGCAGTGCTAATTTTGTTGTTGGGCATCCAAATTATTATAGTAAGTCTCTCCGAATTCCCACGTTTTGGGAAAATGCCGAGAGCTTTGTTAAAATGGGTTATAAAATTGATGGTGTAACTATGGGCCTTTGGCGTGCAGAACACCTTAATAAACCTAATTTGGAGAGAATTTTTAACATTGCTAAGAAAGCTATTGTTGGATCTAGTGTTGTTACTACGCAGTGTGGTAAAATACTAGTTAAAGCAGCTACATACGTTGCCGATAAAGTAGGTGATGGTGTAGTTCGCAATATTACAGATAGAATTAAGGGTCTTTGTGGATTCACACGTGGCCATTTTGAAAAGAAAATGTCCCTACAATTTCTAAAGACACTTGTGTTCTTTTTCTTTTATTTCTTAAAGGCTAGTGCTAAGAGTTTAGTTTCTAGCTATAAGATTGTGTTATGTAAGGTGGTGTTTGCTACCTTACTTATAGTGTGGTTTATATACACAAGTAATCCAGTAGTGTTTACTGGAATACGTGTGCTAGACTTCCTATTTGAAGGTTCTTTATGTGGTCCTTATAATGACTACGGTAAAGATTCTTTTGATGTGTTACGCTATTGTGCAGGTGATTTTACTTGTCGTGTGTGTTTACATGATAGAGATTCACTTCATCTGTACAAACATGCTTATAGCGTAGAACAAATTTATAAGGATGCAGCTTCTGGCATTAACTTTAATTGGAATTGGCTTTATTTGGTCTTTCTAATATTATTTGTTAAGCCAGTGGCAGGTTTTGTTATTATTTGTTATTGTGTTAAGTATTTGGTATTGAGTTCAACTGTGTTGCAAACTGGTGTAGGTTTTCTAGATTGGTTTGTAAAAACAGTTTTTACCCATTTTAATTTTATGGGAGCGGGATTTTATTTCTGGCTCTTTTACAAGATATACGTACAAGTGCATCATATATTGTACTGTAAGGATGTAACATGTGAAGTGTGCAAGAGAGTTGCACGCAGCAACAGGCAAGAGGTTAGCGTTGTAGTTGGTGGACGCAAGCAAATAGTGCATGTTTACACTAATTCTGGCTATAACTTTTGTAAGAGACATAATTGGTATTGTAGAAATTGTGATGATTATGGTCACCAAAATACATTTATGTCCCCTGAAGTTGCTGGCGAGCTTTCTGAAAAGCTTAAGCGCCATGTTAAACCTACAGCATATGCTTACCACGTTGTGTATGAGGCATGCGTGGTTGATGATTTTGTTAATTTAAAATATAAGGCTGCAATTCCTGGTAAGGATAATGCATCTTCTGCTGTTAAGTGTTTCAGTGTTACAGATTTTTTAAAGAAAGCTGTTTTTCTTAAGGAGGCATTGAAATGTGAACAAATATCTAATGATGGTTTTATAGTGTGTAATACACAGAGTGCGCATGCACTAGAGGAAGCAAAGAATGCAGCCGTCTATTATGCGCAATATCTGTGTAAGCCAATACTTATACTTGACCAGGCACTTTATGAGCAATTAATAGTAGAGCCTGTGTCTAAGAGTGTTATAGATAAAGTGTGTAGCATTTTGTCTAATATAATATCTGTAGATACTGCAGCTTTAAATTATAAGGCAGGCACACTTCGTGATGCTCTGCTTTCTATTACTAAAGACGAAGAAGCCGTAGATATGGCTATCTTCTGCCACAATCATGAAGTGGAATACACTGGTGACGGTTTTACTAATGTGATACCGTCATATGGTATGGACACTGATAAGTTGACACCTCGTGATAGAGGGTTTTTGATAAATGCAGATGCTTCTATTGCTAATTTAAGAGTCAAAAATGCTCCTCCGGTAGTATGGAAGTTTTCTGATCTTATTAAATTGTCTGACAGTTGCCTTAAATATTTAATTTCAGCTACTGTCAAGTCAGGAGGTCGTTTCTTTATAACAAAGTCTGGTGCTAAACAAGTTATTTCTTGTCATACCCAGAAACTGTTGGTAGAGAAAAAGGCAGGTGGTGTTATTAATAACACTTTTAAATGGTTTATGAGTTGTTTTAAATGGCTTTTTGTCTTTTATATACTTTTTACAGCATGTTGTTTGGGTTACTACTATATGGAGATGAATAAAAGTTTTGTTCACCCCATGTATGATGTAAACTCCACACTGCATGTTGAAGGGTTCAAAGTTATAGACAAAGGTGTTATTAGAGAGATTGTGTCAGAAGATAATTGTTTCTCTAATAAGTTTGTTAATTTTGACGCCTTTTGGGGTAAATCATATGAAAATAATAAAAACTGTCCAATTGTTACAGTTGTTATAGATGGTGACGGGACAGTAGCTGTTGGTGTTCCTGGTTTTGTATCATGGGTTATGGATGGTGTTATGTTTGTGCATATGACACAGACTGATCGTAGACCTTGGTACATTCCTACCTGGTTTAATAGAGAAATTGTTGGTTACACTCAGGATTCAATTATCACTGAGGGTAGTTTTTATACATCTATAGCATTATTTTCTGCTAGATGTTTATATTTAACAGCCAGCAATACACCTCAATTGTATTGTTTTAATGGCGACAATGATGCACCTGGAGCCTTACCATTTGGTAGTATTATTCCTCATAGAGTATACTTCCAACCTAATGGTGTTAGGCTTATAGTTCCACAACAAATACTGCATACACCCTACATAGTGAAGTTTGTTTCAGACAGCTATTGTAGAGGTAGTGTATGTGAGTATACTAAACCAGGTTACTGTGTGTCACTAGACTCCCAATGGGTTTTGTTTAATGATGAATACATTAGTAAACCTGGCGTTTTCTGTGGTTCTACTGTTAGAGAACTTATGTTTAATATGGTTAGTACATTCTTTACTGGTGTCAACCCTAATATTTATATTCAGCTAGCAACTATGTTTTTAATACTAGTTGTTATTGTGTTAATTTTTGCAATGGTTATAAAGTTTCAAGGTGTTTTTAAAGCTTATGCGACCATTGTGTTTACAATAATGTTAGTTTGGGTTATTAATGCATTTGTTTTGTGTGTACATAGTTATAATAGTGTTTTAGCTGTTATATTATTAGTACTCTATTGCTATGCATCATTGGTTACAAGTCGCAATACTGCTATAATAATGCATTGTTGGCTTGTTTTTACCTTTGGTTTAATAGTACCCACATGGTTGGCTTGTTGCTATCTGGGATTTATTCTTTATATGTACACACCGTTGGTTTTCTGGTGTTACGGTACTACTAAAAATACTCGTAAGTTGTATGATGGCAACGAGTTTGTTGGTAATTATGACCTTGCTGCGAAGAGCACTTTTGTTATTCGTGGTACTGAATTTGTTAAGCTTACGAATGAGATAGGTGATAAATTTGAAGCCTATCTTTCTGCGTATGCTAGACTTAAATACTATTCAGGCACTGGTAGTGAGCAAGATTACTTGCAAGCTTGTCGTGCATGGTTAGCTTATGCTTTGGACCAATATAGAAATAGTGGTGTTGAGGTTGTTTATACCCCACCGCGTTACTCTATTGGTGTTAGTAGACTACACGCTGGTTTTAAAAAACTAGTTTCTCCTAGTAGTGCTGTTGAGAAGTGCATTGTTAGTGTCTCTTATAGAGGCAATAATCTTAATGGACTGTGGCTGGGTGATTCTATTTACTGCCCACGCCATGTGTTAGGTAAGTTTAGTGGTGACCAGTGGGGTGACGTACTAAACCTTGCTAATAATCATGAGTTTGAAGTTGTAACTCAAAATGGTGTTACTTTGAATGTTGTCAGCAGGCGGCTTAAAGGAGCAGTTTTAATTTTACAAACTGCAGTTGCCAATGCTGAAACTCCTAAGTATAAGTTTGTTAAAGCTAATTGTGGTGATAGTTTCACTATAGCTTGTTCTTATGGTGGTACAGTTATAGGACTTTACCCTGTCACTATGCGTTCTAATGGTACTATTAGAGCATCTTTCCTAGCAGGAGCCTGTGGCTCAGTTGGTTTTAATATAGAAAAGGGTGTAGTTAATTTCTTTTATATGCACCATCTTGAGTTACCTAATGCATTACACACTGGAACTGACCTAATGGGTGAGTTTTATGGTGGTTATGTAGATGAAGAGGTTGCGCAAAGAGTGCCACCAGATAATCTAGTTACTAACAATATTGTAGCATGGCTCTATGCGGCAATTATTAGTGTTAAAGAAAGTAGTTTTTCACAACCTAAATGGTTGGAGAGTACTACTGTTTCTATTGAAGATTACAATAGGTGGGCTAGTGATAATGGTTTTACTCCATTTTCCACTAGTACTGCTATTACTAAATTAAGTGCTATAACTGGGGTTGATGTTTGTAAACTCCTTCGCACTATTATGGTAAAAAGTGCTCAATGGGGTAGTGATCCCATTTTAGGACAATATAATTTTGAAGACGAATTGACACCAGAATCTGTATTTAATCAAGTTGGTGGTGTTAGGTTACAGTCTTCTTTTGTAAGAAAAGCTACATCTTGGTTTTGGAGTAGATGTGTATTAGCTTGCTTCTTGTTTGTGTTGTGTGCTATTGTCTTATTTACGGCAGTGCCACTTAAGTTTTATGTACATGCAGCTGTTATTTTGTTGATGGCTGTGCTCTTTATTTCTTTTACTGTTAAACATGTTATGGCATACATGGACACTTTCCTATTGCCTACATTGATTACAGTTATTATTGGAGTTTGTGCTGAAGTCCCTTTCATATACAATACTCTAATTAGTCAAGTTGTTATTTTCTTAAGCCAATGGTATGATCCTGTAGTCTTTGATACTATGGTACCATGGATGTTATTGCCATTAGTGTTGTACACTGCTTTTAAGTGTGTACAAGGCTGCTATATGAATTCTTTCAATACTTCTTTGTTAATGCTGTATCAGTTTATGAAGTTAGGTTTTGTTATTTACACCTCTTCAAACACTCTTACTGCATATACAGAAGGTAATTGGGAGTTATTCTTTGAGTTGGTTCACACTATTGTGTTGGCTAATGTTAGTAGTAATTCCTTAATTGGTTTAATTGTTTTTAAGTGTGCTAAGTGGATTTTATATTATTGCAATGCAACATACTTTAATAATTATGTGTTAATGGCAGTCATGGTTAATGGCATAGGCTGGCTTTGCACCTGTTACTTTGGATTGTATTGGTGGGTTAATAAAGTTTTTGGTTTAACCTTAGGTAAATACAATTTTAAAGTTTCAGTAGATCAATATAGGTATATGTGTTTGCATAAGGTAAATCCACCTAAAACTGTGTGGGAGGTCTTTACTACAAATATACTTATACAAGGAATTGGAGGCGATCGTGTGTTGCCTATAGCTACAGTGCAATCTAAATTGAGTGATGTAAAGTGTACAACTGTTGTTTTAATGCAGCTTTTGACTAAGCTTAATGTTGAAGCAAATTCAAAAATGCATGCTTATCTTGTTGAGTTACACAATAAAATCCTCGCATCTGATGATGTTGGAGAGTGCATGGATAATTTATTGGGTATGCTTATAACACTATTTTGTATAGATTCTACTATTGATTTGGGTGAGTATTGTGATGATATACTTAAGAGGTCAACTGTATTACAATCGGTTACTCAAGAGTTTTCGCACATACCCTCGTATGCTGAATATGAAAGAGCTAAGAGTATTTATGAAAAGGTTTTAGCCGATTCTAAAAATGGTGGTGTAACACAGCAAGAGCTTGCTGCATATCGTAAAGCTGCCAATATTGCAAAGTCAGTTTTTGATAGAGACTTGGCTGTTCAAAAGAAGTTAGATAGCATGGCAGAACGTGCTATGACAACAATGTATAAAGAGGCGCGTGTAACTGATAGAAGAGCAAAATTAGTTTCATCATTACATGCACTACTTTTTTCAATGCTTAAGAAAATAGATTCTGAGAAGCTTAATGTCTTATTTGACCAGGCGAATAGTGGTGTTGTACCCCTAGCAACTGTTCCAATTGTTTGTAGTAATAAGCTTACCCTTGTTATACCAGACCCAGAGACGTGGGTCAAGTGTGTGGAGGGTGTGCATGTTACATATTCAACAGTTGTTTGGAATATAGACTGTGTTACTGATGCCGATGGCACAGAGTTACACCCCACTTCTACAGGTAGTGGATTGACTTACTGTATAAGTGGTGATAATATAGCATGGCCTTTAAAGGTTAACTTGACTAGGAATGGGCATAATAAGGTTGATGTTGCCTTGCAAAATAATGAGCTTATGCCTCACGGTGTAAAGACAAAGGCTTGCGTAGCAGGTGTAGATCAAGCACATTGTAGCGTTGAGTCTAAATGTTATTATACAAGTATTAGTGGCAGTTCAGTTGTAGCTGCTATTACCTCTTCAAATCCTAATCTGAAAGTAGCCTCTTTTTTGAATGAGGCAGGTAATCAGATTTATGTAGACTTAGACCCACCATGTAAATTTGGTATGAAAGTGGGTGATAAGGTTGAAGTTGTTTACCTGTATTTTATAAAAAATACGAGGTCTATTGTAAGAGGTATGGTACTTGGTGCTATATCTAATGTTGTTGTGTTACAATCTAAAGGTCATGAGACAGAGGAAGTGGATGCTGTAGGCATTCTCTCACTTTGTTCTTTTGCAGTAGATCCTGCGGATACATATTGTAAATATGTGGCAGCAGGTAATCAACCTTTAGGTAACTGTGTTAAAATGTTGACAGTACATAATGGTAGTGGTTTTGCAATAACATCAAAGCCAAGTCCAACTCCGGATCAGGATTCTTATGGAGGAGCTTCTGTGTGTCTTTATTGTAGAGCACATATAGCACACCCTGGCGGAGCAGGAAATTTAGATGGACGCTGTCAATTTAAAGGTTCTTTTGTGCAAATACCTACTACGGAGAAAGATCCTGTTGGATTCTGTCTACGTAACAAGGTTTGCACTGTTTGTCAGTGTTGGATTGGTTATGGATGTCAGTGTGATTCACTTAGACAACCTAAACCTTCTGTTCAGTCAGTTGCTGTTGCATCTGGTTTTGATAAGAATTATTTAAACGGGTACGGGGTAGCAGTGAGGCTCGGCTGATACCCCTAGCTAATGGATGTGACCCCGATGTTGTAAAGCGAGCCTTTGATGTTTGTAATAAGGAATCAGCCGGTATGTTTCAAAATTTGAAGCGTAACTGTGCACGATTCCAAGAAGTACGTGATACTGAAGATGGAAATCTTGAGTATTGTGATTCTTATTTTGTGGTTAAACAAACCACTCCTAGTAATTATGAACATGAGAAAGCTTGTTATGAAGACTTAAAGTCAGAAGTAACAGCTGATCATGATTTCTTTGTGTTCAATAAGAACATTTATAATATTAGTAGGCAGAGGCTTACTAAGTATACTATGATGGATTTTTGCTATGCTTTGCGGCACTTTGACCCAAAGGATTGCGAAGTTCTTAAAGAAATACTTGTCACTTATGGTTGTATAGAAGATTATCACCCTAAGTGGTTTGAAGAGAATAAGGATTGGTACGACCCAATAGAAAACCCTAAATATTATGCCATGTTGGCTAAAATGGGACCTATTGTACGACGTGCTTTATTGAATGCTATTGAGTTCGGAAACCTCATGGTTGAAAAAGGTTATGTTGGTGTTATTACACTTGATAACCAAGATCTTAATGGCAAATTTTATGATTTTGGTGATTTTCAGAAGACAGCGCCTGGTGCTGGTGTTCCTGTTTTTGATACGTATTATTCTTACATGATGCCCATCATAGCCATGACTGATGCGTTGGCACCTGAGAGGTATTTTGAATATGATGTGCATAAGGGTTATAAATCTTATGATCTCCTCAAGTATGATTATACTGAGGAGAAACAAGATTTGTTTCAGAAGTACTTTAAGTATTGGGATCAAGAGTATCACCCTAACTGTCGCGACTGTAGTGATGACAGGTGTTTGATACATTGTGCAAACTTCAACATCTTGTTTTCTACACTTGTACCGCAGACTTCTTTCGGTAATTTGTGTAGAAAGGTTTTTGTTGATGGTGTACCATTTATAGCTACTTGTGGCTATCATTCTAAGGAACTTGGTGTTATTATGAATCAAGATAACACCATGTCATTTTCAAAAATGGGTTTGAGTCAACTCATGCAGTTTGTTGGAGATCCTGCCTTGTTAGTGGGGACATCCAATAAATTAGTGGATCTTAGAACGTCTTGTTTTAGTGTTTGTGCTTTAGCGTCTGGTATTACTCATCAAACGGTAAAACCAGGTCACTTTAACAAGGATTTCTACGATTTTGCAGAGAAGGCTGGTATGTTTAAGGAAGGTTCTTCTATACCACTTAAACATTTCTTCTACCCACAGACTGGTAATGCTGCTATAAACGATTATGATTATTATCGTTATAACAGGCCTACCATGTTTGATATACGTCAACTTTTATTTTGTTTAGAAGTGACTTCTAAATATTTTGAATGTTATGAAGGCGGCTGTATACCAGCAAGCCAAGTTGTAGTTAACAATTTAGATAAGAGTGCAGGTTATCCGTTCAATAAGTTTGGAAAGGCCCGTCTCTATTATGAAATGAGTCTAGAGGAGCAGGACCAACTCTTTGAGAGTACAAAGAAGAACGTCCTGCCTACTATAACTCAGATGAATTTAAAATATGCCATATCCGCGAAAAATAGAGCGCGTACAGTGGCAGGTGTGTCTATCCTTTCTACTATGACTAATAGGCAGTTTCATCAGAAGATTCTTAAGTCTATAGTCAACACTAGAAACGCTCCTGTAGTTATTGGAACAACCAAGTTTTATGGCGGTTGGGATAACATGTTGAGAAACCTTATTCAGGGTGTTGAAGACCCGATTCTTATGGGTTGGGATTATCCAAAGTGTGATAGAGCAATGCCTAATTTGTTGCGTATAGCAGCATCTTTAGTACTCGCTCGTAAACACACTAATTGTTGTACTTGGTCTGAACGCGTTTATAGGTTGTATAATGAATGCGCTCAGGTTTTATCTGAAACTGTCTTAGCTACAGGTGGTATATATGTGAAACCTGGTGGTACTAGCAGTGGAGATGCTACTACTGCTTATGCAAACAGTGTTTTCAACATAATACAAGCCACATCTGCTAATGTTGCGCGTCTTTTGAGTGTTATAACGCGTGATATTGTATATGATGACATTAAGAGCTTGCAGTATGAATTGTACCAGCAGGTTTATAGGCGAGTCAATTTTGACCCAGCATTTGTTGAAAAGTTTTATTCTTATTTGTGTAAGAATTTCTCATTGATGATCTTGTCTGACGACGGTGTTGTTTGTTATAACAACACATTAGCCAAACAAGGTCTTGTAGCAGATATTTCTGGTTTTAGAGAAGTTCTCTACTATCAGAACAATGTTTTTATGGCTGATTCTAAATGTTGGGTTGAACCAGATTTAGAAAAAGGCCCACATGAATTTTGTTCACAGCACACAATGTTAGTGGAGGTTGATGGTGAGCCTAGATACTTGCCATATCCAGACCCATCACGTATTTTGTGTGCATGTGTTTTTGTAGATGATTTGGATAAGACAGAATCTGTGGCTGTTATGGAGCGTTATATCGCTCTTGCCATAGATGCGTACCCACTAGTACATCATGAAAATGAGGAGTACAAGAAGGTATTCTTTGTGCTTCTTTCATACATCAGAAAACTCTATCAAGAGCTTTCTCAGAATATGCTTATGGACTACTCTTTTGTAATGGATATAGATAAGGGTAGTAAATTTTGGGAACAGGAGTTCTATGAAAATATGTATAGAGCCCCTACAACATTACAGTCTTGTGGCGTTTGTGTAGTGTGTAATAGTCAAACTATATTGCGCTGTGGTAATTGTATTCGCAAACCATTTTTGTGTTGTAAGTGTTGCTATGACCATGTCATGCACACAGACCACAAAAATGTTTTGTCTATAAATCCTTACATTTGCTCACAGCCAGGTTGTGGTGAAGCAGATGTTACTAAATTGTACCTCGGAGGTATGTCATACTTCTGCGGTAATCATAAACCAAAGTTATCAATACCGTTAGTATCTAATGGTACAGTGTTTGGAATTTACAGGGCTAATTGTGCAGGTAGCGAAAATGTTGATGATTTTAATCAACTAGCTACTACTAATTGGTCTACTGTGGAACCTTATATTTTGGCAAATCGTTGTGTAGATTCGTTGAGACGCTTTGCTGCAGAGACAGTAAAAGCTACAGAAGAATTACATAAGCAACAATTTGCTAGTGCAGAAGTGAGAGAAGTACTCTCAGATCGTGAATTGATTCTGTCTTGGGAGCCAGGTAAAACCAGGCCTCCATTGAATAGAAATTATGTTTTCACTGGCTTTCACTTTACTAGAACTAGTAAAGTTCAGCTCGGTGATTTTACATTTGAAAAAGGTGAAGGTAAGGACGTTGTCTATTATCGAGCGACGTCTACTGCTAAATTGTCTGTTGGAGACATTTTTGTTTTAACCTCACACAATGTTGTTTCTCTTATAGCGCCAACGTTGTGTCCTCAGCAAACCTTTTCTAGGTTTGTGAATTTAAGACCTAATGTGATGGTACCTGCGTGTTTTGTAAATAACATTCCATTGTACCATTTAGTAGGCAAGCAGAAGCGTACTACAGTACAAGGCCCTCCTGGCAGTGGTAAATCCCATTTTGCTATAGGATTGGCGGCTTACTTTAGTAACGCCCGTGTCGTTTTTACTGCATGCTCTCATGCAGCTGTTGATGCTTTATGTGAAAAAGCTTTTAAGTTTCTTAAAGTAGATGATTGCACTCGTATAGTACCTCAAAGGACTACTATCGATTGCTTCTCTAAGTTTAAAGCTAATGACACAGGCAAAAAGTACATTTTTAGTACTATTAATGCCTTGCCAGAAGTTAGTTGTGACATTCTTTTGGTTGACGAGGTTAGTATGTTGACCAATTACGAATTGTCTTTTATTAATGGTAAGATAAACTATCAATATGTTGTGTATGTAGGTGATCCTGCTCAATTACCGGCGCCTCGTACGTTGCTTAACGGTTCACTCTCTCCAAAGGATTATAATGTTGTCACAAACCTTATGGTTTGTGTTAAACCTGACATTTTCCTTGCAAAGTGTTACCGTTGTCCTAAAGAAATTGTAGATACTGTTTCTACTCTTGTATATGATGGAAAGTTTATTGCAAATAACCCGGAATCACGTCAGTGTTTCAAGGTTATAGTTAATAATGGTAATTCTGATGTAGGACATGAAAGTGGCTCAGCCTACAACATAACTCAATTAGAATTTGTGAAAGATTTTGTCTGTCGCAATAAGGAATGGCGGGAAGCAACATTCATTTCACCTTATAATGCTATGAACCAGAGAGCCTACCGTATGCTTGGACTTAATGTTCAGACAGTAGACTCGTCTCAAGGTTCGGAGTATGATTATGTTATCTTTTGTGTTACTGCAGATTCGCAGCATGCACTGAATATTAACAGATTCAATGTAGCGCTTACAAGAGCCAAGCGTGGTATACTAGTTGTCATGCGTCAGCGTGATGAACTATATTCAGCTCTTAAGTTTATAGAGCTTGATAGTGTAGCAAGTCTGCAAGGTACAGGCTTGTTTAAAATTTGCAACAAAGAGTTTAGTGGTGTTCACCCAGCTTATGCAGTCACAACTAAGGCTCTTGCTGCAACTTATAAAGTTAATGATGAACTTGCTGCACTTGTTAACGTGGAAGCTGGTTCAGAAATAACATATAAACATCTTATTTCTTTGTTAGGGTTTAAGATGAGTGTTAATGTTGAAGGCTGCCACAACATGTTTATAACACGTGATGAGGCTATCCGCAACGTAAGAGGTTGGGTAGGTTTTGATGTAGAAGCAACACATGCTTGCGGTACTAACATTGGTACTAACCTGCCTTTCCAAGTAGGTTTCTCTACTGGTGCAGACTTTGTAGTTACGCCTGAGGGACTTGTAGATACTTCAATAGGCAATAATTTTGAGCCTGTGAATTCTAAAGCACCTCCAGGTGAACAATTTAATCACTTGAGAGCGTTATTCAAAAGTGCTAAACCTTGGCATGTTGTAAGGCCAAGGATTGTGCAAATGTTAGCGGATAACCTGTGCAACGTTTCAGATTGTGTAGTGTTTGTCACGTGGTGTCATGGCCTAGAACTAACCACTTTGCGCTATTTTGTTAAAATAGGCAAGGACCAAGTTTGTTCTTGCGGTTCTAGAGCAACAACTTTTAATTCTCATACTCAGGCTTATGCTTGTTGGAAGCATTGCTTGGGTTTTGATTTTGTTTATAATCCACTCTTAGTGGATATTCAACAGTGGGGTTATTCTGGTAACCTACAATTTAACCATGATTTGCATTGTAATGTGCATGGACACGCACATGTAGCTTCTGCGGATGCTATTATGACGCGTTGTCTTGCAATTAATAATGCATTTTGTCAAGATGTCAACTGGGATTTAACTTACCCTCATATAGCAAATGAGGATGAAGTCAATTCTAGCTGTAGATATTTACAACGCATGTATCTTAATGCATGTGTTGATGCTCTTAAAGTTAACGTTGTCTATGATATAGGCAACCCTAAAGGTATAAAATGTGTTAGACGTGGAGACTTAAATTTTAGATTCTATGATAAGAATCCAATAGTACCCAATGTCAAGCAGTTTGAGTATGACTATAATCAGCACAAAGATAAGTTTGCTGATGGTCTTTGTATGTTTTGGAATTGTAATGTGGATTGTTATCCCGACAATTCCTTAGTTTGTAGGTACGACACACGAAATTTGAGTGTGTTTAACCTACCTGGTTGTAATGGTGGTAGCTTGTATGTTAACAAGCATGCATTCCACACACCTAAATTTGATCGCACTAGCTTTCGTAATTTGAAAGCTATGCCATTCTTTTTCTATGACTCATCGCCTTGCGAGACCATTCAATTGGATGGAGTTGCGCAAGACCTTGTGTCATTAGCTACGAAAGATTGTATCACAAAATGCAACATAGGCGGTGCTGTTTGTAAAAAGCACGCACAAATGTATGCAGATTTTGTGACTTCTTATAATGCAGCTGTTACTGCTGGTTTTACTTTTTGGGTTACTAATAATTTTAACCCATATAATTTGTGGAAAAGTTTTTCAGCTCTCCAGTCTATCGACAATATTGCTTATAATATGTATAAGGGTGGTCATTATGATGCTATTGCAGGAGAAATGCCCACTATCGTAACTGGAGATAAAGTTTTTGTTATAGATCAAGGCGTAGAAAAAGCAGTTTTTTTTAATCAAACAATTCTGCCTACATCTGTAGCGTTTGAGCTGTATGCGAAGAGAAATATTCGCACACTGCCAAACAACCGTATTTTGAAAGGTTTGGGTGTAGATGTGACTAATGGATTTGTAATTTGGGATTACACGAACCAAACACCACTATACCGTAATACTGTTAAGGTATGTGCATATACAGACATAGAACCAAATGGCCTAATAGTGCTGTATGATGATAGATATGGTGATTACCAGTCTTTTCTAGCTGCTGATAATGCTGTTTTAGTTTCTACACAGTGTTACAAGCGGTATTCGTATGTAGAAATACCGTCAAACCTGCTTGTTCAGAACGGTATTCCGTTAAAAGATGGAGCGAACCTGTATGTTTATAAGCGTGTTAATGGTGCGTTTGTTACGCTACCTAACACATTAAACACACAGGGTCGCAGTTATGAAACTTTTGAACCTCGTAGTGATGTTGAGCGTGATTTTCTCGACATGTCTGAGGAGAGTTTTGTAGAAAAGTATGGTAAAGAATTAGGTCTACAGCACATACTGTATGGTGAAGTTGATAAGCCCCAATTAGGTGGTTTACACACTGTTATAGGTATGTGCAGACTTTTACGTGCGAATAAGTTGAACGCAAAGTCTGTTACTAATTCTGATTCTGATGTCATGCAAAATTATTTTGTATTGGCAGACAATGGTTCCTACAAGCAAGTGTGTACTGTTGTGGATTTGCTGCTTGATGATTTCTTAGAACTTCTTAGGAACATACTGAAAGAGTATGGTACTAATAAGTCTAAAGTTGTAACAGTGTCAATTGATTACCATAGCATAAATTTTATGACTTGGTTTGAAGATGGCATTATTAAAACATGTTATCCACAGCTTCAATCAGCATGGACGTGTGGTTATAATATGCCTGAACTTTATAAAGTTCAGAATTGTGTTATGGAACCTTGCAACATTCCTAATTATGGTGTTGGAATAGCGTTGCCAAGTGGTATTATGATGAATGTGGCAAAGTATACACAACTCTGTCAATACCTTTCGAAAACAACAATGTGTGTACCGCATAATATGCGAGTAATGCATTTTGGAGCTGGAAGTGACAAAGGAGTGGCTCCAGGTAGTACTGTTCTTAAACAATGGCTCCCAGAAGGGACACTCCTTGTCGATAATGATATTGTAGACTATGTGTCTGATGCACATGTTTCTGTGCTTTCAGATTGCAATAAATATAAGACAGAGCACAAGTTTGATCTTGTGATATCTGATATGTATACAGACAATGATTCAAAAAGAAAGCATGAAGGCGTGATAGCCAATAATGGCAATGATGACGTTTTCATATATCTCTCAAGTTTTCTTCGTAATAATTTGGCTCTAGGTGGTAGTTTTGCTGTAAAAGTGACAGAGACAAGTTGGCACGAAGTTTTATATGACATTGCACAGGATTGTGCATGGTGGACAATGTTTTGTACAGCAGTGAATGCCTCTTCTTCAGAAGCATTCTTGGTTGGTGTTAATTATTTGGGTGCAAGTGAAAAGGTTAAGGTTAGTGGAAAAACGCTGCACGCAAATTATATATTTTGGAGGAATTGTAATTATTTACAAACCTCTGCTTATAGTATATTTGACGTTGCTAAGTTTGATTTGAGATTGAAAGCAACACCAGTTGTTAATTTGAAAACTGAACAAAAGACAGACTTAGTCTTTAATTTAATTAAGTGTGGTAAGTTACTGGTAAGAGATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACTATGTAGTGCTGCTTTGTATGACAGTAGTTCTTACGTTTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGACCACCTAATGGTTGGCATTTACACGGGGGTGCTTATGCGGTAGTTAATATTTCTAGCGAATCTAATAATGCAGGCTCTTCACCTGGGTGTATTGTTGGTACTATTCATGGTGGTCGTGTTGTTAATGCTTCTTCTATAGCTATGACGGCACCGTCATCAGGTATGGCTTGGTCTAGCAGTCAGTTTTGTACTGCACACTGTAACTTTTCAGATACTACAGTGTTTGTTACACATTGTTATAAATATGATGGGTGTCCTATAACTGGCATGCTTCAAAAGAATTTTTTACGTGTTTCTGCTATGAAAAATGGCCAGCTTTTCTATAATTTAACAGTTAGTGTAGCTAAGTACCCTACTTTTAAATCATTTCAGTGTGTTAATAATTTAACATCCGTATATTTAAATGGTGATCTTGTTTACACCTCTAATGAGACCACAGATGTTACATCTGCAGGTGTTTATTTTAAAGCTGGTGGACCTATAACTTATAAAGTTATGAGAGAAGTTAAAGCCCTGGCTTATTTTGTTAATGGTACTGCACAAGATGTTATTTTGTGTGATGGATCACCTAGAGGCTTGTTAGCATGCCAGTATAATACTGGCAATTTTTCAGATGGCTTTTATCCTTTTATTAATAGTAGTTTAGTTAAGCAGAAGTTTATTGTCTATCGTGAAAATAGTGTTAATACTACTTTTACGTTACACAATTTCACTTTTCATAATGAGACTGGCGCCAACCCTAATCCTAGTGGTGTTCAGAATATTCAAACTTACCAAACACAAACAGCTCAGAGTGGTTATTATAATTTTAATTTTTCCTTTCTGAGTAGTTTTGTTTATAAGGAGTCTAATTTTATGTATGGATCTTATCACCCAAGTTGTAATTTTAGACTAGAAACTATTAATAATGGCTTGTGGTTTAATTCACTTTCAGTTTCAATTGCTTACGGTCCTCTTCAAGGTGGTTGCAAGCAATCTGTCTTTAGTGGTAGAGCAACTTGTTGTTATGCTTATTCATATGGAGGTCCTTCGCTGTGTAAAGGTGTTTATTCAGGTGAGTTAGATCTTAATTTTGAATGTGGACTGTTAGTTTATGTTACTAAGAGCGGTGGCTCTCGTATACAAACAGCCACTGAACCGCCAGTTATAACTCGACACAATTATAATAATATTACTTTAAATACTTGTGTTGATTATAATATATATGGCAGAACTGGCCAAGGTTTTATTACTAATGTAACCGACTCAGCTGTTAGTTATAATTATCTAGCAGACGCAGGTTTGGCTATTTTAGATACATCTGGTTCCATAGACATCTTTGTTGTACAAGGTGAATATGGTCTTACTTATTATAAGGTTAACCCTTGCGAAGATGTCAACCAGCAGTTTGTAGTTTCTGGTGGTAAATTAGTAGGTATTCTTACTTCACGTAATGAGACTGGTTCTCAGCTTCTTGAGAACCAGTTTTACATTAAAATCACTAATGGAACACGTCGTTTTAGACGTTCTATTACTGAAAATGTTGCAAATTGCCCTTATGTTAGTTATGGTAAGTTTTGTATAAAACCTGATGGTTCAATTGCCACAATAGTACCAAAACAATTGGAACAGTTTGTGGCACCTTTACTTAATGTTACTGAAAATGTGCTCATACCTAACAGTTTTAATTTAACTGTTACAGATGAGTACATACAAACGCGTATGGATAAGGTCCAAATTAATTGTCTGCAGTATGTTTGTGGCAATTCTCTGGATTGTAGAGATTTGTTTCAACAATATGGGCCTGTTTGTGACAACATATTGTCTGTAGTAAATAGTATTGGTCAAAAAGAAGATATGGAACTTTTGAATTTCTATTCTTCTACTAAACCGGCTGGTTTTAATACACCATTTCTTAGTAATGTTAGCACTGGTGAGTTTAATATTTCTCTTCTGTTAACAACTCCTAGTAGTCCTAGAAGGCGTTCTTTTATTGAAGACCTTCTATTTACAAGCGTTGAATCTGTTGGATTACCAACAGATGACGCATACAAAAATTGCACTGCAGGACCTTTAGGTTTTCTTAAGGACCTTGCGTGTGCTCGTGAATATAATGGTTTGCTTGTGTTGCCTCCCATTATAACAGCAGAAATGCAAATTTTGTATACTAGTTCTCTAGTAGCTTCTATGGCTTTTGGTGGTATTACTGCAGCTGGTGCTATACCTTTTGCCACACAACTGCAGGCTAGAATTAATCACTTGGGTATTACCCAGTCACTTTTGTTGAAGAATCAAGAAAAAATTGCTGCTTCCTTTAATAAGGCCATTGGTCGTATGCAGGAAGGTTTTAGAAGTACATCTCTAGCATTACAACAAATTCAAGATGTTGTTAATAAGCAGAGTGCTATTCTTACTGAGACTATGGCATCACTTAATAAAAATTTTGGTGCTATTTCTTCTATGATTCAAGAAATCTACCAGCAACTTGACGCCATACAAGCAAATGCTCAAGTGGATCGTCTTATAACTGGTAGATTGTCATCACTTTCTGTTTTAGCATCTGCTAAGCAGGCGGAGCATATTAGAGTGTCACAACAGCGTGAGTTAGCTACTCAGAAAATTAATGAGTGTGTTAAGTCACAGTCTATTAGGTACTCCTTTTGTGGTAATGGACGACATGTTCTAACCATACCGCAAAATGCACCTAATGGTATAGTGTTTATACACTTTTCTTATACTCCAGATAGTTTTGTTAATGTTACTGCAATAGTGGGTTTTTGTGTAAAGCCAGCTAATGCTAGTCAGTATGCAATAGTACCCGCTAATGGTAGGGGTATTTTTATACAAGTTAATGGTAGTTACTACATCACAGCACGAGATATGTATATGCCAAGAGCTATTACTGCAGGAGATATAGTTACGCTTACTTCTTGTCAAGCAAATTATGTAAGTGTAAATAAGACCGTCATTACTACATTCGTAGACAATGATGATTTTGATTTTAATGACGAATTGTCAAAATGGTGGAATGACACTAAGCATGAGCTACCAGACTTTGACAAATTCAATTACACAGTACCTATACTTGACATTGATAGTGAAATTGATCGTATTCAAGGCGTTATACAGGGTCTTAATGACTCTTTAATAGACCTTGAAAAACTTTCAATACTCAAAACTTATATTAAGTGGCCTTGGTATGTGTGGTTAGCCATAGCTTTTGCCACTATTATCTTCATCTTAATACTAGGATGGGTTTTCTTCATGACTGGATGTTGTGGTTGTTGTTGTGGATGCTTTGGCATTATGCCTCTAATGAGTAAGTGTGGTAAGAAATCTTCTTATTACACGACTTTTGATAACGATGTGGTAACTTAACAATACAGACCTAAAAAGTCTGTTTAATGATTCAAAGTCCCACGTCCTTCCTAATAGTATTAATTTTTCTTTGGTGTAAACTTGTACTAAGTTGTTTTAGAGAGTTTATTATAGCGCTCCAACAACTAATACAAGTTTTACTCCAAATTATCAATAGTAACTTACAGCCTAGACTGACCCTTTGTCACAGTCTAGACTAATGTTAAACTTAGAAGCAATTATTGAAACTGGTGAGCAAGTGATTCAAAAAATCAGTTTCAATTTACAGCATATTTCAAGTGTATTAAACACAGAAGTATTTGACCCCTTTGACTATTGTTATTACAGAGGAGGTAATTTTTGGGAAATAGAGTCAGCTGAAGATTGTTCAGGTGATGATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGGAAAATGGAAGTTTTCTAACAGCGCTTTATATATTTGTAGGATTTTTAGCACTTTATCTTCTAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTGTACAGGCTGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATATAAGTATACATATGGTAGAAAACTTAACAATCCGGAATTAGAAGCAGTTATTGTCAACGAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGACTTTGAACAGTCAGTTGAGCTTTTTAAAGAGTATAATTTATTTATAACTGCATTCTTGTTGTTCTTAACCATAATACTTCAGTATGGCTATGCAACAAGAAGTAAGTTTATTTATATACTGAAAATGATAGTGTTATGGTGCTTTTGGCCCCTTAACATTGCAGTAGGTGTAATTTCATGTATATACCCACCAAACACAGGAGGTCTTGTCGCAGCGATAATACTTACAGTGTTTGCGTGTCTGTCTTTTGTAGGTTATTGGATCCAGAGTATTAGACTCTTTAAGCGGTGTAGGTCATGGTGGTCATTTAACCCAGAATCTAATGCCGTAGGTTCAATACTCCTAACTAATGGTCAACAATGTAATTTTGCTATAGAGAGTGTGCCAATGGTGCTTTCTCCAATTATAAAGAATGGTGTTCTTTATTGTGAGGGTCAGTGGCTTGCTAAGTGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGATATATTTGTTTGTACACCGGATAGACGTAATATCTACCGTATGGTGCAGAAATATACTGGTGACCAAAGCGGAAATAAGAAACGGTTTGCTACGTTTGTCTATGCAAAGCAGTCAGTAGATACTGGCGAGCTAGAAAGTGTAGCAACAGGAGGGAGTAGTCTTTACACCTAAATGTGTGTGTGTAGAGAGTATTTAAAATTATTCTTTAATAGTGCCTCTATTTTAAGAGCGCATAATAGTATTATTTTTGAGGATATTAATATAAATCCTCTCTGTTTTATACTCTCTTTTCAAGAGCTATTATTTAAAAAACAGTTTTTCCACTCTTTTGTGCCAAAAACTATTGTTGTTAATGGTGTAACCTTTCAAGTAGATAATGGAAAAGTCTACTACGAAGGAAAACCAATTTTTCAGAAAGGTTGTTGTAGGTTGTGGTTGAGTTATAAAAAAGATTAAACTACCTACTACACTTATTTTTATAAGAGGCGTTTTATCTTACAAGCGCTTAATAAATACGGACGATGAAATGGCTGACTAGTTTTGTAAGGGCAGTTATTTCATGTTATAAACCCCTATTATTAACTCAATTAAGAGTATTAGATAGGTTAATCTTAGATCATGGACCAAAACACATCTTAACGTGTGTTAGGTGCGTGATTTTGTTTCAATTAGATTTAGTTTATAGGTTGGCGTATACGCCTACTCAATCGCTGGTATGAATAATAGTAAAGATAATCCTTTTTGCGGAGCAATAGCAAGAAAAGCGCGAATTTATCTGAGAGAAGGATTAGATTGTGTTTACTTTCTTAACAAAGCAGGACAAGCAGAGTCTTGTCCCGCGTGTACCTCTCTAGTATTCCAGGGGAAAACTTGTGAGGAACACAAATATAATAATAATCTTTTGTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGGAAAGACAGATGCCCCAGCTCCAGTCATCAAACTAGGAGGACCAAAGCCACCTAAAGTTGGTTCTTCTGGAAATGTATCTTGGTTTCAAGCAATAAAAGCCAAGAAGTTAAATTCACCTCCGCCTAAGTTTGAAGGTAGCGGTGTTCCTGATAATGAAAATCTAAAACCAAGTCAGCAGCATGGATATTGGAGACGCCAAGCTAGGTTTAAGCCAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAGATGCTTGGTATTTTTACTATACTGGAACAGGACCAGCCGCTAACCTGAATTGGGGTGATAGCCAAGATGGTATAGTGTGGGTTGCTGGTAAGGGTGCTGATACTAAATTTAGATCTAATCAGGGTACTCGTGACTCTGACAAGTTTGACCAATATCCGCTACGGTTTTCAGACGGAGGACCTGATGGTAATTTCCGTTGGGATTTCATTCCTCTGAATCGTGGCAGGAGTGGGAGATCAACAGCAGCTTCATCAGCAGCATCTAGTAGAGCACCATCACGTGAAGTTTCGCGTGGTCGCAGGAGTGGTTCTGAAGATGATCTTATTGCTCGTGCAGCAAGGATAATTCAGGATCAGCAGAAGAAGGGTTCTCGCATTACAAAGGCTAAGGCTGATGAAATGGCTCACCGCCGGTATTGCAAGCGCACTATTCCACCTAATTATAAGGTTGATCAAGTGTTTGGTCCCCGTACTAAAGGTAAGGAGGGAAATTTTGGTGATGACAAGATGAATGAGGAAGGTATTAAGGATGGGCGCGTTACAGCAATGCTCAACCTAGTTCCTAGCAGCCATGCTTGTCTTTTCGGAAGTAGAGTGACGCCCAGACTTCAACCAGATGGGCTGCACTTGAAATTTGAATTTACTACTGTGGTCCCACGTGATGATCCGCAGTTTGATAATTATGTAAAAATTTGTGATCAGTGTGTTGATGGTGTAGGAACACGTCCAAAAGATGATGAACCAAGACCAAAGTCACGCTCAAGTTCAAGACCTGCAACAAGAGGAAATTCTCCAGCGCCAAGACAGCAGCGCCCTAAGAAGGAGAAAAAGCCAAAGAAGCAGGATGATGAAGTGGATAAAGCATTGACCTCAGATGAGGAGAGGAACAATGCACAGCTGGAATTTGATGATGAACCCAAGGTAATTAACTGGGGGGATTCAGCCCTAGGAGAGAATGAACTTTGAGTAAAATTCAATAGTAAGAGTTAAGGAAGATAGGCATGTAGCTTGATTACCTACATGTCTATCGCCAGGGAAATGTCTAATTTGTCTACTTAGTAGCCTGGAAACGAACGGTAGACCCTTAGATTTTAATTTAGTTTAATTTTTAGTTTAGTTTAAGTTAGTTTAGAGTAGGTATAAAGATGCCAGTGCCGGGGCCACGCGGAGTACGACCGAGGGTACAGCACTAGGACGCCCATTAGGGGAAGAGCTAAATTTTAGTTTAAGTTAAGTTTAATTGGCTATGTATAGTTAAAATTTATAGGCTAGTATAGAGTTAGAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
辅助蛋白质
所有冠状病毒编码一组未知功能的辅助蛋白基因，其不是体外复制必需的，但是可以在发病机理中起作用。IBV编码两个辅助基因，即基因3和5，它们都分别表达两种辅助蛋白3a，3b和5a，5b。
IBV MK41中基因3的核苷酸序列和辅助蛋白3a和3b的氨基酸序列分别以SEQ IDNO:2-4提供。
SEQ ID NO:2(基因3核苷酸序列-SEQ ID NO:1的核苷酸23831至24539)
CTTAACAATACAGACCTAAAAAGTCTGTTTAATGATTCAAAGTCCCACGTCCTTCCTAATAGTATTAATTTTTCTTTGGTGTAAACTTGTACTAAGTTGTTTTAGAGAGTTTATTATAGCGCTCCAACAACTAATACAAGTTTTACTCCAAATTATCAATAGTAACTTACAGCCTAGACTGACCCTTTGTCACAGTCTAGACTAATGTTAAACTTAGAAGCAATTATTGAAACTGGTGAGCAAGTGATTCAAAAAATCAGTTTCAATTTACAGCATATTTCAAGTGTATTAAACACAGAAGTATTTGACCCCTTTGACTATTGTTATTACAGAGGAGGTAATTTTTGGGAAATAGAGTCAGCTGAAGATTGTTCAGGTGATGATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGGAAAATGGAAGTTTTCTAACAGCGCTTTATATATTTGTAGGATTTTTAGCACTTTATCTTCTAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTGTACAGGCTGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATATAAGTATACATATGGTAGAAAACTTAACAATCCGGAATTAGAAGCAGTTATTGTCAACGAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGA
SEQ ID NO:3(辅助蛋白3a氨基酸序列)
MIQSPTSFLIVLIFLWCKLVLSCFREFIIALQQLIQVLLQIINSNLQPRLTLCHSLD
SEQ ID NO:4(辅助蛋白3b氨基酸序列)
MLNLEAIIETGEQVIQKISFNLQHISSVLNTEVFDPFDYCYYRGGNFWEIESAEDCSGDDEFIE
复制酶
除结构和辅助基因外，三分之二的冠状病毒基因组包含复制酶基因(位于基因组的5’端)，其表达为两个多蛋白pp1a和pp1ab，其中pp1ab是由于-1核糖体移位机制所致的pp1a扩展产物。两种多蛋白被两类病毒编码的蛋白酶切割，通常产生16种非结构蛋白(nsp1-16)；IBV缺乏nsp1，从而编码nsp2-16。
因此，IBV中的基因1编码15个(其他冠状病毒中的16个)非结构蛋白(nsp2-16)，其与RNA复制和转录相关。
术语“复制酶蛋白”在本文中用于指pp1a和pp1ab多蛋白或单独的nsp亚基。
术语“复制酶基因”在本文中用于指编码复制酶蛋白质的核酸序列。
表1中提供了冠状病毒nsp蛋白功能的概述。
表1
Nsp-3是由通过无序接头分开的许多独特的域组成的大蛋白，包括遍在蛋白样域、酸性域、木瓜蛋白酶样蛋白酶(PL pro)域、多个跨膜域和大域。大域是具有侧翼有位于nsp-3N端的螺旋的中心片层的球状域。它含有ADP-核糖-1-磷酸酶(ADRP)活性，并与各种形式的ADP-核糖结合。该域在冠状病毒中高度保守，但仅在几种其他病毒科中发现。
IBV M41中nsp-3的核苷酸和蛋白质序列分别以SEQ ID NO:5和6提供。
SEQ ID NO:5(nsp-3核苷酸序列-SEQ ID NO:1的核苷酸2548-7329)
