JP2024004496A - ノックアウトコロナウイルス - Google Patents
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Abstract
【課題】通常の細胞では増殖できない一方で、特定の細胞では増殖できる、制限された増殖特性を有するコロナウイルスを提供する。【解決手段】コロナウイルスのゲノムＲＮＡ上で、増殖関連遺伝子の少なくとも一部の機能を喪失しており、前記増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞内での増殖不能及び前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内での増殖能を呈する、ノックアウトコロナウイルス。【選択図】なし
Description
本発明は、制限された増殖特性を有するノックアウトコロナウイルスに関する。
２０１９年に中国武漢で発生した新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を病原体とする感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）は、世界中にてパンデミックを引き起こし、大きな社会問題となっている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス薬及びワクチン開発は世界中で急速に進められている。抗ウイルス薬については、既存薬を転用するアプローチで治療薬が進む一方、新規薬剤を開発する動きも広がっているが、２０２０年１０月現在で日本で承認されている抗ウイルス薬はエボラウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であるレムデシビル（非特許文献１）のみである。しかしながら、ＣＯＶＩＤ－１９による死亡率は依然として高いと報告されている。また、２０２０年１０月現在で承認されているワクチンは、ロシアで承認されたスプートニクＶのみである（非特許文献３）。
THE LANCET, VOLUME 395, ISSUE 10236, 1569-1578 (2020)
THE LANCET, VOLUME 395, ISSUE 10223, 470-473 (2020)
THE LANCET, VOLUME 396, ISSUE 10255, P887-897 (2020)
上述のとおり、現在、承認されているレムデシビルでさえＣＯＶＩＤ－１９の治療薬として決定打とはなっていない。スプートニクＶはまだ臨床試験を実施している段階であり、安全性や有効性には疑問の声も上がっている。また、仮にワクチンの接種が始まったとしても、効果が小さかったり、重い副作用が見つかったりするリスクは依然として存在し、感染症流行抑止の決定打になるかどうかは不明である。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する治療薬及びワクチンにはさらなる選択肢が望まれる。
しかしながら、コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＡＲＳ－ＣｏＶといった他のコロナウイルスと同様、その高い感染性及び病原性から、バイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ－３）病原体として分類されているため、ＢＳＬ－３ラボで処理する必要がある。このバイオセーフティーレベルの高さが、設備上の大きな制約及びコストを必要とし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療薬及び／又はワクチンの研究開発及び製造、並びに抗ウイルス剤スクリーニング等の障害となっている。
また、コロナウイルスの不活化ワクチンは、元のコロナウイルスが有する高い感染性及び病原性を無効化するために厳格な不活化が要求される点で、その作製は容易ではない。さらに、コロナウイルスの弱毒生ワクチンは、元のコロナウイルスが有する高い感染性及び病原性を完全に無くせていること、又は十分に感染性・病原性を低減できていることを証明することは困難である点で、その作製はやはり容易ではない。さらに、弱毒株を単離する等の方法では、今後新興コロナウイルスが出現するたびに時間及びコストをかけて最初から単離を行う必要が生じる。
このように、コロナウイルスに対する治療薬及びワクチンの開発においては、コロナウイルスが生来的に有する高い感染性及び病原性が常に足かせになっている。
そこで本発明は、通常の細胞では増殖できない一方で、特定の細胞では増殖できる、制限された増殖特性を有するコロナウイルスを提供することを目的とする。
本発明者は、鋭意検討の結果、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ上で、増殖関連遺伝子の少なくとも一部の機能を喪失させることで、コロナウイルスに、前記増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞内での増殖不能及び前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内での増殖能を呈する制限された増殖特性を備えさせることが可能であることを見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成された発明である。