GGTAAAACTGTCACCTTTGGAGAAACTACTGTGCAAGAAATACCACCACCTGATGTTGTGTTTATTAAGGTTAGCATTGAGTGTTGTGGTGAACCATGGAATACAATCTTCAAAAAGGCTTATAAGGAGCCCATTGAAGTAGAGACAGACCTCACAGTTGAACAATTGCTCTCTGTGGTCTATGAGAAAATGTGTGATGATCTCAAGCTGTTTCCGGAGGCTCCAGAACCACCACCATTTGAGAATGTCACACTTGTTGATAAGAATGGTAAAGATTTGGATTGCATAAAATCATGCCATCTGATCTATCGTGATTATGAGAGCGATGATGACATCGAGGAAGAAGATGCAGAAGAATGTGACACGGATTCAGGTGATGCTGAGGAGTGTGACACTAATTCAGAATGTGAAGAAGAAGATGAGGATACTAAAGTGTTGGCTCTTATACAAGACCCGGCAAGTAACAAATATCCTCTGCCTCTTGATGATGATTATAGCGTCTACAATGGATGTATTGTTCATAAGGACGCTCTCGATGTTGTGAATTTACCATCTGGTGAAGAAACCTTTGTTGTCAATAACTGCTTTGAAGGGGCTGTTAAAGCTCTTCCGCAGAAAGTTATTGATGTTCTAGGTGACTGGGGTGAGGCTGTTGATGCGCAAGAACAATTGTGTCAACAAGAATCAACTCGGGTCATATCTGAGAAATCAGTTGAGGGTTTTACTGGTAGTTGTGATGCAATGGCTGAACAAGCTATTGTTGAAGAGCAGGAAATAGTACCTGTTGTTGAACAAAGTCAGGATGTAGTTGTTTTTACACCTGCAGACCTAGAAGTTGTTAAAGAAACAGCAGAAGAGGTTGATGAGTTTATTCTCATTTCTGCTGTCCCTAAAGAAGAAGTTGTGTCTCAGGAGAAAGAGGAGCCACAGGTTGAGCAAGAGCCTACCCTAGTTGTTAAAGCACAACGTGAGAAGAAGGCTAAAAAGTTCAAAGTTAAACCAGCTACATGTGAAAAACCCAAATTTTTGGAGTACAAAACATGTGTGGGTGATTTGGCTGTTGTAATTGCCAAAGCATTGGATGAGTTTAAAGAGTTCTGCATTGTAAACGCTGCAAATGAGCACATGTCGCATGGTGGTGGCGTTGCAAAGGCAATTGCAGACTTTTGTGGACCGGACTTTGTTGAATATTGCGCGGACTATGTTAAGAAACATGGTCCACAGCAAAAACTTGTCACACCTTCATTTGTTAAAGGCATTCAATGTGTGAATAATGTTGTAGGACCTCGCCATGGAGACAGCAACTTGCGTGAGAAGCTTGTTGCTGCTTACAAGAGTGTTCTTGTAGGTGGAGTGGTTAACTATGTTGTGCCAGTTCTCTCATCAGGGATTTTTGGTGTAGATTTTAAAATATCAATAGATGCTATGCGCGAAGCTTTTAAAGGTTGTGCCATACGCGTTCTTTTATTTTCTCTGAGTCAAGAACACATCGATTATTTCGATGCAACTTGTAAGCAGAAGACAATTTATCTTACGGAGGATGGTGTTAAATACCGCTCTGTTGTTTTAAAACCTGGTGATTCTTTGGGTCAATTTGGACAGGTTTTTGCAAGAAATAAGGTAGTCTTTTCGGCTGATGATGTTGAGGATAAAGAAATCCTCTTTATACCCACAACTGACAAGACTATTCTTGAATATTATGGTTTAGATGCGCAAAAGTATGTAACATATTTGCAAACGCTTGCGCAGAAATGGGATGTTCAATATAGAGACAATTTTGTTATATTAGAGTGGCGTGACGGAAATTGCTGGATTAGTTCAGCAATAGTTCTCCTTCAAGCTGCTAAAATTAGATTTAAAGGTTTTCTTGCAGAAGCATGGGCTAAACTGTTGGGTGGAGATCCTACAGACTTTGTTGCCTGGTGTTATGCAAGTTGCAATGCTAAAGTAGGTGATTTTTCAGATGCTAATTGGCTTTTGGCCAATTTAGCAGAACATTTTGACGCAGATTACACAAATGCACTTCTTAAGAAGTGTGTGTCGTGCAATTGTGGTGTTAAGAGTTATGAACTTAGGGGTCTTGAAGCCTGTATTCAGCCAGTTCGAGCACCTAATCTTCTACATTTTAAAACGCAATATTCAAATTGCCCAACCTGTGGTGCAAGTAGTACGGATGAAGTAATAGAAGCTTCATTACCGTACTTATTGCTTTTTGCTACTGATGGTCCTGCTACAGTTGATTGTGATGAAAATGCTGTAGGGACTGTTGTTTTCATTGGCTCTACTAATAGTGGCCATTGTTATACACAAGCCGATGGTAAGGCTTTTGACAATCTTGCTAAGGATAGAAAATTTGGAAGGAAGTCGCCTTACATTACAGCAATGTATACACGTTTTTCTCTTAGGAGTGAAAATCCCCTACTTGTTGTTGAACATAGTAAGGGTAAAGCTAAAGTAGTAAAAGAAGATGTTTCTAACCTTGCTACTAGTTCTAAAGCCAGTTTTGACGATCTTACTGACTTTGAACAGTGGTATGATAGCAACATCTATGAGAGTCTTAAAGTGCAGGAGACACCTGATAATCTTGATGAATATGTGTCATTTACGACAAAGGAAGATTCTAAGTTGCCACTGACACTTAAAGTTAGAGGTATCAAATCAGTTGTTGACTTTAGGTCTAAGGATGGTTTTACTTATAAGTTAACACCTGATACTGATGAAAATTCAAAAACACCAGTCTACTACCCAGTCTTGGATTCTATTAGTCTTAGGGCAATATGGGTTGAAGGCAGTGCTAATTTTGTTGTTGGGCATCCAAATTATTATAGTAAGTCTCTCCGAATTCCCACGTTTTGGGAAAATGCCGAGAGCTTTGTTAAAATGGGTTATAAAATTGATGGTGTAACTATGGGCCTTTGGCGTGCAGAACACCTTAATAAACCTAATTTGGAGAGAATTTTTAACATTGCTAAGAAAGCTATTGTTGGATCTAGTGTTGTTACTACGCAGTGTGGTAAAATACTAGTTAAAGCAGCTACATACGTTGCCGATAAAGTAGGTGATGGTGTAGTTCGCAATATTACAGATAGAATTAAGGGTCTTTGTGGATTCACACGTGGCCATTTTGAAAAGAAAATGTCCCTACAATTTCTAAAGACACTTGTGTTCTTTTTCTTTTATTTCTTAAAGGCTAGTGCTAAGAGTTTAGTTTCTAGCTATAAGATTGTGTTATGTAAGGTGGTGTTTGCTACCTTACTTATAGTGTGGTTTATATACACAAGTAATCCAGTAGTGTTTACTGGAATACGTGTGCTAGACTTCCTATTTGAAGGTTCTTTATGTGGTCCTTATAATGACTACGGTAAAGATTCTTTTGATGTGTTACGCTATTGTGCAGGTGATTTTACTTGTCGTGTGTGTTTACATGATAGAGATTCACTTCATCTGTACAAACATGCTTATAGCGTAGAACAAATTTATAAGGATGCAGCTTCTGGCATTAACTTTAATTGGAATTGGCTTTATTTGGTCTTTCTAATATTATTTGTTAAGCCAGTGGCAGGTTTTGTTATTATTTGTTATTGTGTTAAGTATTTGGTATTGAGTTCAACTGTGTTGCAAACTGGTGTAGGTTTTCTAGATTGGTTTGTAAAAACAGTTTTTACCCATTTTAATTTTATGGGAGCGGGATTTTATTTCTGGCTCTTTTACAAGATATACGTACAAGTGCATCATATATTGTACTGTAAGGATGTAACATGTGAAGTGTGCAAGAGAGTTGCACGCAGCAACAGGCAAGAGGTTAGCGTTGTAGTTGGTGGACGCAAGCAAATAGTGCATGTTTACACTAATTCTGGCTATAACTTTTGTAAGAGACATAATTGGTATTGTAGAAATTGTGATGATTATGGTCACCAAAATACATTTATGTCCCCTGAAGTTGCTGGCGAGCTTTCTGAAAAGCTTAAGCGCCATGTTAAACCTACAGCATATGCTTACCACGTTGTGTATGAGGCATGCGTGGTTGATGATTTTGTTAATTTAAAATATAAGGCTGCAATTCCTGGTAAGGATAATGCATCTTCTGCTGTTAAGTGTTTCAGTGTTACAGATTTTTTAAAGAAAGCTGTTTTTCTTAAGGAGGCATTGAAATGTGAACAAATATCTAATGATGGTTTTATAGTGTGTAATACACAGAGTGCGCATGCACTAGAGGAAGCAAAGAATGCAGCCGTCTATTATGCGCAATATCTGTGTAAGCCAATACTTATACTTGACCAGGCACTTTATGAGCAATTAATAGTAGAGCCTGTGTCTAAGAGTGTTATAGATAAAGTGTGTAGCATTTTGTCTAATATAATATCTGTAGATACTGCAGCTTTAAATTATAAGGCAGGCACACTTCGTGATGCTCTGCTTTCTATTACTAAAGACGAAGAAGCCGTAGATATGGCTATCTTCTGCCACAATCATGAAGTGGAATACACTGGTGACGGTTTTACTAATGTGATACCGTCATATGGTATGGACACTGATAAGTTGACACCTCGTGATAGAGGGTTTTTGATAAATGCAGATGCTTCTATTGCTAATTTAAGAGTCAAAAATGCTCCTCCGGTAGTATGGAAGTTTTCTGATCTTATTAAATTGTCTGACAGTTGCCTTAAATATTTAATTTCAGCTACTGTCAAGTCAGGAGGTCGTTTCTTTATAACAAAGTCTGGTGCTAAACAAGTTATTTCTTGTCATACCCAGAAACTGTTGGTAGAGAAAAAGGCAGGT
SEQ ID NO:6(nsp-3氨基酸序列)
GKTVTFGETTVQEIPPPDVVFIKVSIECCGEPWNTIFKKAYKEPIEVETDLTVEQLLSVVYEKMCDDLKLFPEAPEPPPFENVTLVDKNGKDLDCIKSCHLIYRDYESDDDIEEEDAEECDTDSGDAEECDTNSECEEEDEDTKVLALIQDPASNKYPLPLDDDYSVYNGCIVHKDALDVVNLPSGEETFVVNNCFEGAVKALPQKVIDVLGDWGEAVDAQEQLCQQESTRVISEKSVEGFTGSCDAMAEQAIVEEQEIVPVVEQSQDVVVFTPADLEVVKETAEEVDEFILISAVPKEEVVSQEKEEPQVEQEPTLVVKAQREKKAKKFKVKPATCEKPKFLEYKTCVGDLAVVIAKALDEFKEFCIVNAANEHMSHGGGVAKAIADFCGPDFVEYCADYVKKHGPQQKLVTPSFVKGIQCVNNVVGPRHGDSNLREKLVAAYKSVLVGGVVNYVVPVLSSGIFGVDFKISIDAMREAFKGCAIRVLLFSLSQEHIDYFDATCKQKTIYLTEDGVKYRSVVLKPGDSLGQFGQVFARNKVVFSADDVEDKEILFIPTTDKTILEYYGLDAQKYVTYLQTLAQKWDVQYRDNFVILEWRDGNCWISSAIVLLQAAKIRFKGFLAEAWAKLLGGDPTDFVAWCYASCNAKVGDFSDANWLLANLAEHFDADYTNALLKKCVSCNCGVKSYELRGLEACIQPVRAPNLLHFKTQYSNCPTCGASSTDEVIEASLPYLLLFATDGPATVDCDENAVGTVVFIGSTNSGHCYTQADGKAFDNLAKDRKFGRKSPYITAMYTRFSLRSENPLLVVEHSKGKAKVVKEDVSNLATSSKASFDDLTDFEQWYDSNIYESLKVQETPDNLDEYVSFTTKEDSKLPLTLKVRGIKSVVDFRSKDGFTYKLTPDTDENSKTPVYYPVLDSISLRAIWVEGSANFVVGHPNYYSKSLRIPTFWENAESFVKMGYKIDGVTMGLWRAEHLNKPNLERIFNIAKKAIVGSSVVTTQCGKILVKAATYVADKVGDGVVRNITDRIKGLCGFTRGHFEKKMSLQFLKTLVFFFFYFLKASAKSLVSSYKIVLCKVVFATLLIVWFIYTSNPVVFTGIRVLDFLFEGSLCGPYNDYGKDSFDVLRYCAGDFTCRVCLHDRDSLHLYKHAYSVEQIYKDAASGINFNWNWLYLVFLILFVKPVAGFVIICYCVKYLVLSSTVLQTGVGFLDWFVKTVFTHFNFMGAGFYFWLFYKIYVQVHHILYCKDVTCEVCKRVARSNRQEVSVVVGGRKQIVHVYTNSGYNFCKRHNWYCRNCDDYGHQNTFMSPEVAGELSEKLKRHVKPTAYAYHVVYEACVVDDFVNLKYKAAIPGKDNASSAVKCFSVTDFLKKAVFLKEALKCEQISNDGFIVCNTQSAHALEEAKNAAVYYAQYLCKPILILDQALYEQLIVEPVSKSVIDKVCSILSNIISVDTAALNYKAGTLRDALLSITKDEEAVDMAIFCHNHEVEYTGDGFTNVIPSYGMDTDKLTPRDRGFLINADASIANLRVKNAPPVVWKFSDLIKLSDSCLKYLISATVKSGGRFFITKSGAKQVISCHTQKLLVEKKAG
减少的致病性
本发明的活减毒冠状病毒包含至少一种突变，该突变使得病毒与相应的野生型冠状病毒相比具有降低的致病性。
如本文所用，术语“减毒的”是指表现出所述降低的致病性并且可以归类为非毒性的病毒。活的减毒病毒是一种弱化的复制型病毒，其仍然能够刺激免疫应答并产生免疫力但不引起实际疾病。
术语“致病性”在本文中根据其正常含义使用，指病毒在受试者中引起疾病的可能性。通常，冠状病毒的致病性通过测定疾病相关症状来确定，例如哮鸣、发咔嗒声和气管纤毛活性减少。
术语“降低的致病性”用于描述与相应的野生型冠状病毒相比冠状病毒的致病性水平降低、减轻或减少。
在一个实施方案中，本发明的冠状病毒与衍生它的亲本M41-CK病毒或对照冠状病毒相比具有降低的致病性。对照冠状病毒可以是具有已知致病性的冠状病毒。
可以使用本领域公知的方法评估冠状病毒的致病性。通常，通过测定受病毒攻击的受试者(例如鸡)的临床症状来评估致病性。
作为说明，可以通过鼻或眼接种在8-24天龄时对鸡进行攻击。可以在感染后3-10天评估与IBV感染相关的临床症状。通常评估以确定冠状病毒(例如IBV)的致病性的临床症状包括喘息、打咳嗽、哮鸣、发咔嗒声，压低(depression)、皱褶羽毛和气管纤毛活性丧失。
与相应的野生型冠状病毒相比，本发明的减毒冠状病毒可以引起降低的临床症状水平。
例如，减毒冠状病毒可以引起每只禽类每分钟的咔嗒声数目，其是由野生型病毒引起的咔嗒声数目的小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％。
根据本发明的减毒冠状病毒可以在感染野生型病毒的禽群中禽类数目的小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％中引起哮鸣。
根据本发明的减毒冠状病毒可以导致气管纤毛活性，其是未感染禽类中气管纤毛活性水平的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
根据本发明的减毒冠状病毒可以比野生型冠状病毒以更低的水平引起如表2中所定义的临床症状。
表2：基于临床体征的IBV严重性限度：
表2
本发明的减毒冠状病毒可以在卵内以非致病水平复制。
在开发卵内施用于鸡胚的疫苗时，必须注意两点：母体抗体对疫苗的影响以及疫苗对胚胎的影响。已知母体抗体干扰主动免疫。例如，具有轻度株的疫苗在施用于具有母体抗体的肉鸡时不诱导保护性抗体水平，因为这些株由母体抗体库中和。
因此，病毒颗粒在复制和繁殖时必须足够有效，以确保它不被母体衍生的针对病毒的抗体中和。母体衍生的抗体是有效抗体的有限库，其随着鸡成长而减少，并且以此方式中和病毒不等于建立对胚胎/鸡的长期免疫。为了形成对病毒的长期免疫力，胚胎和孵化的鸡必须形成适当的保护性免疫应答，这与母体抗体的效果不同。
为了可用于卵内疫苗接种，病毒也必须不以导致其对胚胎致病性的水平复制和繁殖。
就胚胎而言降低的致病性可以意味着减毒的冠状病毒与相应的野生型对照冠状病毒相比引起孵化率降低较少。因此，在本发明的上下文中，术语“对胚胎不致病的”可以指与对照冠状病毒相比时“不引起降低的孵化率”。
可以使用本领域已知的方法鉴定合适的减毒冠状病毒。例如，可以进行在具有或没有母体衍生的抗体的情况下在胚胎的卵内接种疫苗后的比较攻击实验(即，其中产蛋鸡已经或尚未针对IBV接种疫苗)。
如果减毒的冠状病毒以过高的水平繁殖，则胚胎不会孵化或孵化后不会存活(即病毒对胚胎是致病的)。对胚胎致病的病毒可以杀死胚胎。
如果减毒的冠状病毒表明病毒复制和繁殖的减少太大，则病毒将被母体衍生的抗体中和。因此，用IBV对鸡的随后攻击将导致受攻击的鸡的临床症状(例如哮鸣、发咔嗒声、纤毛活性丧失)的形成和疾病发作，因为它将不能形成针对病毒的有效免疫力。
变体
如本文所用，术语“变体”与“突变体”同义，并且指与相应的野生型序列相比不同的核酸或氨基酸序列。
变体/突变体序列可以天然产生，或者可以人工创建(例如通过定点诱变)。突变体可以与野生型序列的相应部分具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。突变体可以在野生型序列的相应部分上具有20、10、5、4、3、2或1个突变。
术语“野生型”用于指具有分别与天然基因或蛋白质(即病毒基因或蛋白质)相同的核苷酸或氨基酸序列的基因或蛋白质。
同一性比较可以用眼，或者更通常借助于容易可获得的序列比较程序进行。这些商品化的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％同一性。适合于进行此类比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit包(University of Wisconsin,U.S.A.；Devereuxet al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST包(参见Ausubel et al.,1999如上–第18章)、FASTA(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS比较工具套件ClustalX(参见Larkin et al.(2007)Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatics,23:2947-2948)。BLAST和FASTA都可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等，1999同上，第7-58至7-60页)。但是，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。称为BLAST 2Sequences的新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS MicrobiolLett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
序列可以具有氨基酸残基的一个或多个缺失、插入或取代，其产生沉默变化并产生功能等同的分子。只要保留活性，可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；含有具有相似亲水性值的不带电荷的极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以进行保守取代，例如根据下表。第二列中相同块中的氨基酸并且优选在第三列中的相同行中的氨基酸可以彼此取代：
Ammayappan et al(Arch Virol(2009)154:495-499)报告了负责IBV株ArkansasDPI减毒的序列变化的鉴定。该研究在含胚卵中的病毒的多次传代，约100次后鉴定出多种IBV蛋白中的17种氨基酸变化。没有研究减毒病毒(Ark DPI 101)是否能够在卵内在针对病毒的母体衍生的抗体存在下复制，而对胚胎不是致病的。鉴于该病毒是通过SPF含胚卵中的多次传代产生的，对于经典IBV疫苗类似的方法，可能的是此种病毒对胚胎是致病的。若母鸡用类似的血清型接种疫苗，则病毒也可能对母体衍生的抗体敏感。
本发明的冠状病毒包含非结构蛋白质nsp-3中的突变和/或辅助蛋白质3a和/或3b的缺失，该突变引起病毒与野生型冠状病毒相比具有降低的致病性。
nsp-3中的突变可以包含nsp-3的腺苷二磷酸-核糖-1’-磷酸酶(ADRP)区域中的突变。nsp-3的ADRP区可以包含SEQ ID NO:6的残基332至491或由SEQ ID NO:6的残基332至491组成(例如，由SEQ ID NO:5的核苷酸994至1473编码)。因此，与SEQ ID NO:6的332至491位所示的氨基酸相比，nsp-3中的突变可以包含一个或多个氨基酸突变。nsp-3中的突变与SEQ ID NO:6的位置332至491、350至470、350至450、350至425、350至400、350至380、360至380或370至380所示的氨基酸相比可以包含一个或多个氨基酸突变。nsp-3中的突变与SEQID NO:6的370-380位所示的氨基酸相比可以包含一个或多个氨基酸突变。
nsp-3中的突变可以包含选自下组的一个或多个氨基酸突变：
a)SEQ ID NO:6中373位的Asn(N)至Ala(A)；和
b)SEQ ID NO:6中379位的Gly(G)至Ser(S)。
nsp-3中的突变可以包含一个或多个核苷酸取代，其编码如本文所述的氨基酸突变。
nsp-3中的突变可以包含选自下组的一个或多个核苷酸取代：
a)与SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1116处的A至G和核苷酸位置1117处的A至C；和
b)与SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1138处的G至A。
如本文所用，术语“取代”与术语突变同义，并且意指鉴定位置处的核苷酸不同于野生型核苷酸序列的核苷酸。
nsp-3中的突变可以包含SEQ ID NO:3中373位的氨基酸突变Asn(N)至Ala(A)。
nsp-3中的突变可以包含SEQ ID NO:3中379位的氨基酸突变Gly(G)至Ser(S)。
nsp-3中的突变可以包含SEQ ID NO:3中373位的氨基酸突变Asn(N)至Ala(A)和379位的Gly(G)至Ser(S)。
也可以在核苷酸水平上定义减毒的冠状病毒。
例如，本发明的减毒冠状病毒的核苷酸序列可以包含选自下组的一种或多种突变：
a)与SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1116处的A至G和核苷酸位置1117处的A至C；和
b)与SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1138处的G至A。
nsp-3中的突变与SEQ ID NO:5所示的序列相比可以包含核苷酸位置1116处的突变A至G和核苷酸位置1117处的突变A至C。
nsp-3中的突变与SEQ ID NO:5所示的序列相比可以包含核苷酸位置1138处的突变G至A。
nsp-3中的突变与SEQ ID NO:5所示的序列相比可以包含核苷酸位置1116处的突变A至G、核苷酸位置1117处的A至C和核苷酸位置1138处的G至A。
本发明的活的减毒冠状病毒可以包括辅助蛋白3a和/或3b的缺失。该突变可以通过基因3的部分或完全缺失来实现。因此，在本发明的一个方面，缺失辅助蛋白3a的全部或部分。根据本发明的另一方面，缺失辅助蛋白3b的全部或部分。在本发明的另一方面，缺失辅助蛋白3a和3b两者的全部或部分。在本发明的一个方面，缺失辅助蛋白3a。根据本发明的另一方面，缺失辅助蛋白3b。在本发明的另一方面，缺失辅助蛋白3a和3b两者。
辅助蛋白3a和3b的缺失可以包括从SEQ ID NO:2所示的基因3序列的约核苷酸位置37至约384的缺失。辅助蛋白3a和3b的缺失可以包括从SEQ ID NO:2所示的基因3序列的核苷酸位置37至384的缺失
辅助蛋白3a和3b的缺失可以包括从SEQ ID NO:1所示的IBV M41-CK序列的约核苷酸位置23867至约24214的缺失。辅助蛋白3a和3b的缺失可以包括从SEQ ID NO:1所示的IBVM41-CK序列的核苷酸位置23867至24214的缺失。
核苷酸序列可以包含上文列出的核苷酸突变的任何组合。
在一个实施方案中，本发明的冠状病毒可以包含非结构蛋白质nsp-3中的突变和辅助蛋白质3a和/或3b的缺失。
在另一个实施方案中，本发明的冠状病毒可以包含nsp-3的ADRP区域中的突变和辅助蛋白3a和3b的缺失。
例如，本发明的减毒冠状病毒的核苷酸序列可包含以下突变：
a)与SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1116处的A至G和核苷酸位置1117处的A至C；和/或
b)与SEQ ID NO:5所示序列相比核苷酸位置1138处的G至A；和
c)从SEQ ID NO:2所示的基因3序列的核苷酸位置37至384的缺失。
核苷酸序列可以不包含与Ammayappan等人(如上)报告的C12008T取代对应的取代。
核苷酸序列可以是天然的、合成的或重组的。它可以是双链或单链，它可以是DNA或RNA或其组合。例如，它可以是cDNA、PCR产物、基因组序列或mRNA。
可以对核苷酸序列进行密码子优化以在所选宿主/宿主细胞中产生。
它可以是分离的，或作为质粒、病毒或宿主细胞的一部分。
质粒
质粒是与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA复制。它们通常是环状且双链的。
可以使用质粒或载体(如它们有时已知)在宿主细胞中表达蛋白质。例如，可以用能够编码特定蛋白质的质粒转染细菌宿主细胞以表达该蛋白质。该术语还包括酵母人工染色体和细菌人工染色体，它们能够容纳较长的DNA部分。
本发明的质粒包含能够编码减毒冠状病毒的限定区域的核苷酸序列。它还可以包含一种或多种另外的冠状病毒核苷酸序列，或能够编码一种或多种其他冠状病毒蛋白如S基因的核苷酸序列。
质粒还可以包含抗性标志物，例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)，其在黄嘌呤和次黄嘌呤存在下赋予对霉酚酸(MPA)的抗性，并且受痘苗病毒P7.5早期/晚期启动子控制。
重组疫苗病毒
本发明还涉及重组痘苗病毒(rVV)，其包含如本文所定义的变体基因。
重组痘苗病毒(rVV)可以使用基于痘苗病毒的反向遗传学系统制备。
在这方面，本发明还提供了通过以下生成病毒颗粒的方法：
(i)将如前节所述的质粒转染入宿主细胞中；
(ii)用重组病毒感染宿主细胞，所述重组病毒包含具有nsp-3基因或基因3的冠状病毒株的基因组；
(iii)允许质粒中的基因序列与重组病毒基因组中的相应序列之间发生同源重组以产生经修饰的基因；
(iv)选择包含经修饰的基因的重组病毒。
术语“经修饰的基因”是指nsp-3基因或基因3，其包含如结合本发明第一方面所述的突变。具体地，该术语是指源自野生型基因但包含使其编码如本文所定义的变体蛋白，或(在基因3的情况下)不编码蛋白质3a和3b的部分或全部的核苷酸序列的基因
重组可以涉及经修饰的基因的全部或部分。重组可以涉及编码氨基酸突变的核苷酸序列或包含如上定义的核苷酸取代。
冠状病毒株的基因组可以缺少对应于质粒提供的部分的蛋白质部分，因此通过插入质粒提供的核苷酸序列形成修饰的蛋白质。
重组病毒是适合于在其基因组和质粒之间进行同源重组的病毒。痘苗病毒特别适合，因为常规使用同源重组来插入和缺失痘苗病毒的基因组序列。
任选地，上述方法包括以下步骤：
(v)从来自步骤(iv)的重组病毒的DNA中回收包含经修饰的基因的重组冠状病毒。
用于回收重组冠状病毒(如重组IBV)的方法是本领域已知的(参见Britton等(2005)参见第24页；和PCT/GB2010/001293)。
例如，可以将来自步骤(iv)的重组病毒的DNA插入质粒中并用于转染表达胞质T7RNA聚合酶的细胞。例如，可以用表达T7RNA聚合酶的禽痘病毒预先感染细胞。然后可以例如从生长培养基中分离重组冠状病毒。
当将质粒插入痘苗病毒基因组时，形成不稳定的中间体。例如，可以使用质粒上的抗性标志物选择包含质粒的重组体。
然后，可以通过例如PCR和测序验证阳性重组体含有经修饰的基因。
可以培养重组病毒的大量原液，所述重组病毒包括经修饰的基因(例如重组痘苗病毒，(rVV)，并提取DNA以进行步骤(v))。
合适的反向遗传学系统是本领域已知的(Casais et al(2001)J.Virol 75:12359-12369；Casais et al(2003)J.Virol.77:9084-9089；Britton et al(2005)J.Virological Methods 123:203-211；Armesto et al(2008)Methods in MolecularBiology 454:255-273)。
细胞
可以使用冠状病毒来感染细胞。
例如，可以通过本领域已知的方法从上清液中收获冠状病毒颗粒，并任选地纯化。
可以使用细胞来产生冠状病毒颗粒。
因此，本发明还提供了用于制备冠状病毒的方法，该方法包括以下步骤：
(i)用根据本发明的冠状病毒感染细胞；
(ii)允许病毒在细胞中复制；和
(iii)收获后代病毒。