すなわち、本発明は以下に掲げる態様の発明を提供する。
項１． コロナウイルスのゲノムＲＮＡ上で、増殖関連遺伝子の少なくとも一部の機能を喪失しており、
前記増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞内での増殖不能及び前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内での増殖能を呈する、ノックアウトコロナウイルス。
項２． 前記増殖関連遺伝子が非構造タンパク質をコードするものである、項１に記載のノックアウトコロナウイルス。
項３． 前記非構造タンパク質がｎｓｐ３である、項１又は２に記載のノックアウトコロナウイルス。
項４． 前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、項１～３のいずれかに記載のノックアウトコロナウイルス。
項５． 項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスを含む、半生ワクチン。
項６． 項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスを、前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内で培養する工程を含む、半生ワクチンの製造方法。
項７． 項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスの不活化ワクチン。
項１． コロナウイルスのゲノムＲＮＡ上で、増殖関連遺伝子の少なくとも一部の機能を喪失しており、
前記増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞内での増殖不能及び前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内での増殖能を呈する、ノックアウトコロナウイルス。
項２． 前記増殖関連遺伝子が非構造タンパク質をコードするものである、項１に記載のノックアウトコロナウイルス。
項３． 前記非構造タンパク質がｎｓｐ３である、項１又は２に記載のノックアウトコロナウイルス。
項４． 前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、項１～３のいずれかに記載のノックアウトコロナウイルス。
項５． 項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスを含む、半生ワクチン。
項６． 項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスを、前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内で培養する工程を含む、半生ワクチンの製造方法。
項７． 項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスの不活化ワクチン。
本発明によれば、通常の細胞では増殖できない一方で、特定の細胞では増殖できる、制限された増殖特性を有するコロナウイルスが提供される。
１．ノックアウトコロナウイルス
本発明のノックアウトコロナウイルスは、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ上で、増殖関連遺伝子の少なくとも一部の機能を喪失しており、前記増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞内での増殖不能及び前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内での増殖能を呈することを特徴とする。
本発明のノックアウトコロナウイルスは、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ上で、増殖関連遺伝子の少なくとも一部の機能を喪失しており、前記増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞内での増殖不能及び前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内での増殖能を呈することを特徴とする。
コロナウイルスは、コロナウイルス科のコロナウイルス亜科に属するウイルスの種であり、ヒトおよび動物に感染し、呼吸器、胃腸、または神経性の疾患を発症させるプラス鎖ＲＮＡウイルスである。コロナウイルスの具体例としては、２００２年に流行した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、２００３年に流行した中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、２０１９年より流行している新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２）等が挙げられ、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。
コロナウイルス及びそのゲノムＲＮＡの構造を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を例に挙げて図１に示す。図１に示すように、コロナウイルスのゲノムＲＮＡは約３０ｋｂからなる。構造タンパク質（Ｓ、Ｅ、Ｍ、Ｎ）をコードする領域は、ゲノムＲＮＡ３’末端から異なる長さで５’末端へ伸長する数本のｍＲＮＡからなり、非構造タンパク質をコードする領域として、５’末端に巨大ＯＲＦ１ａ，ＯＲＦ１ｂと、その間に存在するスードノット（ＰＮ）とを有する。非構造タンパク質は、通常ＯＲＦ１ａの終止コドンで終了するが、２０～３０％の確率で、ＰＮ構造によりフレームシフトが起こり、ＯＲＦ１ａの終止コドンが読まれず、引き続きＯＲＦ１ｂの翻訳へと続き、１ａ＋１ｂ巨大タンパク質ができ上がる。巨大タンパク質は自らが持つプロテアーゼにより、１６種類のタンパク質に開裂される。具体的には、１ａは自らのタンパク質分解酵素であるｎｓｐ３（PL proteases）とｎｓｐ５（3CL）によりｎｓｐ１からｎｓｐ１１までの非構造タンパク質に開裂し、１ａ＋１ｂはｎｓｐ１～１０に加えｎｓｐ１２～１６までの非構造タンパク質に翻訳中又は翻訳後に開裂する。
増殖関連遺伝子としては、ウイルス増殖に必須の遺伝子であればよい。増殖関連遺伝子の例としては、非構造タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、より好ましくは、ｎｓｐ３をコードする遺伝子が挙げられる。非構造タンパク質及びそれをコードする遺伝子の配列は、公式のデータベース等から入手することができる。
「増殖関連遺伝子の機能の少なくとも一部を喪失させる」とは、増殖関連遺伝子の機能を完全に失わせる（機能を喪失させる）ことの意味に加えて、増殖関連遺伝子の機能が野生型と比較してＢＳＬを低下させる程度に低下している状態にする（機能の一部を喪失させる）ことの意味をも含む概念であり、好ましくは、増殖関連遺伝子の機能を完全に失わせる（機能を喪失させる）ことの意味である。増殖関連遺伝子の機能を喪失させるための手段としては、単純に遺伝子を破壊する、欠失させる、遺伝子に変異を導入して翻訳の段階で読み枠（ＯＲＦ）がずれるように操作する、等の塩基配列の改変を施すことが挙げられる。図２に、遺伝子を欠失させる場合の例を挙げる。図２の例では、増殖関連遺伝子領域の両端部分の配列（図示された態様では１０アミノ酸ずつ）を野生型のまま残し、その間の配列を、増殖関連遺伝子とは無関係の配列（図示された態様では２２アミノ酸からなる配列）に置換することで、増殖関連遺伝子を欠失させている。
本発明のノックアウトコロナウイルスの増殖特性を説明する図を図３に示す。図３では、ｎｓｐ３遺伝子を欠失させた（Δｎｓｐ３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Δｎｓｐ３）を例に挙げて示している。図３に示すように、前記の増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞内では増殖能を有さず、且つ、前記の増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内では増殖能を有するという増殖特性を持つ。増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞としては、コロナウイルスによる感染症の発症防止を必要とする、ヒト及びヒト以外の動物の細胞（より具体的には通常の培養細胞等）が挙げられる。本発明のノックアウトコロナウイルスは、これら増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞に感染しても増殖しないため、安全であり、取り扱いのバイオセーフティレベルを引き下げることも可能となる。結果として、研究開発及び／又はワクチン製造等のコストを大幅に小さくすることができる。一方、増殖関連遺伝子を含む宿主細胞としては、人工的に当該増殖関連遺伝子を補った細胞が挙げられ、より具体的には、当該増殖関連遺伝子を安定発現した細胞、及び当該増殖関連遺伝子を一過性発現させた細胞も含む。
本発明のノックアウトコロナウイルスの製造方法としては、特に限定されないが、好ましくは、培養細胞を用いた人工合成法が挙げられる。
培養細胞を用いた人工合成法においては、まず、ノックアウトコロナウイルスゲノムプラスミドを作製する。具体的には、コロナウイルスゲノムのｃＤＮＡをプラスミド上にクローニングし、増殖関連遺伝子の少なくとも一部の機能を喪失するような塩基配列の改変を導入する。クローニングおよび塩基配列の改変は、当業者に公知の方法を適宜用いればよい。プラスミドベクターとしては特に限定されず、公知のものを用いることができる。続いて、宿主細胞に上記のゲノムプラスミドをトランスフェクションし、組換えウイルスを発現させる。トランスフェクションの方法としても特に限定されず、公知の方法を用いることがでる。宿主については、上記で図３を参照して説明した、増殖関連遺伝子を含む宿主細胞を用いる。
続いて、発現した組換えウイルスを培養細胞に添加して、組換えウイルスを大量発現させることができる。その際に用いる培養細胞としては、上記で図３を参照して説明した、増殖関連遺伝子を含む宿主細胞が挙げられる。ウイルスの回収は、遠心分離及び膜ろ過など、公知の方法により行うことができる。
２．ワクチン