本发明还提供了使用反向遗传学系统能够生成根据本发明的冠状病毒的细胞。例如，细胞可以包含重组病毒基因组，其包含能够编码本发明的经修饰的基因的核苷酸序列。
细胞可以能够产生含有突变的重组性重组病毒(例如痘苗病毒)。
或者，细胞可以能够通过反向遗传学系统产生重组冠状病毒。细胞可以表达或经诱导表达T7聚合酶以拯救重组病毒颗粒。
疫苗
可以使用冠状病毒来生产疫苗。疫苗可以是本发明的冠状病毒的减毒活形式，并且可以进一步包含药学可接受载体。如本文所定义，适用于本发明的“药学可接受载体”是本领域技术人员公知的。此类载体包括但不限于水、盐水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、醇/水溶液、乳液或悬浮液。可以根据常规技术添加其他常规使用的稀释剂和赋形剂。此类载体可以包括乙醇、多元醇及其合适的混合物、植物油和可注射的有机酯。也可以使用缓冲剂和pH调节剂。缓冲剂包括但不限于由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括但不限于有机酸盐，如柠檬酸的盐，例如柠檬酸盐、抗坏血酸、葡糖酸、组氨酸-Hel、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸、Tris、盐酸三甲胺或磷酸盐缓冲剂。胃肠外载体可以包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖、海藻糖、蔗糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内载体可以包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏右旋糖等的那些。在药物载体中也可以提供防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂(例如EDTA)、惰性气体等。本发明不受载体选择的限制。由具有适当的pH等张性、稳定性和其它常规特征的上述组分制备这些药学可接受组合物在本领域的技术范围内。参见，例如，诸如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Lippincott Williams&Wilkins,pub！.,2000；和The Handbook of Pharmaceutical Excipients,第4增补版,R.C.Rowe etal编,APhA Publications,2003的教科书。
本发明的疫苗将以“治疗有效量”施用，所述治疗有效量指当施用于受试者或患者时足以实现有益或期望结果的活性成分(例如，根据本发明的试剂)的量。可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用有效量。本领域普通技术人员可以容易地确定根据本发明的组合物的治疗有效量。在本发明的上下文中，“治疗有效量”是足以实现有益或期望结果的产生与传染性支气管炎病况相关的一个或多个参数的客观测量变化的量。可以在一次或多次施用中施用有效量。对于本发明的目的，有效量的药物、化合物或药物组合物是足以降低传染性支气管炎发病率的量。如本文所用，术语“治疗剂”涵盖疾病、病况或病症的治疗的整个范围。本发明的“治疗”剂可以以防范性或预防性的方式起作用，包括那些掺入设计为靶向可以鉴定为有风险的动物的程序的那些(药物遗传学)；或者以改善或治疗性质的方式起作用；或者可以起作用以减缓治疗的疾病或病症的至少一种症状进展的速度或程度。
本发明还涉及制备此类疫苗的方法，该方法包括用含有如本发明第一方面所定义的经修饰的蛋白的病毒颗粒感染细胞，例如Vero细胞的步骤。
疫苗接种方法
可以使用本发明的冠状病毒来治疗和/或预防疾病。
“治疗”是指将疫苗施用于具有现有疾病的受试者，以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。
“预防”是指将疫苗施用于尚未感染疾病和/或未显示任何疾病症状的受试者，以预防或损害疾病的原因(例如感染)或减少或阻止至少一种与疾病相关的症状的形成。
疾病可以是由冠状病毒引起的任何疾病，例如人类的呼吸道疾病和/或胃肠炎和其它动物中的肝炎、胃肠炎、脑炎或呼吸道疾病。
疾病可以是传染性支气管炎(IB)；猪流行性腹泻；传染性胃肠炎；小鼠肝炎病毒；猪血细胞凝集性脑脊髓炎；严重急性呼吸系统综合症(SARS)；或蓝冠病。
疾病可以是传染性支气管炎。
例如，可以通过滴眼液或鼻内施用将疫苗施用于孵化的鸡。虽然准确，但这些方法可以是昂贵的，例如对于大型肉鸡群。替代方案包括喷雾接种或对饮用水的施用，但使用此类方法难以确保均匀的疫苗应用。
疫苗可以以适合于其施用的形式提供，诸如用于眼内使用的滴眼管。
可以通过卵内接种，例如通过注射含胚卵施用疫苗。卵内疫苗接种的优势在于它提供对疾病的早期抗性。与喷雾接种和通过饮用水施用不同，它还有助于每个受试者的均匀剂量施用。
可以将疫苗施用于蛋的任何合适的隔室，包括尿囊液、卵黄囊、羊膜、气房或胚胎。它可以在壳(气房)膜和尿囊绒膜下施用。
通常在胚胎发育的晚期阶段期间将疫苗注射到含胚卵中，通常在孵化期的最后四分之一期间，诸如孵化前3-4天。在鸡中，疫苗可以在21天孵育期的第15-19天之间，例如在第17或18天施用。
该过程可以使用机器人注射过程自动化，例如WO 2004/078203中描述的那些。
疫苗可以与一种或多种其他疫苗一起施用，例如，用于其他疾病，例如新城疫病毒(NDV)的疫苗。本发明还提供了疫苗组合物，其包含根据本发明的疫苗以及一种或多种其他疫苗。本发明还提供了试剂盒，其包含根据本发明的疫苗以及一种或多种其他疫苗，用于分开、顺序或同时施用。
本发明的疫苗或疫苗组合物可以用于治疗人、动物或禽类受试者。例如，受试者可以是鸡或小鼠(例如实验室小鼠，例如转基因小鼠)。
通常，医生或兽医将确定最适合个体受试者或受试者组的实际剂量，并且其将随着特定受试者的年龄、体重和反应而变化。
任选地，组合物可以包含药学可接受载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据意图的施用途径和标准药学实践来选择。作为载体(或者除了载体外)，药物组合物可以包含赋形剂或稀释剂、任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和其他可能有助于或增加病毒递送或免疫原性的载体试剂。
术语的定义在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图为限制性的，因为本公开的范围仅受所附权利要求书的限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Singleton,et al.,DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,20ED.,John Wiley and Sons,New York(1994),和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)给技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用字典。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以用于实践或测试本公开的实施方案。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5’至3’方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基取向从左到右书写。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或在该范围内排除，并且在本公开内容内也涵盖较小范围中包括任一、无一或者两个限度的每个范围，服从所述范围中任何明确排除的限度。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本公开中。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“酶”包括多种此类候选试剂及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
如本文中使用，术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除其他的、非叙述成员、元素或方法步骤。术语“包含”也包括术语“由......组成”。
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在用于帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：基于M41-CK的IBV反向遗传系统的产生
通过将先前在PCT/GB2010/001293(通过引用并入本文)中描述的痘苗病毒反向遗传学系统中的Beaudette cDNA替换源自M41共有序列的合成cDNA来产生M41-CK全长cDNA。
通过将Beaudette 5’UTR-Nsp2-Nsp3序列替换为来自IBV M41-CK的相应序列进一步修饰在Armesto,Cavanagh and Britton(2009).PLoS ONE 4(10):e7384.doi:10.1371/journal.pone.0007384中描述的重组痘苗病毒(rVV)rVV-BeauR-Rep-M41Struct内的IBVcDNA，其由源自IBV Beaudette株的复制酶和来自IBV M41-CK的结构和辅助基因以及3’UTR组成。得到的IBV cDNA由来自M41的5’UTR-Nsp2-Nsp3、来自Beaudette的Nsp4-Nsp16和来自M41的结构和辅助基因以及3’UTR组成。通过缺失Beaudette Nsp4-Nsp16序列进一步修饰此cDNA。在另外四个步骤中修饰得到的缺乏Nsp4-16的cDNA，其中将缺失的Nsps序贯替换为来自M41-CK的相应序列，替换cDNA代表M41-CK Nsp4-8、Nsp9-12、Nsp12-14和最后Nsp15-16。每个替换cDNA含有对应于先前插入的3’大部分M41序列的5’端的约500个核苷酸和对应于M41S基因序列的3’端的约500个核苷酸。这允许通过同源重组插入M41cDNA序列并序贯添加连续的M41复制酶基因序列。使用本发明人先前描述的瞬时显性选择(TDS)系统(参见PCT/GB2010/001293)，通过同源重组添加含有M41衍生的Nsp序列的合成cDNA。
实施例2：测定重组M41病毒的致病性
使用实施例1中描述的反向遗传学系统产生三个重组体。这些重组体命名为rIBVM41K-S-ADRP、rIBV M41K-A-ADRP和rIBV M41K-del3ab。
显示三种重组体在鸡肾细胞中以与野生型M41-CK/M41-K相似的方式生长(图7和8)。
rIBV M41K-S-ADRP在nsp-3的腺苷二磷酸-核糖-1’-磷酸酶(ADRP)区域中的核苷酸位置G3685A处具有突变，导致从G到S的氨基酸突变。使用图1中所示的质粒将此突变引入含有M41-K的rVV中。
rIBV M41K-A-ADRP在nsp-3的ADRP区域中的核苷酸位置A3664G和A3665C处具有两个突变，导致从N到A的氨基酸突变。使用图2中所示的质粒将此突变引入含有M41-K的rVV中。
rIBV M41K-del3ab在基因3中具有从核苷酸位置23867至24214的缺失，导致缺乏辅助蛋白3a和3b。使用图3中所示的质粒从含有M41-K的rVV中缺失该区域。
通过眼和鼻接种将三种重组病毒用于感染8日龄无特定病原体(SPF)鸡，以对它们测试致病性，如感染后3-7天每天通过临床体征观察，以及测试感染后第4天和第6天纤毛活性。纤毛活性的丧失是测定IBV致病性的完善建立的方法。发现这些重组体中的每种比亲本病毒M41-CK的致病性低，如图4-6所示。
实施例3：用M41-R进行疫苗接种/攻击研究
在研究中测试候选疫苗病毒，其中受精鸡蛋在19天胚胎发生(embryonation)时在卵内接种疫苗，并且其中测定接种蛋的孵化率。研究鸡的临床健康，并且在21日龄时用有毒力的IB M41攻击病毒以每剂103.65EID50攻击鸡。
在通过疫苗的攻击保护后研究临床体征，并在攻击后5天进行纤毛停滞测试，以研究攻击病毒对纤毛移动和疫苗针对纤毛停滞(抑制纤毛运动)提供的保护的影响。
表3
孵化率研究的结果
根据常规孵育程序孵育SPF肉鸡蛋。在19天孵育时，用每剂IB疫苗株IB M41-K-A-ADRP、IB M41-K-S-ADRP和IB M41-K-3ab以104EID50接种6组30个蛋。用安慰剂即PBS接种另一组的30个蛋。在孵化21天时，蛋孵化并获得以下结果：
-PBS 87％(26/30)孵化，1只鸡在孵化后死亡，并且3个蛋保持未打开且未标记以用于胚胎注射。
-M41-K-A-ARDP 97％(29/30)孵化，1个蛋保持未打开且未标记以用于胚胎注射。
-M41-K-S-ARDP 50％(15/30)孵化，4个蛋保持未打开，其中将1个标记用于胚胎注射。其他蛋/动物未能存活。
-M41-K-3ab 47％(18/30)孵化，7个蛋保持未打开，其中将3个标记用于胚胎注射。其他蛋/动物未能存活。
IB M41-K-A-ADRP证明了接种蛋的良好孵化率，因此被认为适合作为卵内疫苗接种的疫苗。将在攻击测试中对此毒株测试功效，如上文详述。
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应该理解，要求保护的本发明不应过度限于这些特定的实施方案。实际上，对于分子生物学、病毒学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 皮尔布莱特研究所
<120> 冠状病毒
<130> P107816PCT
<150> GB 1601498.7
<151> 2016-01-27
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27500
<212> DNA
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<400> 1
acttaagata gatattaata tatatctatc acactagcct tgcgctagat ttccaactta 60
acaaaacgga cttaaatacc tacagctggt cctcataggt gttccattgc agtgcacttt 120
agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggtttttgt tattaaaatc ttattgttgc 180
tggtatcact gcttgttttg ccgtgtctca ctttatacat ccgttgcttg ggctacctag 240
tatccagcgt cctacgggcg ccgtggctgg ttcgagtgcg aagaacctct ggttcatcta 300
gcggtaggcg ggtgtgtgga agtagcactt cagacgtacc ggttctgttg tgtgaaatac 360
ggggtcacct ccccccacat acctctaagg gcttttgagc ctagcgttgg gctacgttct 420
cgcataaggt cggctatacg acgtttgtag ggggtagtgc caaacaaccc ctgaggtgac 480
aggttctggt ggtgtttagt gagcagacat acaatagaca gtgacaacat ggcttcaagc 540
ctaaaacagg gagtatctcc caaactaagg gatgtcattc ttgtatccaa agacattcct 600
gaacaacttt gtgacgcttt gtttttctat acgtcacaca accctaagga ttacgctgat 660
gcttttgcag ttaggcagaa gtttgatcgt aatctgcaga ctgggaaaca gttcaaattt 720
gaaactgtgt gtggtctctt cctcttgaag ggagttgaca aaataacacc tggcgtccca 780
gcaaaagtct taaaagccac ttctaagttg gcagatttag aagacatctt tggtgtctct 840
ccctttgcaa gaaaatatcg tgaacttttg aagacagcat gccagtggtc tcttactgta 900
gaaacactgg atgctcgtgc acaaactctt gatgaaattt ttgaccctac tgaaatactt 960
tggcttcagg tggcagcaaa aatccaagtt tcggctatgg cgatgcgcag gcttgttgga 1020
gaagtaactg caaaagtcat ggatgctttg ggctcaaata tgagtgctct tttccagatt 1080
tttaaacaac aaatagtcag aatttttcaa aaagcgctgg ctatttttga gaatgtgagt 1140
gaattaccac agcgtattgc agcacttaag atggcttttg ctaagtgtgc caagtccatt 1200
actgttgtgg ttatggagag gactctagtt gttagagagt tcgcaggaac ttgtcttgca 1260
agcattaatg gtgctgttgc aaaattcttt gaagaactcc caaatggttt catgggtgct 1320
aaaattttca ctacacttgc cttctttagg gaggctgcag tgaaaattgt ggataacata 1380
ccaaatgcac cgagaggcac taaagggttt gaagtcgttg gtaatgccaa aggtacacaa 1440
gttgttgtgc gtggcatgcg aaatgactta acactgcttg accaaaaagc tgaaattcct 1500
gtggagtcag aaggttggtc tgcaattttg ggtggacatc tttgctatgt ctttaagagt 1560
ggtgatcgct tttacgcggc acctctttca ggaaattttg cattgcatga tgtgcattgt 1620
tgtgagcgtg ttgtctgtct ttctgatggt gtaacaccgg agataaatga tggacttatt 1680
cttgcagcaa tctactcttc ttttagtgtc gcagaacttg tggcagccat taaaaggggt 1740
gaaccattta agtttctggg tcataaattt gtgtatgcaa aggatgcagc agtttctttt 1800
acattagcga aggctgctac tattgcagat gttttgaagc tgtttcaatc agcgcgtgtg 1860
aaagtagaag atgtttggtc ttcacttact gaaaagtctt ttgaattctg gaggcttgca 1920
tatggaaaag tgcgtaatct cgaagaattt gttaagactt gtttttgtaa ggctcaaatg 1980
gcgattgtga ttttagcgac agtgcttgga gagggcattt ggcatcttgt ttcgcaagtc 2040
atctataaag taggtggtct ttttactaaa gttgttgact tttgtgaaaa atattggaaa 2100
ggtttttgtg cacagttgaa aagagctaag ctcattgtca ctgaaaccct ctgtgttttg 2160
aaaggagttg cacagcattg ttttcaacta ttgctggatg caatacagtt tatgtataaa 2220
agttttaaga agtgtgcact tggtagaatc catggagact tgctcttctg gaaaggaggt 2280
gtgcacaaaa ttattcaaga gggcgatgaa atttggtttg acgccattga tagtattgat 2340
gttgaagatc tgggtgttgt tcaagaaaaa ttgattgatt ttgatgtttg tgataatgtg 2400
acacttccag agaaccaacc cggtcatatg gttcaaatcg aggatgacgg aaagaactac 2460
atgttcttcc gcttcaaaaa ggatgagaac atttattata caccaatgtc acagcttggt 2520
gctattaatg tggtttgcaa agcaggcggt aaaactgtca cctttggaga aactactgtg 2580
caagaaatac caccacctga tgttgtgttt attaaggtta gcattgagtg ttgtggtgaa 2640
ccatggaata caatcttcaa aaaggcttat aaggagccca ttgaagtaga gacagacctc 2700
acagttgaac aattgctctc tgtggtctat gagaaaatgt gtgatgatct caagctgttt 2760
ccggaggctc cagaaccacc accatttgag aatgtcacac ttgttgataa gaatggtaaa 2820
gatttggatt gcataaaatc atgccatctg atctatcgtg attatgagag cgatgatgac 2880
atcgaggaag aagatgcaga agaatgtgac acggattcag gtgatgctga ggagtgtgac 2940
actaattcag aatgtgaaga agaagatgag gatactaaag tgttggctct tatacaagac 3000
ccggcaagta acaaatatcc tctgcctctt gatgatgatt atagcgtcta caatggatgt 3060
attgttcata aggacgctct cgatgttgtg aatttaccat ctggtgaaga aacctttgtt 3120
gtcaataact gctttgaagg ggctgttaaa gctcttccgc agaaagttat tgatgttcta 3180
ggtgactggg gtgaggctgt tgatgcgcaa gaacaattgt gtcaacaaga atcaactcgg 3240
gtcatatctg agaaatcagt tgagggtttt actggtagtt gtgatgcaat ggctgaacaa 3300
gctattgttg aagagcagga aatagtacct gttgttgaac aaagtcagga tgtagttgtt 3360
tttacacctg cagacctaga agttgttaaa gaaacagcag aagaggttga tgagtttatt 3420
ctcatttctg ctgtccctaa agaagaagtt gtgtctcagg agaaagagga gccacaggtt 3480
gagcaagagc ctaccctagt tgttaaagca caacgtgaga agaaggctaa aaagttcaaa 3540
gttaaaccag ctacatgtga aaaacccaaa tttttggagt acaaaacatg tgtgggtgat 3600
ttggctgttg taattgccaa agcattggat gagtttaaag agttctgcat tgtaaacgct 3660
gcaaatgagc acatgtcgca tggtggtggc gttgcaaagg caattgcaga cttttgtgga 3720
ccggactttg ttgaatattg cgcggactat gttaagaaac atggtccaca gcaaaaactt 3780
gtcacacctt catttgttaa aggcattcaa tgtgtgaata atgttgtagg acctcgccat 3840
ggagacagca acttgcgtga gaagcttgtt gctgcttaca agagtgttct tgtaggtgga 3900
gtggttaact atgttgtgcc agttctctca tcagggattt ttggtgtaga ttttaaaata 3960
tcaatagatg ctatgcgcga agcttttaaa ggttgtgcca tacgcgttct tttattttct 4020
ctgagtcaag aacacatcga ttatttcgat gcaacttgta agcagaagac aatttatctt 4080
acggaggatg gtgttaaata ccgctctgtt gttttaaaac ctggtgattc tttgggtcaa 4140
tttggacagg tttttgcaag aaataaggta gtcttttcgg ctgatgatgt tgaggataaa 4200
gaaatcctct ttatacccac aactgacaag actattcttg aatattatgg tttagatgcg 4260
caaaagtatg taacatattt gcaaacgctt gcgcagaaat gggatgttca atatagagac 4320
aattttgtta tattagagtg gcgtgacgga aattgctgga ttagttcagc aatagttctc 4380
cttcaagctg ctaaaattag atttaaaggt tttcttgcag aagcatgggc taaactgttg 4440
ggtggagatc ctacagactt tgttgcctgg tgttatgcaa gttgcaatgc taaagtaggt 4500
gatttttcag atgctaattg gcttttggcc aatttagcag aacattttga cgcagattac 4560
acaaatgcac ttcttaagaa gtgtgtgtcg tgcaattgtg gtgttaagag ttatgaactt 4620
aggggtcttg aagcctgtat tcagccagtt cgagcaccta atcttctaca ttttaaaacg 4680
caatattcaa attgcccaac ctgtggtgca agtagtacgg atgaagtaat agaagcttca 4740
ttaccgtact tattgctttt tgctactgat ggtcctgcta cagttgattg tgatgaaaat 4800
gctgtaggga ctgttgtttt cattggctct actaatagtg gccattgtta tacacaagcc 4860
gatggtaagg cttttgacaa tcttgctaag gatagaaaat ttggaaggaa gtcgccttac 4920
attacagcaa tgtatacacg tttttctctt aggagtgaaa atcccctact tgttgttgaa 4980
catagtaagg gtaaagctaa agtagtaaaa gaagatgttt ctaaccttgc tactagttct 5040
aaagccagtt ttgacgatct tactgacttt gaacagtggt atgatagcaa catctatgag 5100
agtcttaaag tgcaggagac acctgataat cttgatgaat atgtgtcatt tacgacaaag 5160
gaagattcta agttgccact gacacttaaa gttagaggta tcaaatcagt tgttgacttt 5220
aggtctaagg atggttttac ttataagtta acacctgata ctgatgaaaa ttcaaaaaca 5280
ccagtctact acccagtctt ggattctatt agtcttaggg caatatgggt tgaaggcagt 5340