上述のノックアウトコロナウイルスは、ノックアウトした増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞に感染しても増殖しないため、病原性が著しく低下していることが期待できる。そのため、ノックアウトコロナウイルスを生体に感染させることで半生ワクチンとして使用することができる。また、当該ノックアウトコロナウイルスは、増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞に対する病原性の低さから、病原性の高いウイルスを培養及び製造する際に生じる暴露リスクを回避することができる。さらに、当該ノックアウトコロナウイルスは、、増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞に対する病原性の低さから、病原性の高いウイルスから不活化ワクチンを製造する際に生じる生残ウイルスのリスクを回避することもできる。
上述のノックアウトコロナウイルスは、ノックアウトした増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞に感染しても増殖しないため、病原性が著しく低下していることが期待できる。そのため、ノックアウトコロナウイルスを生体に感染させることで半生ワクチンとして使用することができる。また、当該ノックアウトコロナウイルスは、増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞に対する病原性の低さから、病原性の高いウイルスを培養及び製造する際に生じる暴露リスクを回避することができる。さらに、当該ノックアウトコロナウイルスは、、増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞に対する病原性の低さから、病原性の高いウイルスから不活化ワクチンを製造する際に生じる生残ウイルスのリスクを回避することもできる。
従って、本発明は、上記のノックアウトコロナウイルスを用いたワクチンも提供する。本発明のワクチンには、上記のノックアウトコロナウイルスを含む半生ワクチンと、上記のノックアウトコロナウイルスの不活化ワクチンとを含む。
本発明のワクチンには、上記のノックアウトコロナウイルスの他に、目的及び用途等に応じて、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤等の他の成分を含むことができる。
緩衝剤の例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール等が挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤の例としては、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸、抗生物質、合成抗菌剤等が挙げられる。抗酸化剤の例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
上記の成分の他にも、本発明のワクチンには、光吸収色素(リボフラビン、アデニン、アデノシン等)、安定化剤（キレート剤、還元剤等)、炭水化物(ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、シュークロース、グルコース、デキストラン等)、カゼイン消化物、各種ビタミン、矯臭剤等を含むこともできる。
なお、半生ワクチンの製造方法は、ノックアウトコロナウイルスを、前記の増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内で培養する工程を含む。増殖関連遺伝子を含む宿主細胞については、上記「１．ノックアウトコロナウイルス」において図３を参照して説明した通りである。
また、不活化ワクチンの製造方法は、前記の増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内で培養する工程と、培養されたノックアウトコロナウイルスを不活化する工程とを含む。ノックアウトコロナウイルスの不活化は、公知のウイルス不活化方法に基づいて行えばよい。ウイルス不活方法としては、ウイルス培養液に対し、物理的処理(紫外線照射、X線照射、熱処理、超音波処理等)、化学的処理(ホルマリン、クロロホルム、βプロピオラクトン等による有機溶媒処理；酢酸等の弱酸による酸処理；アルコール、塩素、水銀等による処理等)等が挙げられる。ノックアウトコロナウイルスが安全なウイルスであるため、不活化の条件をより温和にすることも可能であり、これによって、抗原性を保ち効果の高い不活化ワクチンを得ることも可能である。
また、不活化ワクチンには、公知のアジュバントをさらに含むこともできる。このようなアジュバントとしては、例えば、動物油(スクアレン等)又はそれらの硬化油；植物油(パーム油、ヒマシ油等)又はそれらの硬化油；無水マンニトール・オレイン酸エステル、流動パラフィン、ポリブテン、カプリル酸、オレイン酸、高級脂肪酸エステル等を含む油性アジュバント；PCPP、サポニン、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸マンガン、可溶性酢酸アルミウム、サリチル酸アルミニウム、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、無水マレイン酸コポリマー、アルケニル誘導体ポリマー、水中油型エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質等の水溶性アジュバント；水酸化アルミニウム(ミョウバン)、水酸化ナトリウム等の沈降性アジュバント；コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの微生物由来毒素成分；その他の成分（ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキン等）が挙げられる。