gctaattttg ttgttgggca tccaaattat tatagtaagt ctctccgaat tcccacgttt 5400
tgggaaaatg ccgagagctt tgttaaaatg ggttataaaa ttgatggtgt aactatgggc 5460
ctttggcgtg cagaacacct taataaacct aatttggaga gaatttttaa cattgctaag 5520
aaagctattg ttggatctag tgttgttact acgcagtgtg gtaaaatact agttaaagca 5580
gctacatacg ttgccgataa agtaggtgat ggtgtagttc gcaatattac agatagaatt 5640
aagggtcttt gtggattcac acgtggccat tttgaaaaga aaatgtccct acaatttcta 5700
aagacacttg tgttcttttt cttttatttc ttaaaggcta gtgctaagag tttagtttct 5760
agctataaga ttgtgttatg taaggtggtg tttgctacct tacttatagt gtggtttata 5820
tacacaagta atccagtagt gtttactgga atacgtgtgc tagacttcct atttgaaggt 5880
tctttatgtg gtccttataa tgactacggt aaagattctt ttgatgtgtt acgctattgt 5940
gcaggtgatt ttacttgtcg tgtgtgttta catgatagag attcacttca tctgtacaaa 6000
catgcttata gcgtagaaca aatttataag gatgcagctt ctggcattaa ctttaattgg 6060
aattggcttt atttggtctt tctaatatta tttgttaagc cagtggcagg ttttgttatt 6120
atttgttatt gtgttaagta tttggtattg agttcaactg tgttgcaaac tggtgtaggt 6180
tttctagatt ggtttgtaaa aacagttttt acccatttta attttatggg agcgggattt 6240
tatttctggc tcttttacaa gatatacgta caagtgcatc atatattgta ctgtaaggat 6300
gtaacatgtg aagtgtgcaa gagagttgca cgcagcaaca ggcaagaggt tagcgttgta 6360
gttggtggac gcaagcaaat agtgcatgtt tacactaatt ctggctataa cttttgtaag 6420
agacataatt ggtattgtag aaattgtgat gattatggtc accaaaatac atttatgtcc 6480
cctgaagttg ctggcgagct ttctgaaaag cttaagcgcc atgttaaacc tacagcatat 6540
gcttaccacg ttgtgtatga ggcatgcgtg gttgatgatt ttgttaattt aaaatataag 6600
gctgcaattc ctggtaagga taatgcatct tctgctgtta agtgtttcag tgttacagat 6660
tttttaaaga aagctgtttt tcttaaggag gcattgaaat gtgaacaaat atctaatgat 6720
ggttttatag tgtgtaatac acagagtgcg catgcactag aggaagcaaa gaatgcagcc 6780
gtctattatg cgcaatatct gtgtaagcca atacttatac ttgaccaggc actttatgag 6840
caattaatag tagagcctgt gtctaagagt gttatagata aagtgtgtag cattttgtct 6900
aatataatat ctgtagatac tgcagcttta aattataagg caggcacact tcgtgatgct 6960
ctgctttcta ttactaaaga cgaagaagcc gtagatatgg ctatcttctg ccacaatcat 7020
gaagtggaat acactggtga cggttttact aatgtgatac cgtcatatgg tatggacact 7080
gataagttga cacctcgtga tagagggttt ttgataaatg cagatgcttc tattgctaat 7140
ttaagagtca aaaatgctcc tccggtagta tggaagtttt ctgatcttat taaattgtct 7200
gacagttgcc ttaaatattt aatttcagct actgtcaagt caggaggtcg tttctttata 7260
acaaagtctg gtgctaaaca agttatttct tgtcataccc agaaactgtt ggtagagaaa 7320
aaggcaggtg gtgttattaa taacactttt aaatggttta tgagttgttt taaatggctt 7380
tttgtctttt atatactttt tacagcatgt tgtttgggtt actactatat ggagatgaat 7440
aaaagttttg ttcaccccat gtatgatgta aactccacac tgcatgttga agggttcaaa 7500
gttatagaca aaggtgttat tagagagatt gtgtcagaag ataattgttt ctctaataag 7560
tttgttaatt ttgacgcctt ttggggtaaa tcatatgaaa ataataaaaa ctgtccaatt 7620
gttacagttg ttatagatgg tgacgggaca gtagctgttg gtgttcctgg ttttgtatca 7680
tgggttatgg atggtgttat gtttgtgcat atgacacaga ctgatcgtag accttggtac 7740
attcctacct ggtttaatag agaaattgtt ggttacactc aggattcaat tatcactgag 7800
ggtagttttt atacatctat agcattattt tctgctagat gtttatattt aacagccagc 7860
aatacacctc aattgtattg ttttaatggc gacaatgatg cacctggagc cttaccattt 7920
ggtagtatta ttcctcatag agtatacttc caacctaatg gtgttaggct tatagttcca 7980
caacaaatac tgcatacacc ctacatagtg aagtttgttt cagacagcta ttgtagaggt 8040
agtgtatgtg agtatactaa accaggttac tgtgtgtcac tagactccca atgggttttg 8100
tttaatgatg aatacattag taaacctggc gttttctgtg gttctactgt tagagaactt 8160
atgtttaata tggttagtac attctttact ggtgtcaacc ctaatattta tattcagcta 8220
gcaactatgt ttttaatact agttgttatt gtgttaattt ttgcaatggt tataaagttt 8280
caaggtgttt ttaaagctta tgcgaccatt gtgtttacaa taatgttagt ttgggttatt 8340
aatgcatttg ttttgtgtgt acatagttat aatagtgttt tagctgttat attattagta 8400
ctctattgct atgcatcatt ggttacaagt cgcaatactg ctataataat gcattgttgg 8460
cttgttttta cctttggttt aatagtaccc acatggttgg cttgttgcta tctgggattt 8520
attctttata tgtacacacc gttggttttc tggtgttacg gtactactaa aaatactcgt 8580
aagttgtatg atggcaacga gtttgttggt aattatgacc ttgctgcgaa gagcactttt 8640
gttattcgtg gtactgaatt tgttaagctt acgaatgaga taggtgataa atttgaagcc 8700
tatctttctg cgtatgctag acttaaatac tattcaggca ctggtagtga gcaagattac 8760
ttgcaagctt gtcgtgcatg gttagcttat gctttggacc aatatagaaa tagtggtgtt 8820
gaggttgttt ataccccacc gcgttactct attggtgtta gtagactaca cgctggtttt 8880
aaaaaactag tttctcctag tagtgctgtt gagaagtgca ttgttagtgt ctcttataga 8940
ggcaataatc ttaatggact gtggctgggt gattctattt actgcccacg ccatgtgtta 9000
ggtaagttta gtggtgacca gtggggtgac gtactaaacc ttgctaataa tcatgagttt 9060
gaagttgtaa ctcaaaatgg tgttactttg aatgttgtca gcaggcggct taaaggagca 9120
gttttaattt tacaaactgc agttgccaat gctgaaactc ctaagtataa gtttgttaaa 9180
gctaattgtg gtgatagttt cactatagct tgttcttatg gtggtacagt tataggactt 9240
taccctgtca ctatgcgttc taatggtact attagagcat ctttcctagc aggagcctgt 9300
ggctcagttg gttttaatat agaaaagggt gtagttaatt tcttttatat gcaccatctt 9360
gagttaccta atgcattaca cactggaact gacctaatgg gtgagtttta tggtggttat 9420
gtagatgaag aggttgcgca aagagtgcca ccagataatc tagttactaa caatattgta 9480
gcatggctct atgcggcaat tattagtgtt aaagaaagta gtttttcaca acctaaatgg 9540
ttggagagta ctactgtttc tattgaagat tacaataggt gggctagtga taatggtttt 9600
actccatttt ccactagtac tgctattact aaattaagtg ctataactgg ggttgatgtt 9660
tgtaaactcc ttcgcactat tatggtaaaa agtgctcaat ggggtagtga tcccatttta 9720
ggacaatata attttgaaga cgaattgaca ccagaatctg tatttaatca agttggtggt 9780
gttaggttac agtcttcttt tgtaagaaaa gctacatctt ggttttggag tagatgtgta 9840
ttagcttgct tcttgtttgt gttgtgtgct attgtcttat ttacggcagt gccacttaag 9900
ttttatgtac atgcagctgt tattttgttg atggctgtgc tctttatttc ttttactgtt 9960
aaacatgtta tggcatacat ggacactttc ctattgccta cattgattac agttattatt 10020
ggagtttgtg ctgaagtccc tttcatatac aatactctaa ttagtcaagt tgttattttc 10080
ttaagccaat ggtatgatcc tgtagtcttt gatactatgg taccatggat gttattgcca 10140
ttagtgttgt acactgcttt taagtgtgta caaggctgct atatgaattc tttcaatact 10200
tctttgttaa tgctgtatca gtttatgaag ttaggttttg ttatttacac ctcttcaaac 10260
actcttactg catatacaga aggtaattgg gagttattct ttgagttggt tcacactatt 10320
gtgttggcta atgttagtag taattcctta attggtttaa ttgtttttaa gtgtgctaag 10380
tggattttat attattgcaa tgcaacatac tttaataatt atgtgttaat ggcagtcatg 10440
gttaatggca taggctggct ttgcacctgt tactttggat tgtattggtg ggttaataaa 10500
gtttttggtt taaccttagg taaatacaat tttaaagttt cagtagatca atataggtat 10560
atgtgtttgc ataaggtaaa tccacctaaa actgtgtggg aggtctttac tacaaatata 10620
cttatacaag gaattggagg cgatcgtgtg ttgcctatag ctacagtgca atctaaattg 10680
agtgatgtaa agtgtacaac tgttgtttta atgcagcttt tgactaagct taatgttgaa 10740
gcaaattcaa aaatgcatgc ttatcttgtt gagttacaca ataaaatcct cgcatctgat 10800
gatgttggag agtgcatgga taatttattg ggtatgctta taacactatt ttgtatagat 10860
tctactattg atttgggtga gtattgtgat gatatactta agaggtcaac tgtattacaa 10920
tcggttactc aagagttttc gcacataccc tcgtatgctg aatatgaaag agctaagagt 10980
atttatgaaa aggttttagc cgattctaaa aatggtggtg taacacagca agagcttgct 11040
gcatatcgta aagctgccaa tattgcaaag tcagtttttg atagagactt ggctgttcaa 11100
aagaagttag atagcatggc agaacgtgct atgacaacaa tgtataaaga ggcgcgtgta 11160
actgatagaa gagcaaaatt agtttcatca ttacatgcac tacttttttc aatgcttaag 11220
aaaatagatt ctgagaagct taatgtctta tttgaccagg cgaatagtgg tgttgtaccc 11280
ctagcaactg ttccaattgt ttgtagtaat aagcttaccc ttgttatacc agacccagag 11340
acgtgggtca agtgtgtgga gggtgtgcat gttacatatt caacagttgt ttggaatata 11400
gactgtgtta ctgatgccga tggcacagag ttacacccca cttctacagg tagtggattg 11460
acttactgta taagtggtga taatatagca tggcctttaa aggttaactt gactaggaat 11520
gggcataata aggttgatgt tgccttgcaa aataatgagc ttatgcctca cggtgtaaag 11580
acaaaggctt gcgtagcagg tgtagatcaa gcacattgta gcgttgagtc taaatgttat 11640
tatacaagta ttagtggcag ttcagttgta gctgctatta cctcttcaaa tcctaatctg 11700
aaagtagcct cttttttgaa tgaggcaggt aatcagattt atgtagactt agacccacca 11760
tgtaaatttg gtatgaaagt gggtgataag gttgaagttg tttacctgta ttttataaaa 11820
aatacgaggt ctattgtaag aggtatggta cttggtgcta tatctaatgt tgttgtgtta 11880
caatctaaag gtcatgagac agaggaagtg gatgctgtag gcattctctc actttgttct 11940
tttgcagtag atcctgcgga tacatattgt aaatatgtgg cagcaggtaa tcaaccttta 12000
ggtaactgtg ttaaaatgtt gacagtacat aatggtagtg gttttgcaat aacatcaaag 12060
ccaagtccaa ctccggatca ggattcttat ggaggagctt ctgtgtgtct ttattgtaga 12120
gcacatatag cacaccctgg cggagcagga aatttagatg gacgctgtca atttaaaggt 12180
tcttttgtgc aaatacctac tacggagaaa gatcctgttg gattctgtct acgtaacaag 12240
gtttgcactg tttgtcagtg ttggattggt tatggatgtc agtgtgattc acttagacaa 12300
cctaaacctt ctgttcagtc agttgctgtt gcatctggtt ttgataagaa ttatttaaac 12360
gggtacgggg tagcagtgag gctcggctga tacccctagc taatggatgt gaccccgatg 12420
ttgtaaagcg agcctttgat gtttgtaata aggaatcagc cggtatgttt caaaatttga 12480
agcgtaactg tgcacgattc caagaagtac gtgatactga agatggaaat cttgagtatt 12540
gtgattctta ttttgtggtt aaacaaacca ctcctagtaa ttatgaacat gagaaagctt 12600
gttatgaaga cttaaagtca gaagtaacag ctgatcatga tttctttgtg ttcaataaga 12660
acatttataa tattagtagg cagaggctta ctaagtatac tatgatggat ttttgctatg 12720
ctttgcggca ctttgaccca aaggattgcg aagttcttaa agaaatactt gtcacttatg 12780
gttgtataga agattatcac cctaagtggt ttgaagagaa taaggattgg tacgacccaa 12840
tagaaaaccc taaatattat gccatgttgg ctaaaatggg acctattgta cgacgtgctt 12900
tattgaatgc tattgagttc ggaaacctca tggttgaaaa aggttatgtt ggtgttatta 12960
cacttgataa ccaagatctt aatggcaaat tttatgattt tggtgatttt cagaagacag 13020
cgcctggtgc tggtgttcct gtttttgata cgtattattc ttacatgatg cccatcatag 13080
ccatgactga tgcgttggca cctgagaggt attttgaata tgatgtgcat aagggttata 13140
aatcttatga tctcctcaag tatgattata ctgaggagaa acaagatttg tttcagaagt 13200
actttaagta ttgggatcaa gagtatcacc ctaactgtcg cgactgtagt gatgacaggt 13260
gtttgataca ttgtgcaaac ttcaacatct tgttttctac acttgtaccg cagacttctt 13320
tcggtaattt gtgtagaaag gtttttgttg atggtgtacc atttatagct acttgtggct 13380
atcattctaa ggaacttggt gttattatga atcaagataa caccatgtca ttttcaaaaa 13440
tgggtttgag tcaactcatg cagtttgttg gagatcctgc cttgttagtg gggacatcca 13500
ataaattagt ggatcttaga acgtcttgtt ttagtgtttg tgctttagcg tctggtatta 13560
ctcatcaaac ggtaaaacca ggtcacttta acaaggattt ctacgatttt gcagagaagg 13620
ctggtatgtt taaggaaggt tcttctatac cacttaaaca tttcttctac ccacagactg 13680
gtaatgctgc tataaacgat tatgattatt atcgttataa caggcctacc atgtttgata 13740
tacgtcaact tttattttgt ttagaagtga cttctaaata ttttgaatgt tatgaaggcg 13800
gctgtatacc agcaagccaa gttgtagtta acaatttaga taagagtgca ggttatccgt 13860
tcaataagtt tggaaaggcc cgtctctatt atgaaatgag tctagaggag caggaccaac 13920
tctttgagag tacaaagaag aacgtcctgc ctactataac tcagatgaat ttaaaatatg 13980
ccatatccgc gaaaaataga gcgcgtacag tggcaggtgt gtctatcctt tctactatga 14040
ctaataggca gtttcatcag aagattctta agtctatagt caacactaga aacgctcctg 14100
tagttattgg aacaaccaag ttttatggcg gttgggataa catgttgaga aaccttattc 14160
agggtgttga agacccgatt cttatgggtt gggattatcc aaagtgtgat agagcaatgc 14220
ctaatttgtt gcgtatagca gcatctttag tactcgctcg taaacacact aattgttgta 14280
cttggtctga acgcgtttat aggttgtata atgaatgcgc tcaggtttta tctgaaactg 14340
tcttagctac aggtggtata tatgtgaaac ctggtggtac tagcagtgga gatgctacta 14400
ctgcttatgc aaacagtgtt ttcaacataa tacaagccac atctgctaat gttgcgcgtc 14460
ttttgagtgt tataacgcgt gatattgtat atgatgacat taagagcttg cagtatgaat 14520
tgtaccagca ggtttatagg cgagtcaatt ttgacccagc atttgttgaa aagttttatt 14580
cttatttgtg taagaatttc tcattgatga tcttgtctga cgacggtgtt gtttgttata 14640
acaacacatt agccaaacaa ggtcttgtag cagatatttc tggttttaga gaagttctct 14700
actatcagaa caatgttttt atggctgatt ctaaatgttg ggttgaacca gatttagaaa 14760
aaggcccaca tgaattttgt tcacagcaca caatgttagt ggaggttgat ggtgagccta 14820
gatacttgcc atatccagac ccatcacgta ttttgtgtgc atgtgttttt gtagatgatt 14880
tggataagac agaatctgtg gctgttatgg agcgttatat cgctcttgcc atagatgcgt 14940
acccactagt acatcatgaa aatgaggagt acaagaaggt attctttgtg cttctttcat 15000
acatcagaaa actctatcaa gagctttctc agaatatgct tatggactac tcttttgtaa 15060
tggatataga taagggtagt aaattttggg aacaggagtt ctatgaaaat atgtatagag 15120
cccctacaac attacagtct tgtggcgttt gtgtagtgtg taatagtcaa actatattgc 15180
gctgtggtaa ttgtattcgc aaaccatttt tgtgttgtaa gtgttgctat gaccatgtca 15240
tgcacacaga ccacaaaaat gttttgtcta taaatcctta catttgctca cagccaggtt 15300
gtggtgaagc agatgttact aaattgtacc tcggaggtat gtcatacttc tgcggtaatc 15360
ataaaccaaa gttatcaata ccgttagtat ctaatggtac agtgtttgga atttacaggg 15420
ctaattgtgc aggtagcgaa aatgttgatg attttaatca actagctact actaattggt 15480
ctactgtgga accttatatt ttggcaaatc gttgtgtaga ttcgttgaga cgctttgctg 15540
cagagacagt aaaagctaca gaagaattac ataagcaaca atttgctagt gcagaagtga 15600
gagaagtact ctcagatcgt gaattgattc tgtcttggga gccaggtaaa accaggcctc 15660
cattgaatag aaattatgtt ttcactggct ttcactttac tagaactagt aaagttcagc 15720
tcggtgattt tacatttgaa aaaggtgaag gtaaggacgt tgtctattat cgagcgacgt 15780
ctactgctaa attgtctgtt ggagacattt ttgttttaac ctcacacaat gttgtttctc 15840
ttatagcgcc aacgttgtgt cctcagcaaa ccttttctag gtttgtgaat ttaagaccta 15900
atgtgatggt acctgcgtgt tttgtaaata acattccatt gtaccattta gtaggcaagc 15960
agaagcgtac tacagtacaa ggccctcctg gcagtggtaa atcccatttt gctataggat 16020
tggcggctta ctttagtaac gcccgtgtcg tttttactgc atgctctcat gcagctgttg 16080
atgctttatg tgaaaaagct tttaagtttc ttaaagtaga tgattgcact cgtatagtac 16140
ctcaaaggac tactatcgat tgcttctcta agtttaaagc taatgacaca ggcaaaaagt 16200
acatttttag tactattaat gccttgccag aagttagttg tgacattctt ttggttgacg 16260
aggttagtat gttgaccaat tacgaattgt cttttattaa tggtaagata aactatcaat 16320
atgttgtgta tgtaggtgat cctgctcaat taccggcgcc tcgtacgttg cttaacggtt 16380
cactctctcc aaaggattat aatgttgtca caaaccttat ggtttgtgtt aaacctgaca 16440
ttttccttgc aaagtgttac cgttgtccta aagaaattgt agatactgtt tctactcttg 16500
tatatgatgg aaagtttatt gcaaataacc cggaatcacg tcagtgtttc aaggttatag 16560
ttaataatgg taattctgat gtaggacatg aaagtggctc agcctacaac ataactcaat 16620
tagaatttgt gaaagatttt gtctgtcgca ataaggaatg gcgggaagca acattcattt 16680
caccttataa tgctatgaac cagagagcct accgtatgct tggacttaat gttcagacag 16740
tagactcgtc tcaaggttcg gagtatgatt atgttatctt ttgtgttact gcagattcgc 16800
agcatgcact gaatattaac agattcaatg tagcgcttac aagagccaag cgtggtatac 16860
tagttgtcat gcgtcagcgt gatgaactat attcagctct taagtttata gagcttgata 16920
gtgtagcaag tctgcaaggt acaggcttgt ttaaaatttg caacaaagag tttagtggtg 16980
ttcacccagc ttatgcagtc acaactaagg ctcttgctgc aacttataaa gttaatgatg 17040
aacttgctgc acttgttaac gtggaagctg gttcagaaat aacatataaa catcttattt 17100
ctttgttagg gtttaagatg agtgttaatg ttgaaggctg ccacaacatg tttataacac 17160
gtgatgaggc tatccgcaac gtaagaggtt gggtaggttt tgatgtagaa gcaacacatg 17220
cttgcggtac taacattggt actaacctgc ctttccaagt aggtttctct actggtgcag 17280
actttgtagt tacgcctgag ggacttgtag atacttcaat aggcaataat tttgagcctg 17340
tgaattctaa agcacctcca ggtgaacaat ttaatcactt gagagcgtta ttcaaaagtg 17400
ctaaaccttg gcatgttgta aggccaagga ttgtgcaaat gttagcggat aacctgtgca 17460
acgtttcaga ttgtgtagtg tttgtcacgt ggtgtcatgg cctagaacta accactttgc 17520
gctattttgt taaaataggc aaggaccaag tttgttcttg cggttctaga gcaacaactt 17580
ttaattctca tactcaggct tatgcttgtt ggaagcattg cttgggtttt gattttgttt 17640
ataatccact cttagtggat attcaacagt ggggttattc tggtaaccta caatttaacc 17700
atgatttgca ttgtaatgtg catggacacg cacatgtagc ttctgcggat gctattatga 17760
cgcgttgtct tgcaattaat aatgcatttt gtcaagatgt caactgggat ttaacttacc 17820
ctcatatagc aaatgaggat gaagtcaatt ctagctgtag atatttacaa cgcatgtatc 17880
ttaatgcatg tgttgatgct cttaaagtta acgttgtcta tgatataggc aaccctaaag 17940
gtataaaatg tgttagacgt ggagacttaa attttagatt ctatgataag aatccaatag 18000
tacccaatgt caagcagttt gagtatgact ataatcagca caaagataag tttgctgatg 18060
gtctttgtat gttttggaat tgtaatgtgg attgttatcc cgacaattcc ttagtttgta 18120
ggtacgacac acgaaatttg agtgtgttta acctacctgg ttgtaatggt ggtagcttgt 18180
atgttaacaa gcatgcattc cacacaccta aatttgatcg cactagcttt cgtaatttga 18240
aagctatgcc attctttttc tatgactcat cgccttgcga gaccattcaa ttggatggag 18300
ttgcgcaaga ccttgtgtca ttagctacga aagattgtat cacaaaatgc aacataggcg 18360
gtgctgtttg taaaaagcac gcacaaatgt atgcagattt tgtgacttct tataatgcag 18420
ctgttactgc tggttttact ttttgggtta ctaataattt taacccatat aatttgtgga 18480
aaagtttttc agctctccag tctatcgaca atattgctta taatatgtat aagggtggtc 18540
attatgatgc tattgcagga gaaatgccca ctatcgtaac tggagataaa gtttttgtta 18600
tagatcaagg cgtagaaaaa gcagtttttt ttaatcaaac aattctgcct acatctgtag 18660
cgtttgagct gtatgcgaag agaaatattc gcacactgcc aaacaaccgt attttgaaag 18720
gtttgggtgt agatgtgact aatggatttg taatttggga ttacacgaac caaacaccac 18780
tataccgtaa tactgttaag gtatgtgcat atacagacat agaaccaaat ggcctaatag 18840
tgctgtatga tgatagatat ggtgattacc agtcttttct agctgctgat aatgctgttt 18900
tagtttctac acagtgttac aagcggtatt cgtatgtaga aataccgtca aacctgcttg 18960
ttcagaacgg tattccgtta aaagatggag cgaacctgta tgtttataag cgtgttaatg 19020
gtgcgtttgt tacgctacct aacacattaa acacacaggg tcgcagttat gaaacttttg 19080
aacctcgtag tgatgttgag cgtgattttc tcgacatgtc tgaggagagt tttgtagaaa 19140
agtatggtaa agaattaggt ctacagcaca tactgtatgg tgaagttgat aagccccaat 19200
taggtggttt acacactgtt ataggtatgt gcagactttt acgtgcgaat aagttgaacg 19260
caaagtctgt tactaattct gattctgatg tcatgcaaaa ttattttgta ttggcagaca 19320
atggttccta caagcaagtg tgtactgttg tggatttgct gcttgatgat ttcttagaac 19380
ttcttaggaa catactgaaa gagtatggta ctaataagtc taaagttgta acagtgtcaa 19440
ttgattacca tagcataaat tttatgactt ggtttgaaga tggcattatt aaaacatgtt 19500
atccacagct tcaatcagca tggacgtgtg gttataatat gcctgaactt tataaagttc 19560
agaattgtgt tatggaacct tgcaacattc ctaattatgg tgttggaata gcgttgccaa 19620
gtggtattat gatgaatgtg gcaaagtata cacaactctg tcaatacctt tcgaaaacaa 19680
caatgtgtgt accgcataat atgcgagtaa tgcattttgg agctggaagt gacaaaggag 19740
tggctccagg tagtactgtt cttaaacaat ggctcccaga agggacactc cttgtcgata 19800
atgatattgt agactatgtg tctgatgcac atgtttctgt gctttcagat tgcaataaat 19860
ataagacaga gcacaagttt gatcttgtga tatctgatat gtatacagac aatgattcaa 19920
aaagaaagca tgaaggcgtg atagccaata atggcaatga tgacgttttc atatatctct 19980
caagttttct tcgtaataat ttggctctag gtggtagttt tgctgtaaaa gtgacagaga 20040
caagttggca cgaagtttta tatgacattg cacaggattg tgcatggtgg acaatgtttt 20100
gtacagcagt gaatgcctct tcttcagaag cattcttggt tggtgttaat tatttgggtg 20160
caagtgaaaa ggttaaggtt agtggaaaaa cgctgcacgc aaattatata ttttggagga 20220
attgtaatta tttacaaacc tctgcttata gtatatttga cgttgctaag tttgatttga 20280
gattgaaagc aacaccagtt gttaatttga aaactgaaca aaagacagac ttagtcttta 20340
atttaattaa gtgtggtaag ttactggtaa gagatgttgg taacacctct tttactagtg 20400
actcttttgt gtgtactatg tagtgctgct ttgtatgaca gtagttctta cgtttactac 20460
taccaaagtg cctttagacc acctaatggt tggcatttac acgggggtgc ttatgcggta 20520
gttaatattt ctagcgaatc taataatgca ggctcttcac ctgggtgtat tgttggtact 20580
attcatggtg gtcgtgttgt taatgcttct tctatagcta tgacggcacc gtcatcaggt 20640
atggcttggt ctagcagtca gttttgtact gcacactgta acttttcaga tactacagtg 20700
tttgttacac attgttataa atatgatggg tgtcctataa ctggcatgct tcaaaagaat 20760
tttttacgtg tttctgctat gaaaaatggc cagcttttct ataatttaac agttagtgta 20820
gctaagtacc ctacttttaa atcatttcag tgtgttaata atttaacatc cgtatattta 20880
aatggtgatc ttgtttacac ctctaatgag accacagatg ttacatctgc aggtgtttat 20940
tttaaagctg gtggacctat aacttataaa gttatgagag aagttaaagc cctggcttat 21000
tttgttaatg gtactgcaca agatgttatt ttgtgtgatg gatcacctag aggcttgtta 21060
gcatgccagt ataatactgg caatttttca gatggctttt atccttttat taatagtagt 21120
ttagttaagc agaagtttat tgtctatcgt gaaaatagtg ttaatactac ttttacgtta 21180
cacaatttca cttttcataa tgagactggc gccaacccta atcctagtgg tgttcagaat 21240
attcaaactt accaaacaca aacagctcag agtggttatt ataattttaa tttttccttt 21300
ctgagtagtt ttgtttataa ggagtctaat tttatgtatg gatcttatca cccaagttgt 21360
aattttagac tagaaactat taataatggc ttgtggttta attcactttc agtttcaatt 21420
gcttacggtc ctcttcaagg tggttgcaag caatctgtct ttagtggtag agcaacttgt 21480
tgttatgctt attcatatgg aggtccttcg ctgtgtaaag gtgtttattc aggtgagtta 21540
gatcttaatt ttgaatgtgg actgttagtt tatgttacta agagcggtgg ctctcgtata 21600
caaacagcca ctgaaccgcc agttataact cgacacaatt ataataatat tactttaaat 21660
acttgtgttg attataatat atatggcaga actggccaag gttttattac taatgtaacc 21720
gactcagctg ttagttataa ttatctagca gacgcaggtt tggctatttt agatacatct 21780
ggttccatag acatctttgt tgtacaaggt gaatatggtc ttacttatta taaggttaac 21840
ccttgcgaag atgtcaacca gcagtttgta gtttctggtg gtaaattagt aggtattctt 21900
acttcacgta atgagactgg ttctcagctt cttgagaacc agttttacat taaaatcact 21960
aatggaacac gtcgttttag acgttctatt actgaaaatg ttgcaaattg cccttatgtt 22020
agttatggta agttttgtat aaaacctgat ggttcaattg ccacaatagt accaaaacaa 22080
ttggaacagt ttgtggcacc tttacttaat gttactgaaa atgtgctcat acctaacagt 22140
tttaatttaa ctgttacaga tgagtacata caaacgcgta tggataaggt ccaaattaat 22200
tgtctgcagt atgtttgtgg caattctctg gattgtagag atttgtttca acaatatggg 22260
cctgtttgtg acaacatatt gtctgtagta aatagtattg gtcaaaaaga agatatggaa 22320
cttttgaatt tctattcttc tactaaaccg gctggtttta atacaccatt tcttagtaat 22380
gttagcactg gtgagtttaa tatttctctt ctgttaacaa ctcctagtag tcctagaagg 22440
cgttctttta ttgaagacct tctatttaca agcgttgaat ctgttggatt accaacagat 22500
gacgcataca aaaattgcac tgcaggacct ttaggttttc ttaaggacct tgcgtgtgct 22560
cgtgaatata atggtttgct tgtgttgcct cccattataa cagcagaaat gcaaattttg 22620
tatactagtt ctctagtagc ttctatggct tttggtggta ttactgcagc tggtgctata 22680
ccttttgcca cacaactgca ggctagaatt aatcacttgg gtattaccca gtcacttttg 22740
ttgaagaatc aagaaaaaat tgctgcttcc tttaataagg ccattggtcg tatgcaggaa 22800
ggttttagaa gtacatctct agcattacaa caaattcaag atgttgttaa taagcagagt 22860
gctattctta ctgagactat ggcatcactt aataaaaatt ttggtgctat ttcttctatg 22920
attcaagaaa tctaccagca acttgacgcc atacaagcaa atgctcaagt ggatcgtctt 22980
ataactggta gattgtcatc actttctgtt ttagcatctg ctaagcaggc ggagcatatt 23040
agagtgtcac aacagcgtga gttagctact cagaaaatta atgagtgtgt taagtcacag 23100
tctattaggt actccttttg tggtaatgga cgacatgttc taaccatacc gcaaaatgca 23160
cctaatggta tagtgtttat acacttttct tatactccag atagttttgt taatgttact 23220
gcaatagtgg gtttttgtgt aaagccagct aatgctagtc agtatgcaat agtacccgct 23280
aatggtaggg gtatttttat acaagttaat ggtagttact acatcacagc acgagatatg 23340
tatatgccaa gagctattac tgcaggagat atagttacgc ttacttcttg tcaagcaaat 23400
tatgtaagtg taaataagac cgtcattact acattcgtag acaatgatga ttttgatttt 23460
aatgacgaat tgtcaaaatg gtggaatgac actaagcatg agctaccaga ctttgacaaa 23520
ttcaattaca cagtacctat acttgacatt gatagtgaaa ttgatcgtat tcaaggcgtt 23580
atacagggtc ttaatgactc tttaatagac cttgaaaaac tttcaatact caaaacttat 23640
attaagtggc cttggtatgt gtggttagcc atagcttttg ccactattat cttcatctta 23700
atactaggat gggttttctt catgactgga tgttgtggtt gttgttgtgg atgctttggc 23760
attatgcctc taatgagtaa gtgtggtaag aaatcttctt attacacgac ttttgataac 23820
gatgtggtaa cttaacaata cagacctaaa aagtctgttt aatgattcaa agtcccacgt 23880
ccttcctaat agtattaatt tttctttggt gtaaacttgt actaagttgt tttagagagt 23940
ttattatagc gctccaacaa ctaatacaag ttttactcca aattatcaat agtaacttac 24000
agcctagact gaccctttgt cacagtctag actaatgtta aacttagaag caattattga 24060
aactggtgag caagtgattc aaaaaatcag tttcaattta cagcatattt caagtgtatt 24120
aaacacagaa gtatttgacc cctttgacta ttgttattac agaggaggta atttttggga 24180
aatagagtca gctgaagatt gttcaggtga tgatgaattt attgaataag tcgctagagg 24240
aaaatggaag ttttctaaca gcgctttata tatttgtagg atttttagca ctttatcttc 24300
taggtagagc acttcaagca tttgtacagg ctgctgatgc ttgttgttta ttttggtata 24360
catgggtagt aattccagga gctaagggta cagcctttgt atataagtat acatatggta 24420
gaaaacttaa caatccggaa ttagaagcag ttattgtcaa cgagtttcct aagaacggtt 24480
ggaataataa aaatccagca aattttcaag atgtccaacg agacaaattg tactcttgac 24540
tttgaacagt cagttgagct ttttaaagag tataatttat ttataactgc attcttgttg 24600
ttcttaacca taatacttca gtatggctat gcaacaagaa gtaagtttat ttatatactg 24660
aaaatgatag tgttatggtg cttttggccc cttaacattg cagtaggtgt aatttcatgt 24720
atatacccac caaacacagg aggtcttgtc gcagcgataa tacttacagt gtttgcgtgt 24780
ctgtcttttg taggttattg gatccagagt attagactct ttaagcggtg taggtcatgg 24840
tggtcattta acccagaatc taatgccgta ggttcaatac tcctaactaa tggtcaacaa 24900
tgtaattttg ctatagagag tgtgccaatg gtgctttctc caattataaa gaatggtgtt 24960
ctttattgtg agggtcagtg gcttgctaag tgtgaaccag accacttgcc taaagatata 25020
tttgtttgta caccggatag acgtaatatc taccgtatgg tgcagaaata tactggtgac 25080
caaagcggaa ataagaaacg gtttgctacg tttgtctatg caaagcagtc agtagatact 25140
ggcgagctag aaagtgtagc aacaggaggg agtagtcttt acacctaaat gtgtgtgtgt 25200
agagagtatt taaaattatt ctttaatagt gcctctattt taagagcgca taatagtatt 25260
atttttgagg atattaatat aaatcctctc tgttttatac tctcttttca agagctatta 25320
tttaaaaaac agtttttcca ctcttttgtg ccaaaaacta ttgttgttaa tggtgtaacc 25380
tttcaagtag ataatggaaa agtctactac gaaggaaaac caatttttca gaaaggttgt 25440
tgtaggttgt ggttgagtta taaaaaagat taaactacct actacactta tttttataag 25500
aggcgtttta tcttacaagc gcttaataaa tacggacgat gaaatggctg actagttttg 25560
taagggcagt tatttcatgt tataaacccc tattattaac tcaattaaga gtattagata 25620
ggttaatctt agatcatgga ccaaaacaca tcttaacgtg tgttaggtgc gtgattttgt 25680
ttcaattaga tttagtttat aggttggcgt atacgcctac tcaatcgctg gtatgaataa 25740
tagtaaagat aatccttttt gcggagcaat agcaagaaaa gcgcgaattt atctgagaga 25800
aggattagat tgtgtttact ttcttaacaa agcaggacaa gcagagtctt gtcccgcgtg 25860
tacctctcta gtattccagg ggaaaacttg tgaggaacac aaatataata ataatctttt 25920
gtcatggcaa gcggtaaggc aactggaaag acagatgccc cagctccagt catcaaacta 25980
ggaggaccaa agccacctaa agttggttct tctggaaatg tatcttggtt tcaagcaata 26040
aaagccaaga agttaaattc acctccgcct aagtttgaag gtagcggtgt tcctgataat 26100
gaaaatctaa aaccaagtca gcagcatgga tattggagac gccaagctag gtttaagcca 26160
ggtaaaggtg gaagaaaacc agtcccagat gcttggtatt tttactatac tggaacagga 26220
ccagccgcta acctgaattg gggtgatagc caagatggta tagtgtgggt tgctggtaag 26280