さらに、本発明のワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９以外の他の疾患を発症する他の微生物に対する１又は複数のワクチン抗原を更に配合したワクチン（混合ワクチン）であってもよい。
本発明のワクチンの剤型については特に限定されず、投与方法及び保存条件等に基づいて適宜決定することができる。剤型の具体例としては、液体製剤及び固体製剤等が挙げられ、より具体的には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、噴霧剤等の非経口投与剤が挙げられる。
本発明のワクチンの投与方法としては特に限定されず、筋肉、腹腔内、皮内及び皮下等の注射投与、鼻腔及び口腔からの吸入投与、並びに経口投与等のいずれであってもよい。
本発明のワクチンの適用対象としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染によりＣＯ
ＶＩＤ－１９症状を引き起こしうる対象であれば特に限定されず、例えば哺乳類が挙げられ、より具体的には、ヒト；イヌ及びネコ等の愛玩動物；ネズミ、マウス、ハムスター等の実験動物等が挙げられる。
ＶＩＤ－１９症状を引き起こしうる対象であれば特に限定されず、例えば哺乳類が挙げられ、より具体的には、ヒト；イヌ及びネコ等の愛玩動物；ネズミ、マウス、ハムスター等の実験動物等が挙げられる。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例：SARS-CoVレプリコン非構造蛋白質欠失ライブラリを用いたトランス相補テスト
本試験例では、ウイルスの増殖性を、レプリコンを用いて確認した。具体的には、完全長のゲノムcDNAをクローニングし、細胞に導入するとウイルス粒子を生じる感染性クローンプラスミドの代わりに、構造蛋白質のコード領域をレポーター遺伝子で置換したレプリコンクローンプラスミドを用いた。野生型レプリコンクローンを細胞に導入するとウイルス粒子を生じず、レプリコンRNAの複製のみが起きる。複製が起きているか否かはレポーター遺伝子の発現によりモニターすることができる。
本試験例では、ウイルスの増殖性を、レプリコンを用いて確認した。具体的には、完全長のゲノムcDNAをクローニングし、細胞に導入するとウイルス粒子を生じる感染性クローンプラスミドの代わりに、構造蛋白質のコード領域をレポーター遺伝子で置換したレプリコンクローンプラスミドを用いた。野生型レプリコンクローンを細胞に導入するとウイルス粒子を生じず、レプリコンRNAの複製のみが起きる。複製が起きているか否かはレポーター遺伝子の発現によりモニターすることができる。
（１）材料
・293T 細胞
・Renilla-Glo luciferase assay system (Promega)
・pBAC-SARS-Rep-wt 野生型レプリコン cDNAクローンプラスミド; Renilla luciferase レポーター付き (J. Virol. 86, 11128 － 11137 (2012))
・pBAC-SARS-RepΔnsp3 ほか、pBAC-SARS-Rep-wt のnsp コード領域欠失バリアント群
・pLVX-nsp3 ほか、nsp発現プラスミド; pLVX-EF1α-IRES-Puro (Clonetech) に nsp1-16 をクローニングしたもの
・GFP発現プラスミド; pLVX-EF1alpha-eGFP-2xStrep-IRES-Puro (pLVX-EF1α-IRES-Puro にGFP をクローニングしたもの (Nature 583, 459 - 468 (2020))
・Polyethylenimine "Max"（Polyscience）説明書に従って調製した1 mg/mL 水溶液(PEI)。
・Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific)
・293T 細胞
・Renilla-Glo luciferase assay system (Promega)
・pBAC-SARS-Rep-wt 野生型レプリコン cDNAクローンプラスミド; Renilla luciferase レポーター付き (J. Virol. 86, 11128 － 11137 (2012))
・pBAC-SARS-RepΔnsp3 ほか、pBAC-SARS-Rep-wt のnsp コード領域欠失バリアント群
・pLVX-nsp3 ほか、nsp発現プラスミド; pLVX-EF1α-IRES-Puro (Clonetech) に nsp1-16 をクローニングしたもの
・GFP発現プラスミド; pLVX-EF1alpha-eGFP-2xStrep-IRES-Puro (pLVX-EF1α-IRES-Puro にGFP をクローニングしたもの (Nature 583, 459 - 468 (2020))
・Polyethylenimine "Max"（Polyscience）説明書に従って調製した1 mg/mL 水溶液(PEI)。
・Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific)
（２）方法
１．293T を 4 x 105/well の濃度で 24 well plate に播種し、37℃ 5% CO2、終夜培養した。
２．ウェルあたり、nsp欠失レプリコンプラスミド又は野生型レプリコンプラスミド250 ng, nspあるいはGFP発現プラスミド 250 ng, PEI 1.5 mg/opti-MEM 0.05 mL を加えた。
nsp1-10,14の欠失レプリコンプラスミドでは、nsp1-10,14それぞれのコード領域のN末端及びC末端の10アミノ酸を残し、両端の10アミノ酸の間を、22アミノ酸（GGSGGGSSYSLESIGTSGGGSG）で置換することで、nsp1-10,14コード領域の機能を失わせた（図２参照）。また、nsp12欠失レプリコンプラスミドでは、nsp12コード領域のN末端の45アミノ酸及びC末端の10アミノ酸を残し、それらアミノ酸の間を、22アミノ酸（GGSGGGSSYSLESIGTSGGGSG）で置換することで、nsp12コード領域の機能を失わせた。
１．293T を 4 x 105/well の濃度で 24 well plate に播種し、37℃ 5% CO2、終夜培養した。
２．ウェルあたり、nsp欠失レプリコンプラスミド又は野生型レプリコンプラスミド250 ng, nspあるいはGFP発現プラスミド 250 ng, PEI 1.5 mg/opti-MEM 0.05 mL を加えた。
nsp1-10,14の欠失レプリコンプラスミドでは、nsp1-10,14それぞれのコード領域のN末端及びC末端の10アミノ酸を残し、両端の10アミノ酸の間を、22アミノ酸（GGSGGGSSYSLESIGTSGGGSG）で置換することで、nsp1-10,14コード領域の機能を失わせた（図２参照）。また、nsp12欠失レプリコンプラスミドでは、nsp12コード領域のN末端の45アミノ酸及びC末端の10アミノ酸を残し、それらアミノ酸の間を、22アミノ酸（GGSGGGSSYSLESIGTSGGGSG）で置換することで、nsp12コード領域の機能を失わせた。
３．48時間培養後、培地を取り除いた。
４．ウェル当たり 0.5 mL PBS + 0.1% Triton X-100 を加え、室温、3 分間振盪した。
５．0.005 mL のライセートと、0.005 mL の Renilla-Glo Luciferase Reagent を混合し、ルミノメーターで発光を測定した。
４．ウェル当たり 0.5 mL PBS + 0.1% Triton X-100 を加え、室温、3 分間振盪した。
５．0.005 mL のライセートと、0.005 mL の Renilla-Glo Luciferase Reagent を混合し、ルミノメーターで発光を測定した。
（３）結果
野生型レプリコンプラスミドとGFP発現プラスミドを用いた場合の発光を1とした相対値の、平均値及び標準偏差 (n = 3)を図４に示す。図４に示す通り、nsp3欠失レプリコンプラスミドについて、nsp3を発現プラスミドを細胞に導入した場合のみルシフェラーゼ活性が認められ、制限されたレプリコンの複製が達成されていることが示唆された。これより、nsp3の機能をノックアウトさせたコロナウイルスは、制限された増殖特性を有することが示唆された。
野生型レプリコンプラスミドとGFP発現プラスミドを用いた場合の発光を1とした相対値の、平均値及び標準偏差 (n = 3)を図４に示す。図４に示す通り、nsp3欠失レプリコンプラスミドについて、nsp3を発現プラスミドを細胞に導入した場合のみルシフェラーゼ活性が認められ、制限されたレプリコンの複製が達成されていることが示唆された。これより、nsp3の機能をノックアウトさせたコロナウイルスは、制限された増殖特性を有することが示唆された。
Claims (7)
- コロナウイルスのゲノムＲＮＡ上で、増殖関連遺伝子の少なくとも一部の機能を喪失しており、
前記増殖関連遺伝子を含まない宿主細胞内での増殖不能及び前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内での増殖能を呈する、ノックアウトコロナウイルス。 - 前記増殖関連遺伝子が非構造タンパク質をコードするものである、請求項１に記載のノックアウトコロナウイルス。
- 前記非構造タンパク質がｎｓｐ３である、請求項１又は２に記載のノックアウトコロナウイルス。
- 前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１～３のいずれかに記載のノックアウトコロナウイルス。
- 請求項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスを含む、半生ワクチン。
- 請求項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスを、前記増殖関連遺伝子を含む宿主細胞内で培養する工程を含む、半生ワクチンの製造方法。
- 請求項１～４のいずれかのノックアウトコロナウイルスの不活化ワクチン。
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