ggtgctgata ctaaatttag atctaatcag ggtactcgtg actctgacaa gtttgaccaa 26340
tatccgctac ggttttcaga cggaggacct gatggtaatt tccgttggga tttcattcct 26400
ctgaatcgtg gcaggagtgg gagatcaaca gcagcttcat cagcagcatc tagtagagca 26460
ccatcacgtg aagtttcgcg tggtcgcagg agtggttctg aagatgatct tattgctcgt 26520
gcagcaagga taattcagga tcagcagaag aagggttctc gcattacaaa ggctaaggct 26580
gatgaaatgg ctcaccgccg gtattgcaag cgcactattc cacctaatta taaggttgat 26640
caagtgtttg gtccccgtac taaaggtaag gagggaaatt ttggtgatga caagatgaat 26700
gaggaaggta ttaaggatgg gcgcgttaca gcaatgctca acctagttcc tagcagccat 26760
gcttgtcttt tcggaagtag agtgacgccc agacttcaac cagatgggct gcacttgaaa 26820
tttgaattta ctactgtggt cccacgtgat gatccgcagt ttgataatta tgtaaaaatt 26880
tgtgatcagt gtgttgatgg tgtaggaaca cgtccaaaag atgatgaacc aagaccaaag 26940
tcacgctcaa gttcaagacc tgcaacaaga ggaaattctc cagcgccaag acagcagcgc 27000
cctaagaagg agaaaaagcc aaagaagcag gatgatgaag tggataaagc attgacctca 27060
gatgaggaga ggaacaatgc acagctggaa tttgatgatg aacccaaggt aattaactgg 27120
ggggattcag ccctaggaga gaatgaactt tgagtaaaat tcaatagtaa gagttaagga 27180
agataggcat gtagcttgat tacctacatg tctatcgcca gggaaatgtc taatttgtct 27240
acttagtagc ctggaaacga acggtagacc cttagatttt aatttagttt aatttttagt 27300
ttagtttaag ttagtttaga gtaggtataa agatgccagt gccggggcca cgcggagtac 27360
gaccgagggt acagcactag gacgcccatt aggggaagag ctaaatttta gtttaagtta 27420
agtttaattg gctatgtata gttaaaattt ataggctagt atagagttag agcaaaaaaa 27480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 27500
<210> 2
<211> 709
<212> DNA
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<400> 2
cttaacaata cagacctaaa aagtctgttt aatgattcaa agtcccacgt ccttcctaat 60
agtattaatt tttctttggt gtaaacttgt actaagttgt tttagagagt ttattatagc 120
gctccaacaa ctaatacaag ttttactcca aattatcaat agtaacttac agcctagact 180
gaccctttgt cacagtctag actaatgtta aacttagaag caattattga aactggtgag 240
caagtgattc aaaaaatcag tttcaattta cagcatattt caagtgtatt aaacacagaa 300
gtatttgacc cctttgacta ttgttattac agaggaggta atttttggga aatagagtca 360
gctgaagatt gttcaggtga tgatgaattt attgaataag tcgctagagg aaaatggaag 420
ttttctaaca gcgctttata tatttgtagg atttttagca ctttatcttc taggtagagc 480
acttcaagca tttgtacagg ctgctgatgc ttgttgttta ttttggtata catgggtagt 540
aattccagga gctaagggta cagcctttgt atataagtat acatatggta gaaaacttaa 600
caatccggaa ttagaagcag ttattgtcaa cgagtttcct aagaacggtt ggaataataa 660
aaatccagca aattttcaag atgtccaacg agacaaattg tactcttga 709
<210> 3
<211> 57
<212> PRT
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<400> 3
Met Ile Gln Ser Pro Thr Ser Phe Leu Ile Val Leu Ile Phe Leu Trp
1 5 10 15
Cys Lys Leu Val Leu Ser Cys Phe Arg Glu Phe Ile Ile Ala Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Ile Gln Val Leu Leu Gln Ile Ile Asn Ser Asn Leu Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Thr Leu Cys His Ser Leu Asp
50 55
<210> 4
<211> 64
<212> PRT
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<400> 4
Met Leu Asn Leu Glu Ala Ile Ile Glu Thr Gly Glu Gln Val Ile Gln
1 5 10 15
Lys Ile Ser Phe Asn Leu Gln His Ile Ser Ser Val Leu Asn Thr Glu
20 25 30
Val Phe Asp Pro Phe Asp Tyr Cys Tyr Tyr Arg Gly Gly Asn Phe Trp
35 40 45
Glu Ile Glu Ser Ala Glu Asp Cys Ser Gly Asp Asp Glu Phe Ile Glu
50 55 60
<210> 5
<211> 4782
<212> DNA
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<400> 5
ggtaaaactg tcacctttgg agaaactact gtgcaagaaa taccaccacc tgatgttgtg 60
tttattaagg ttagcattga gtgttgtggt gaaccatgga atacaatctt caaaaaggct 120
tataaggagc ccattgaagt agagacagac ctcacagttg aacaattgct ctctgtggtc 180
tatgagaaaa tgtgtgatga tctcaagctg tttccggagg ctccagaacc accaccattt 240
gagaatgtca cacttgttga taagaatggt aaagatttgg attgcataaa atcatgccat 300
ctgatctatc gtgattatga gagcgatgat gacatcgagg aagaagatgc agaagaatgt 360
gacacggatt caggtgatgc tgaggagtgt gacactaatt cagaatgtga agaagaagat 420
gaggatacta aagtgttggc tcttatacaa gacccggcaa gtaacaaata tcctctgcct 480
cttgatgatg attatagcgt ctacaatgga tgtattgttc ataaggacgc tctcgatgtt 540
gtgaatttac catctggtga agaaaccttt gttgtcaata actgctttga aggggctgtt 600
aaagctcttc cgcagaaagt tattgatgtt ctaggtgact ggggtgaggc tgttgatgcg 660
caagaacaat tgtgtcaaca agaatcaact cgggtcatat ctgagaaatc agttgagggt 720
tttactggta gttgtgatgc aatggctgaa caagctattg ttgaagagca ggaaatagta 780
cctgttgttg aacaaagtca ggatgtagtt gtttttacac ctgcagacct agaagttgtt 840
aaagaaacag cagaagaggt tgatgagttt attctcattt ctgctgtccc taaagaagaa 900
gttgtgtctc aggagaaaga ggagccacag gttgagcaag agcctaccct agttgttaaa 960
gcacaacgtg agaagaaggc taaaaagttc aaagttaaac cagctacatg tgaaaaaccc 1020
aaatttttgg agtacaaaac atgtgtgggt gatttggctg ttgtaattgc caaagcattg 1080
gatgagttta aagagttctg cattgtaaac gctgcaaatg agcacatgtc gcatggtggt 1140
ggcgttgcaa aggcaattgc agacttttgt ggaccggact ttgttgaata ttgcgcggac 1200
tatgttaaga aacatggtcc acagcaaaaa cttgtcacac cttcatttgt taaaggcatt 1260
caatgtgtga ataatgttgt aggacctcgc catggagaca gcaacttgcg tgagaagctt 1320
gttgctgctt acaagagtgt tcttgtaggt ggagtggtta actatgttgt gccagttctc 1380
tcatcaggga tttttggtgt agattttaaa atatcaatag atgctatgcg cgaagctttt 1440
aaaggttgtg ccatacgcgt tcttttattt tctctgagtc aagaacacat cgattatttc 1500
gatgcaactt gtaagcagaa gacaatttat cttacggagg atggtgttaa ataccgctct 1560
gttgttttaa aacctggtga ttctttgggt caatttggac aggtttttgc aagaaataag 1620
gtagtctttt cggctgatga tgttgaggat aaagaaatcc tctttatacc cacaactgac 1680
aagactattc ttgaatatta tggtttagat gcgcaaaagt atgtaacata tttgcaaacg 1740
cttgcgcaga aatgggatgt tcaatataga gacaattttg ttatattaga gtggcgtgac 1800
ggaaattgct ggattagttc agcaatagtt ctccttcaag ctgctaaaat tagatttaaa 1860
ggttttcttg cagaagcatg ggctaaactg ttgggtggag atcctacaga ctttgttgcc 1920
tggtgttatg caagttgcaa tgctaaagta ggtgattttt cagatgctaa ttggcttttg 1980
gccaatttag cagaacattt tgacgcagat tacacaaatg cacttcttaa gaagtgtgtg 2040
tcgtgcaatt gtggtgttaa gagttatgaa cttaggggtc ttgaagcctg tattcagcca 2100
gttcgagcac ctaatcttct acattttaaa acgcaatatt caaattgccc aacctgtggt 2160
gcaagtagta cggatgaagt aatagaagct tcattaccgt acttattgct ttttgctact 2220
gatggtcctg ctacagttga ttgtgatgaa aatgctgtag ggactgttgt tttcattggc 2280
tctactaata gtggccattg ttatacacaa gccgatggta aggcttttga caatcttgct 2340
aaggatagaa aatttggaag gaagtcgcct tacattacag caatgtatac acgtttttct 2400
cttaggagtg aaaatcccct acttgttgtt gaacatagta agggtaaagc taaagtagta 2460
aaagaagatg tttctaacct tgctactagt tctaaagcca gttttgacga tcttactgac 2520
tttgaacagt ggtatgatag caacatctat gagagtctta aagtgcagga gacacctgat 2580
aatcttgatg aatatgtgtc atttacgaca aaggaagatt ctaagttgcc actgacactt 2640
aaagttagag gtatcaaatc agttgttgac tttaggtcta aggatggttt tacttataag 2700
ttaacacctg atactgatga aaattcaaaa acaccagtct actacccagt cttggattct 2760
attagtctta gggcaatatg ggttgaaggc agtgctaatt ttgttgttgg gcatccaaat 2820
tattatagta agtctctccg aattcccacg ttttgggaaa atgccgagag ctttgttaaa 2880
atgggttata aaattgatgg tgtaactatg ggcctttggc gtgcagaaca ccttaataaa 2940
cctaatttgg agagaatttt taacattgct aagaaagcta ttgttggatc tagtgttgtt 3000
actacgcagt gtggtaaaat actagttaaa gcagctacat acgttgccga taaagtaggt 3060
gatggtgtag ttcgcaatat tacagataga attaagggtc tttgtggatt cacacgtggc 3120
cattttgaaa agaaaatgtc cctacaattt ctaaagacac ttgtgttctt tttcttttat 3180
ttcttaaagg ctagtgctaa gagtttagtt tctagctata agattgtgtt atgtaaggtg 3240
gtgtttgcta ccttacttat agtgtggttt atatacacaa gtaatccagt agtgtttact 3300
ggaatacgtg tgctagactt cctatttgaa ggttctttat gtggtcctta taatgactac 3360
ggtaaagatt cttttgatgt gttacgctat tgtgcaggtg attttacttg tcgtgtgtgt 3420
ttacatgata gagattcact tcatctgtac aaacatgctt atagcgtaga acaaatttat 3480
aaggatgcag cttctggcat taactttaat tggaattggc tttatttggt ctttctaata 3540
ttatttgtta agccagtggc aggttttgtt attatttgtt attgtgttaa gtatttggta 3600
ttgagttcaa ctgtgttgca aactggtgta ggttttctag attggtttgt aaaaacagtt 3660
tttacccatt ttaattttat gggagcggga ttttatttct ggctctttta caagatatac 3720
gtacaagtgc atcatatatt gtactgtaag gatgtaacat gtgaagtgtg caagagagtt 3780
gcacgcagca acaggcaaga ggttagcgtt gtagttggtg gacgcaagca aatagtgcat 3840
gtttacacta attctggcta taacttttgt aagagacata attggtattg tagaaattgt 3900
gatgattatg gtcaccaaaa tacatttatg tcccctgaag ttgctggcga gctttctgaa 3960
aagcttaagc gccatgttaa acctacagca tatgcttacc acgttgtgta tgaggcatgc 4020
gtggttgatg attttgttaa tttaaaatat aaggctgcaa ttcctggtaa ggataatgca 4080
tcttctgctg ttaagtgttt cagtgttaca gattttttaa agaaagctgt ttttcttaag 4140
gaggcattga aatgtgaaca aatatctaat gatggtttta tagtgtgtaa tacacagagt 4200
gcgcatgcac tagaggaagc aaagaatgca gccgtctatt atgcgcaata tctgtgtaag 4260
ccaatactta tacttgacca ggcactttat gagcaattaa tagtagagcc tgtgtctaag 4320
agtgttatag ataaagtgtg tagcattttg tctaatataa tatctgtaga tactgcagct 4380
ttaaattata aggcaggcac acttcgtgat gctctgcttt ctattactaa agacgaagaa 4440
gccgtagata tggctatctt ctgccacaat catgaagtgg aatacactgg tgacggtttt 4500
actaatgtga taccgtcata tggtatggac actgataagt tgacacctcg tgatagaggg 4560
tttttgataa atgcagatgc ttctattgct aatttaagag tcaaaaatgc tcctccggta 4620
gtatggaagt tttctgatct tattaaattg tctgacagtt gccttaaata tttaatttca 4680
gctactgtca agtcaggagg tcgtttcttt ataacaaagt ctggtgctaa acaagttatt 4740
tcttgtcata cccagaaact gttggtagag aaaaaggcag gt 4782
<210> 6
<211> 1594
<212> PRT
<213> 禽传染性支气管炎病毒
<400> 6
Gly Lys Thr Val Thr Phe Gly Glu Thr Thr Val Gln Glu Ile Pro Pro
1 5 10 15
Pro Asp Val Val Phe Ile Lys Val Ser Ile Glu Cys Cys Gly Glu Pro
20 25 30
Trp Asn Thr Ile Phe Lys Lys Ala Tyr Lys Glu Pro Ile Glu Val Glu
35 40 45
Thr Asp Leu Thr Val Glu Gln Leu Leu Ser Val Val Tyr Glu Lys Met
50 55 60
Cys Asp Asp Leu Lys Leu Phe Pro Glu Ala Pro Glu Pro Pro Pro Phe
65 70 75 80
Glu Asn Val Thr Leu Val Asp Lys Asn Gly Lys Asp Leu Asp Cys Ile
85 90 95
Lys Ser Cys His Leu Ile Tyr Arg Asp Tyr Glu Ser Asp Asp Asp Ile
100 105 110
Glu Glu Glu Asp Ala Glu Glu Cys Asp Thr Asp Ser Gly Asp Ala Glu
115 120 125
Glu Cys Asp Thr Asn Ser Glu Cys Glu Glu Glu Asp Glu Asp Thr Lys
130 135 140
Val Leu Ala Leu Ile Gln Asp Pro Ala Ser Asn Lys Tyr Pro Leu Pro
145 150 155 160
Leu Asp Asp Asp Tyr Ser Val Tyr Asn Gly Cys Ile Val His Lys Asp
165 170 175
Ala Leu Asp Val Val Asn Leu Pro Ser Gly Glu Glu Thr Phe Val Val
180 185 190
Asn Asn Cys Phe Glu Gly Ala Val Lys Ala Leu Pro Gln Lys Val Ile
195 200 205
Asp Val Leu Gly Asp Trp Gly Glu Ala Val Asp Ala Gln Glu Gln Leu
210 215 220
Cys Gln Gln Glu Ser Thr Arg Val Ile Ser Glu Lys Ser Val Glu Gly
225 230 235 240
Phe Thr Gly Ser Cys Asp Ala Met Ala Glu Gln Ala Ile Val Glu Glu
245 250 255
Gln Glu Ile Val Pro Val Val Glu Gln Ser Gln Asp Val Val Val Phe
260 265 270
Thr Pro Ala Asp Leu Glu Val Val Lys Glu Thr Ala Glu Glu Val Asp
275 280 285
Glu Phe Ile Leu Ile Ser Ala Val Pro Lys Glu Glu Val Val Ser Gln
290 295 300
Glu Lys Glu Glu Pro Gln Val Glu Gln Glu Pro Thr Leu Val Val Lys
305 310 315 320
Ala Gln Arg Glu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Lys Val Lys Pro Ala Thr
325 330 335
Cys Glu Lys Pro Lys Phe Leu Glu Tyr Lys Thr Cys Val Gly Asp Leu
340 345 350
Ala Val Val Ile Ala Lys Ala Leu Asp Glu Phe Lys Glu Phe Cys Ile
355 360 365
Val Asn Ala Ala Asn Glu His Met Ser His Gly Gly Gly Val Ala Lys
370 375 380
Ala Ile Ala Asp Phe Cys Gly Pro Asp Phe Val Glu Tyr Cys Ala Asp
385 390 395 400
Tyr Val Lys Lys His Gly Pro Gln Gln Lys Leu Val Thr Pro Ser Phe
405 410 415
Val Lys Gly Ile Gln Cys Val Asn Asn Val Val Gly Pro Arg His Gly
420 425 430
Asp Ser Asn Leu Arg Glu Lys Leu Val Ala Ala Tyr Lys Ser Val Leu
435 440 445
Val Gly Gly Val Val Asn Tyr Val Val Pro Val Leu Ser Ser Gly Ile
450 455 460
Phe Gly Val Asp Phe Lys Ile Ser Ile Asp Ala Met Arg Glu Ala Phe
465 470 475 480
Lys Gly Cys Ala Ile Arg Val Leu Leu Phe Ser Leu Ser Gln Glu His
485 490 495
Ile Asp Tyr Phe Asp Ala Thr Cys Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Thr
500 505 510
Glu Asp Gly Val Lys Tyr Arg Ser Val Val Leu Lys Pro Gly Asp Ser
515 520 525
Leu Gly Gln Phe Gly Gln Val Phe Ala Arg Asn Lys Val Val Phe Ser
530 535 540
Ala Asp Asp Val Glu Asp Lys Glu Ile Leu Phe Ile Pro Thr Thr Asp
545 550 555 560
Lys Thr Ile Leu Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Ala Gln Lys Tyr Val Thr
565 570 575
Tyr Leu Gln Thr Leu Ala Gln Lys Trp Asp Val Gln Tyr Arg Asp Asn
580 585 590
Phe Val Ile Leu Glu Trp Arg Asp Gly Asn Cys Trp Ile Ser Ser Ala
595 600 605
Ile Val Leu Leu Gln Ala Ala Lys Ile Arg Phe Lys Gly Phe Leu Ala
610 615 620
Glu Ala Trp Ala Lys Leu Leu Gly Gly Asp Pro Thr Asp Phe Val Ala
625 630 635 640
Trp Cys Tyr Ala Ser Cys Asn Ala Lys Val Gly Asp Phe Ser Asp Ala
645 650 655
Asn Trp Leu Leu Ala Asn Leu Ala Glu His Phe Asp Ala Asp Tyr Thr
660 665 670
Asn Ala Leu Leu Lys Lys Cys Val Ser Cys Asn Cys Gly Val Lys Ser
675 680 685
Tyr Glu Leu Arg Gly Leu Glu Ala Cys Ile Gln Pro Val Arg Ala Pro
690 695 700
Asn Leu Leu His Phe Lys Thr Gln Tyr Ser Asn Cys Pro Thr Cys Gly
705 710 715 720
Ala Ser Ser Thr Asp Glu Val Ile Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Leu Leu
725 730 735
Leu Phe Ala Thr Asp Gly Pro Ala Thr Val Asp Cys Asp Glu Asn Ala
740 745 750
Val Gly Thr Val Val Phe Ile Gly Ser Thr Asn Ser Gly His Cys Tyr
755 760 765
Thr Gln Ala Asp Gly Lys Ala Phe Asp Asn Leu Ala Lys Asp Arg Lys
770 775 780
Phe Gly Arg Lys Ser Pro Tyr Ile Thr Ala Met Tyr Thr Arg Phe Ser
785 790 795 800
Leu Arg Ser Glu Asn Pro Leu Leu Val Val Glu His Ser Lys Gly Lys
805 810 815
Ala Lys Val Val Lys Glu Asp Val Ser Asn Leu Ala Thr Ser Ser Lys
820 825 830
Ala Ser Phe Asp Asp Leu Thr Asp Phe Glu Gln Trp Tyr Asp Ser Asn
835 840 845
Ile Tyr Glu Ser Leu Lys Val Gln Glu Thr Pro Asp Asn Leu Asp Glu
850 855 860
Tyr Val Ser Phe Thr Thr Lys Glu Asp Ser Lys Leu Pro Leu Thr Leu
865 870 875 880
Lys Val Arg Gly Ile Lys Ser Val Val Asp Phe Arg Ser Lys Asp Gly
885 890 895
Phe Thr Tyr Lys Leu Thr Pro Asp Thr Asp Glu Asn Ser Lys Thr Pro
900 905 910
Val Tyr Tyr Pro Val Leu Asp Ser Ile Ser Leu Arg Ala Ile Trp Val
915 920 925
Glu Gly Ser Ala Asn Phe Val Val Gly His Pro Asn Tyr Tyr Ser Lys
930 935 940
Ser Leu Arg Ile Pro Thr Phe Trp Glu Asn Ala Glu Ser Phe Val Lys
945 950 955 960
Met Gly Tyr Lys Ile Asp Gly Val Thr Met Gly Leu Trp Arg Ala Glu
965 970 975
His Leu Asn Lys Pro Asn Leu Glu Arg Ile Phe Asn Ile Ala Lys Lys
980 985 990
Ala Ile Val Gly Ser Ser Val Val Thr Thr Gln Cys Gly Lys Ile Leu
995 1000 1005
Val Lys Ala Ala Thr Tyr Val Ala Asp Lys Val Gly Asp Gly Val
1010 1015 1020
Val Arg Asn Ile Thr Asp Arg Ile Lys Gly Leu Cys Gly Phe Thr
1025 1030 1035
Arg Gly His Phe Glu Lys Lys Met Ser Leu Gln Phe Leu Lys Thr
1040 1045 1050
Leu Val Phe Phe Phe Phe Tyr Phe Leu Lys Ala Ser Ala Lys Ser
1055 1060 1065
Leu Val Ser Ser Tyr Lys Ile Val Leu Cys Lys Val Val Phe Ala
1070 1075 1080
Thr Leu Leu Ile Val Trp Phe Ile Tyr Thr Ser Asn Pro Val Val
1085 1090 1095
Phe Thr Gly Ile Arg Val Leu Asp Phe Leu Phe Glu Gly Ser Leu
1100 1105 1110
Cys Gly Pro Tyr Asn Asp Tyr Gly Lys Asp Ser Phe Asp Val Leu
1115 1120 1125
Arg Tyr Cys Ala Gly Asp Phe Thr Cys Arg Val Cys Leu His Asp
1130 1135 1140
Arg Asp Ser Leu His Leu Tyr Lys His Ala Tyr Ser Val Glu Gln
1145 1150 1155
Ile Tyr Lys Asp Ala Ala Ser Gly Ile Asn Phe Asn Trp Asn Trp
1160 1165 1170
Leu Tyr Leu Val Phe Leu Ile Leu Phe Val Lys Pro Val Ala Gly
1175 1180 1185
Phe Val Ile Ile Cys Tyr Cys Val Lys Tyr Leu Val Leu Ser Ser
1190 1195 1200
Thr Val Leu Gln Thr Gly Val Gly Phe Leu Asp Trp Phe Val Lys
1205 1210 1215
Thr Val Phe Thr His Phe Asn Phe Met Gly Ala Gly Phe Tyr Phe
1220 1225 1230
Trp Leu Phe Tyr Lys Ile Tyr Val Gln Val His His Ile Leu Tyr
1235 1240 1245
Cys Lys Asp Val Thr Cys Glu Val Cys Lys Arg Val Ala Arg Ser
1250 1255 1260
Asn Arg Gln Glu Val Ser Val Val Val Gly Gly Arg Lys Gln Ile
1265 1270 1275
Val His Val Tyr Thr Asn Ser Gly Tyr Asn Phe Cys Lys Arg His
1280 1285 1290
Asn Trp Tyr Cys Arg Asn Cys Asp Asp Tyr Gly His Gln Asn Thr
1295 1300 1305
Phe Met Ser Pro Glu Val Ala Gly Glu Leu Ser Glu Lys Leu Lys
1310 1315 1320
Arg His Val Lys Pro Thr Ala Tyr Ala Tyr His Val Val Tyr Glu
1325 1330 1335
Ala Cys Val Val Asp Asp Phe Val Asn Leu Lys Tyr Lys Ala Ala
1340 1345 1350
Ile Pro Gly Lys Asp Asn Ala Ser Ser Ala Val Lys Cys Phe Ser
1355 1360 1365
Val Thr Asp Phe Leu Lys Lys Ala Val Phe Leu Lys Glu Ala Leu
1370 1375 1380
Lys Cys Glu Gln Ile Ser Asn Asp Gly Phe Ile Val Cys Asn Thr
1385 1390 1395
Gln Ser Ala His Ala Leu Glu Glu Ala Lys Asn Ala Ala Val Tyr
1400 1405 1410
Tyr Ala Gln Tyr Leu Cys Lys Pro Ile Leu Ile Leu Asp Gln Ala
1415 1420 1425
Leu Tyr Glu Gln Leu Ile Val Glu Pro Val Ser Lys Ser Val Ile
1430 1435 1440
Asp Lys Val Cys Ser Ile Leu Ser Asn Ile Ile Ser Val Asp Thr
1445 1450 1455
Ala Ala Leu Asn Tyr Lys Ala Gly Thr Leu Arg Asp Ala Leu Leu
1460 1465 1470
Ser Ile Thr Lys Asp Glu Glu Ala Val Asp Met Ala Ile Phe Cys
1475 1480 1485
His Asn His Glu Val Glu Tyr Thr Gly Asp Gly Phe Thr Asn Val
1490 1495 1500
Ile Pro Ser Tyr Gly Met Asp Thr Asp Lys Leu Thr Pro Arg Asp
1505 1510 1515
Arg Gly Phe Leu Ile Asn Ala Asp Ala Ser Ile Ala Asn Leu Arg
1520 1525 1530
Val Lys Asn Ala Pro Pro Val Val Trp Lys Phe Ser Asp Leu Ile
1535 1540 1545
Lys Leu Ser Asp Ser Cys Leu Lys Tyr Leu Ile Ser Ala Thr Val
1550 1555 1560
Lys Ser Gly Gly Arg Phe Phe Ile Thr Lys Ser Gly Ala Lys Gln
1565 1570 1575
Val Ile Ser Cys His Thr Gln Lys Leu Leu Val Glu Lys Lys Ala
1580 1585 1590
Gly

Claims (27)

1.活的减毒的冠状病毒，其包含非结构蛋白质nsp-3中的突变和/或辅助蛋白质3a和/或3b的缺失。
2.根据权利要求1的冠状病毒，其中所述nsp-3中的突变位于腺苷二磷酸-核糖-1’-磷酸酶(ADRP)区域。
3.根据权利要求1或2所述的冠状病毒，其中所述nsp-3基因编码包含选自下组的一个或多个氨基酸突变的蛋白质：
a)SEQ ID NO:6中第373位的Asn(N)至Ala(A)；和
b)SEQ ID NO:6中第379位的Gly(G)至Ser(S)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其中所述nsp-3基因编码包含SEQ IDNO:6中第373位氨基酸突变Asn(N)至Ala(A)的蛋白质。
5.根据权利要求1-3中任一项的冠状病毒，其中所述nsp-3基因编码包含SEQ ID NO:6中第379位氨基酸突变Gly(G)至Ser(S)的蛋白质。
6.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其中所述nsp-3基因包含选自下组的一个或多个核苷酸取代：
a)与SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1116处的A至G和核苷酸位置1117处的A至C；和
b)与SEQ ID NO:5所示的序列相比核苷酸位置1138处的G至A。
7.根据权利要求1所述的冠状病毒，其包含SEQ ID NO:2所示的序列的核苷酸位置37至384的缺失。
8.根据前述权利要求中任一项的冠状病毒，其是传染性支气管炎病毒(IBV)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其为IBV M41。
10.根据权利要求9所述的冠状病毒，其包含S蛋白，其中所述S蛋白的至少部分来自除M41之外的IBV血清型。
11.根据权利要求10所述的冠状病毒，其中S1亚基来自除M41之外的IBV血清型。
12.根据前述权利要求中任一项所述的冠状病毒，其与野生型冠状病毒相比具有降低的致病性，使得当将所述病毒施用于含胚卵(embryonated egg)时，其能够复制而对胚胎不是致病性的。
13.如权利要求1至6中任一项所定义的经修饰的nsp-3基因。
14.由根据权利要求13的经修饰的nsp-3基因编码的蛋白质。
15.质粒，其包含根据权利要求13的经修饰的nsp-3基因或具有辅助蛋白3a和/或3b的缺失的经修饰的基因3。
16.用于制备根据权利要求1至12中任一项所述的冠状病毒的方法，其包括以下步骤：
(i)将根据权利要求15的质粒转染入宿主细胞中；
(ii)用重组病毒感染所述宿主细胞，所述重组病毒包含具有nsp-3基因和/或基因3的冠状病毒株的基因组；
(iii)允许所述质粒中的基因序列和所述重组病毒基因组中的相应序列之间发生同源重组以产生经修饰的基因；并且
(iv)选择包含所述经修饰的基因的重组病毒。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述重组病毒是痘苗病毒。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其还包括以下步骤：
(v)从来自步骤(iv)的重组病毒的DNA中回收包含所述经修饰的基因的重组冠状病毒。
19.能够产生根据权利要求1至12中任一项的冠状病毒的细胞。
20.疫苗，其包含根据权利要求1至12中任一项的冠状病毒和药学可接受载体。
21.用于治疗和/或预防受试者中的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用权利要求20的疫苗的步骤。
22.根据权利要求20的疫苗，其用于治疗和/或预防受试者中的疾病。
23.根据权利要求1至12中任一项的冠状病毒在制备用于治疗和/或预防受试者中的疾病的疫苗中的用途。
24.根据权利要求21、22或23的方法、疫苗或用途，其中所述疾病是传染性支气管炎(IB)。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述施用方法选自下组：滴眼剂施用、鼻内施用、饮用水施用、孵化后注射和卵内注射。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述疫苗接种是卵内疫苗接种。
27.用于制备根据权利要求20的疫苗的方法，其包括用根据权利要求1至12中任一项的冠状病毒感染权利要求19的细胞的步骤。
CN201780006854.2A 2016-01-27 2017-01-26 冠状病毒 Active CN108884447B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1601498.7 2016-01-27
GBGB1601498.7A GB201601498D0 (en) 2016-01-27 2016-01-27 Coronavirus
PCT/GB2017/050192 WO2017129975A1 (en) 2016-01-27 2017-01-26 Attenuated infectious bronchitis virus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108884447A true CN108884447A (zh) 2018-11-23
CN108884447B CN108884447B (zh) 2022-07-26

Family

ID=55535017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780006854.2A Active CN108884447B (zh) 2016-01-27 2017-01-26 冠状病毒

Country Status (17)

Country Link
US (1) US11202825B2 (zh)
EP (1) EP3408381B1 (zh)
JP (1) JP2019503693A (zh)
KR (1) KR20180104088A (zh)
CN (1) CN108884447B (zh)
AU (1) AU2017211507B2 (zh)
BR (1) BR112018015453A2 (zh)
CA (1) CA3012024A1 (zh)
CL (1) CL2018001946A1 (zh)
GB (1) GB201601498D0 (zh)
IL (1) IL259655A (zh)
MX (1) MX2018009008A (zh)
PE (1) PE20190121A1 (zh)
PH (1) PH12018501154A1 (zh)
RU (1) RU2018130683A (zh)
WO (1) WO2017129975A1 (zh)
ZA (1) ZA201803700B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592031A (zh) * 2019-09-25 2019-12-20 华南农业大学 一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用
CN111437384A (zh) * 2020-04-07 2020-07-24 四川骋誉生物制品有限公司 用于预防covid-19的蝙蝠源性冠状病毒疫苗
CN113308440A (zh) * 2021-05-26 2021-08-27 武汉大学 一种n7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗株及其制备方法与应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR102020019867A2 (pt) * 2020-09-28 2022-04-12 Fundacao Univ Estadual Do Ceara Funece Uso da vacina de coronavírus aviário (ibv) como modelo de imunização em mamíferos contra sars-cov 2
JP2024004496A (ja) * 2020-10-14 2024-01-17 一般財団法人阪大微生物病研究会 ノックアウトコロナウイルス
CN114807061A (zh) * 2021-12-22 2022-07-29 华南农业大学 鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株及其制备方法、疫苗

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002092827A2 (en) * 2001-05-17 2002-11-21 Universiteit Utrecht Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5037650A (en) 1988-03-08 1991-08-06 Akzo N.V. Live combination vaccine
NZ507793A (en) 1998-05-01 2003-05-30 Schering Plough Ltd Recombinant virus expressing foreign DNA encoding feline CD80, feline CTLA-4 or feline CD86 and uses thereof
WO2004078203A2 (en) 2003-03-03 2004-09-16 Akzo Nobel N.V. Infectious bronchitis virus with an altered spike gene
RU2253870C1 (ru) 2004-04-26 2005-06-10 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Диагностические системы" РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ АНТИГЕННЫЕ ЭПИТОПЫ БЕЛКОВ КОРОНАВИРУСА (SARS-CoV), СВЯЗАННОГО С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ СИНДРОМОМ, И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ БЕЛКОВ КОРОНАВИРУСА (SARS-CoV), СВЯЗАННОГО С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ СИНДРОМОМ
KR100902510B1 (ko) * 2007-08-27 2009-06-15 삼성전자주식회사 한 개의 스위칭 소자와 한 개의 저항체를 포함하는비휘발성 메모리 장치
GB0911794D0 (en) 2009-07-07 2009-08-19 Animal Health Inst Chimaeric protein

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002092827A2 (en) * 2001-05-17 2002-11-21 Universiteit Utrecht Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PHILLIPS JE.等: "Changes in nonstructural protein 3 are associated with attenuation in avian coronavirus infectious bronchitis virus", 《VIRUS GENES》 *
李永清等: "用冷适应的方法致弱鸡肾型传染性支气管炎病毒 ", 《中国兽医杂志》 *
焦红梅等: "减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究 ", 《病毒学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592031A (zh) * 2019-09-25 2019-12-20 华南农业大学 一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用
CN111437384A (zh) * 2020-04-07 2020-07-24 四川骋誉生物制品有限公司 用于预防covid-19的蝙蝠源性冠状病毒疫苗
CN113308440A (zh) * 2021-05-26 2021-08-27 武汉大学 一种n7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗株及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180104088A (ko) 2018-09-19
AU2017211507B2 (en) 2022-09-29
AU2017211507A1 (en) 2018-06-28
WO2017129975A1 (en) 2017-08-03
CL2018001946A1 (es) 2019-02-15
CA3012024A1 (en) 2017-08-03
BR112018015453A2 (pt) 2018-12-18
GB201601498D0 (en) 2016-03-09
JP2019503693A (ja) 2019-02-14
RU2018130683A (ru) 2020-02-27
MX2018009008A (es) 2018-11-19
PE20190121A1 (es) 2019-01-17
CN108884447B (zh) 2022-07-26
ZA201803700B (en) 2022-12-21
EP3408381B1 (en) 2021-06-23
RU2018130683A3 (zh) 2020-04-21
US20190022214A1 (en) 2019-01-24
EP3408381A1 (en) 2018-12-05
IL259655A (en) 2018-07-31
PH12018501154A1 (en) 2019-01-28
US11202825B2 (en) 2021-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2015293633B2 (en) Coronavirus
CN108884447A (zh) 冠状病毒
CN102574897B (zh) 嵌合蛋白
CN107427570A (zh) 新型罗非鱼病毒及其用途
US10537631B2 (en) Tilapia lake virus vaccines
Mansour et al. Avian paramyxovirus type 1 in Egypt: epidemiology, evolutionary perspective, and vaccine approach
Wang et al. The emerging naturally reassortant strain of IBDV (genotype A2dB3) having segment A from Chinese novel variant strain and segment B from HLJ 0504‐like very virulent strain showed enhanced pathogenicity to three‐yellow chickens
CN104195116B (zh) 一种表达鹅细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其构建方法
CN110438090A (zh) 鳞片脱落疾病(sdd)致病病毒及其衍生物
Munir et al. Emergence of new sub-genotypes of Newcastle disease virus in Pakistan
Kim et al. Development of a highly immunogenic Newcastle disease virus chicken vaccine strain of duck origin
Rimstad Vaccination against infectious pancreatic necrosis
Ameen et al. Genetic changes of S gene during co-inoculation of two infectious bronchitis virus vaccines in SPF chicks
Shakoor et al. Recent trends in immunology and vaccination against Newcastle disease virus
CN106754746A (zh) 禽传染性支气管炎弱毒疫苗株、疫苗及其应用
Zeng et al. Phylogeny and Pathogenicity of Subtype XIIb NDVs from Francolins in Southwestern China and Effective Protection by an Inactivated Vaccine
Go et al. Emergence of Avian Infectious Bronchitis Virus and its Variants Need Better Diagnosis, Prevention and Control Strategies: A Global Perspective" Kuldeep Dhama," Shambhu Dayal Singh," Rajamani Barathidasan,“PA Desingu,“Sandip Chakraborty
kZ TkkS eeeSeeeeSSS SzYkSkS
Perozo et al. Biological and Phylogenetic
Shaw The role of non-structural proteins in bluetongue virus replication

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant